EIF4A3 shRNA 慢病毒載體的構建及其穩定轉染細胞系的建立

［摘 要］ 目的：構建真核細胞翻譯起始因子4A3（EIF4A3） -短發夾RNA（shRNA） 慢病毒載體，建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA穩定轉染細胞系。方法：通過美國國家生物技術信息中心 （NCBI） 數據庫檢索EIF4A3 基因序列，設計并合成PCR 鑒定引物，并將其連接至經EcoR Ⅰ和Age Ⅰ酶切的慢病毒GV493 載體， 構建GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒質粒， PCR 篩選陽性克隆并測序鑒定。將GV493 空載質粒和GV493-EIF4A3-shRNA 重組質粒分別轉染至HEK293T 細胞中，分別為GV493 對照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒， 轉染48 h 后收集慢病毒進行包裝并測定病毒滴度。將Neuro-2a 細胞分為空白組、GV493 對照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組，空白組不作處理，GV493 對照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組分別采用相應慢病毒感染Neuro-2a 細胞， 慢病毒感染復數（MOI）為100，使用10 mg·L－1嘌呤霉素篩選成功感染慢病毒的Neuro-2a 細胞，熒光顯微鏡觀察各組Neuro-2a細胞的生長狀態和綠色熒光表達情況；實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法檢測各組 Neuro-2a細胞中 EIF4A3 mRNA 及蛋白表達水平。結果：PCR 測序結果顯示 GV493-EIF4A3-shRNA 重組質粒基因序列與設計合成的EIF4A3-shRNA 序列一致，成功構建GV493-EIF4A3 慢病毒載體。熒光顯微鏡觀察可見HEK293T 細胞熒光表達強烈，生長狀態良好，慢病毒包裝成功。GV493-對照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒的滴度均為2×108 TU·mL－1，GV493 對照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細胞生長狀態良好且表達綠色熒光，表明慢病毒感染穩定細胞系構建成功。RT-qPCR 法， 與空白組和GV493 對照組比較， GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細胞EIF4A3mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting 法，各組在相對分子質量49 000 處出現特異性條帶，提示Neuro-2a 細胞中EIF4A3 蛋白表達成功；與空白組和GV493 對照組比較，GV493-EIF4A3shRNA 組 Neuro-2a 細胞中 EIF4A3 蛋白表達水平明顯降低 （Plt;0. 01）。結論：成功構建 GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒載體，建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA 穩定轉染細胞系，為EIF4A3 在顱內動脈粥樣硬化的作用機制研究提供了參考。

［關鍵詞］ 真核細胞翻譯起始因子4A3； 短發夾RNA； 慢病毒； 穩定轉染細胞系； Neuro-2a 細胞

［中圖分類號］ R392 ［文獻標志碼］ A

真核細胞翻譯起始因子4A （eukaryotictranslation initiation factor 4A，EIF4A） 3 蛋白屬于廣泛的DEAD box RNA 解旋酶家族， 其成員憑借其RNA 結合能力和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP） 酶活性參與RNA 代謝的多個方面。EIF4A 蛋白主要有3 個類型， EIF4A1 和EIF4A2 主要在脊椎動物細胞質中表達， 而EIF4A3 則主要定位于細胞核。盡管3 個類型高度相似，但在mRNA 的生命周期中具有不同的作用，其特殊和多樣的功能常被相互作用的伴侶蛋白調節及支配［1］。EIF4A1 和EIF4A2 均參與翻譯的起始過程。EIF4A3 蛋白在RNA 代謝中起重要作用，包括mRNA 定位、導出及 mRNA 剪接和翻譯的偶聯［2-4］。EIF4A3 與EIF4A1 和EIF4A2 具有相同的ATP 酶活性，但EIF4A3 自身無解旋酶活性，也不參與翻譯的啟動［5］。EIF4A3 在多種人類惡性腫瘤中表達。研究［6］ 顯示：EIF4A3 刺激環狀二磷酸腺苷核糖基化因子鳥苷酸激酶1 （circ adenosinediphosphate ribosylation factor guanylate kinase 1，ASAP1） 表達， 通過細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 信號通路促進膠質母細胞瘤的發展。在肝細胞癌中，EIF4A3 沉默抑制細胞增殖、遷移和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）［7-8］。研究［9］ 顯示：在上皮性卵巢癌細胞中，EIF4A3 結合癌易感性候選基因2（cancer susceptibility candidate 2，CASC2） 增強細胞活性和細胞凋亡、遷移及侵襲，EIF4A3 敲低會增加細胞凋亡。在宮頸癌中，人類環狀RNA （human_circ RNA，hsa_circ）_0101119 可促進細胞增殖、遷移和侵襲，并通過與EIF4A3 相互作用抑制宮頸癌的細胞凋亡，以抑制轉錄延伸因子A 樣蛋白6 （transcription elongation factor A like 6，TCEAL6） 表達［10-11］。在心血管疾病方面，EIF4A3誘導的環狀 B 淋巴細胞瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2） /腺病毒 E1B 19 kDa 結合蛋白3 （Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3），通過非編碼單鏈微小RNA （micro RNA，miR）-27a-3p/BNIP3 通路加劇低氧誘導的心肌細胞損傷［12］。研究［13］ 顯示： hsa_circ_0030042 通過抑制EIF4A3 與重組人自噬效應蛋白1 （recombinanthuman autophagy-related protein， Beclin 1） 和人叉頭框蛋白O1 （human forkhead Box protein O1，FOXO1） 結合，加劇小鼠斑塊的不穩定性。研究［14］證實：EIF4A3 誘導的環狀RNA （circ RNA，circ）_0086296 通過miR-576-3p/干擾素誘導蛋白與四肽重復1 （interferon induced protein with tetratricopeptiderepeats 1， IFIT1） /信號轉導與轉錄激活因子1（signal transduction and activator of transcription 1，STAT1） 反饋回路增強人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells， hUVECs）的動脈粥樣硬化病變表型。但目前EIF4A3 在顱內動脈粥樣硬化中的作用機制尚不明確。本研究構建EIF4A3-短發夾RNA （short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體， 建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA 穩定轉染細胞系，為探討 EIF4A3 在顱內動脈粥樣硬化中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器

小鼠神經瘤母細胞系（Neuro-2a） 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，人胚腎細胞（HEK293T） 購自中國科學院上海細胞所。慢病毒載體質粒GV493 （hU6-MCS-CBhgcGFP-IRES-puromycin）、輔助質粒Helper1. 0 和輔助質粒Helper2. 0 均由上海吉凱基因公司提供，大腸桿菌菌株DH5α 購自北京Solarbio 公司， 限制性核酸內切酶EcoR Ⅰ 和Age Ⅰ 購自美國NEB 公司， Taq 聚合酶購自北京SinoBio 公司， 一步法克隆試劑盒購自美國Vazyme 公司，反轉錄試劑盒購自北京TaKaRa Bio 公司， Lipofectamine 2000 和TRIzol 購自美國Invitrogen 公司， 實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）染料預混液購自北京GenStar 公司， BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司，DMEM、MEM 和Opti-MEN 培養基購自美國Gibco 公司，膠回收試劑盒、50×TAE 和質粒抽提試劑盒由北京TIANGEN 公司提供，胰蛋白胨、瓊脂糖粉、酵母提取物和氯化鈉購自美國Vetec 公司，抗EIF4A3 抗體和抗GAPDH 抗體均購自英國Abcam 公司。倒置光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司， 熒光定量PCR 儀購自瑞士Roche 公司， 電泳儀購自美國Bio-Rad 公司， 化學發光檢測儀購自美國Azure Biosystems 公司。

1. 2 細 胞 培 養

HEK293T 細 胞 常 規 培 養 于DMEM 培養基（含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素）， Neuro-2a 細胞培養于MEM 培養基（含10%胎牛血清和1% 青-鏈霉素）， 置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，隔2～3 d 即可傳代1 次，細胞狀態良好且密度大于90% 時用0. 25% 胰蛋白酶消化傳代。

1. 3 引物設計和合成

通過美國國家生物技術信息中心（National Center for BiotechnologyInformation， NCBI） 數據庫檢索EIF4A3 （GeneID： 9775） 序列， 結合引物設計原則和載體GV493 閱讀框克隆位點， 設計引物。設計并合成EIF4A3 PCR 鑒定引物， 引物序列： 上游引物，5'-ATGGAAATTTGATACTCTATG-3'， 下游引物， 5'-CATAGAGTATCAAATTTCCAT-3'。設計并合成EIF4A3 RT-qPCR引物，引物序列：上游引物，5'-GACCAAAGTGGAGTTCGAGACG-3'，下游引物，5'-TGATAGCACGCTGCTGAATCGC-3'。引物均由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。

1. 4 EIF4A3慢病毒載體構建及鑒定

合成的基因引物經PCR 擴增，獲得DNA 片段。PCR 擴增反應體系（50 μL）： 上下游引物（10 μmol·L－ 1） 各1 μL，DNA 模板1 μL，2. 5 mmol·L－1 dNTP 4 μL，5×Buffer 10 μL， Prime STAR HS DNApolymerase 0. 5 μL， ddH2O 50 μL。 擴增程序：98 ℃，5 min；98 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，90 s，共30 個循環，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

采用EcoR Ⅰ和Age Ⅰ限制性內切酶對GV493進行酶切。酶切體系（50 μL） 為10×酶緩沖液 5 μL，GV493 DNA 2 μL， EcoR Ⅰ 1 μL， Age Ⅰ 1 μL，ddH2O 加入總體積50 μL， 吹打、混勻和離心后，在37 ℃下反應3 h 后過夜。采用酶切回收試劑盒初膠回收GV493 載體質粒。

采用一步法克隆試劑盒將PCR 擴增的EIF4A3引物連接至攜gcGFP/Puromycin 的慢病毒GV493載體，重組后載體見圖1。反應體系（10 μL）：5×酶緩沖液 2 μL，酶切GV493 DNA 2. 5 μL，純化的擴增產物片段1 μL，外切酶Ⅱ 1 μL，總體積10 μL加入ddH2O；吹打離心后，在37 ℃下反應30 min，冰浴冷卻5 min。

將10 μL GV493 空質粒和GV493-EIF4A3shRNA 重組質粒分別加入100 μL 感受態細胞DH5α中， 混合均勻； 冰上反應30 min， 42 ℃ 熱激1. 5 min， 冰浴2 min； 37 ℃ 搖床培養60 min， 含500 μL LB 液。取培養后的菌液適量，均勻涂布于含100 mg·L－1 氨芐西林的LB 培養板上，倒置培養板37 ℃恒溫培養12 h；次日，在平板上培養菌落，在含有100 mg·L－1 氨芐西林的3 mL LB 培養基搖床上取適量的細菌， 37 ℃搖床過夜， 吸附適量的細菌溶液， 并用甘油保菌， 其余的細菌溶液經PCR 和酶切鑒定。鑒定體系（20 μL）： 2×Taq 聚合酶10 μL，擴增鑒定上游引物（10 μmo·l L－1） 0. 4 μL，擴增鑒定下游引物（10 μmol·L－1） 0. 4 μL， 適量甘油菌液，加入ddH2O 至總體積為20 μL，反應程序： 94 ℃ 變性3 min， 94 ℃ 、30 s， 55 ℃ 、30 s，72 ℃、30 s， 共22 個循環， 72 ℃延伸5 min， 4 ℃保存。如在基因片段57 bp 附近出現條帶，則表明該重組菌是攜帶重組GV493-EIF4A3 shRNA 的陽性菌。對鑒定出的陽性菌進行克隆，送生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序。測序成功，則可用于后續實驗。

1. 5 EIF4A3慢病毒包裝及滴度測定

轉染前1 d，將生長狀況良好的HEK293T 細胞接種于100 mm細胞培養皿中，37 ℃、5% CO2 孵箱培養。當細胞密度達到80% 時，采用EIF4A3 慢病毒轉染細胞。轉染體系分為Mixture A 和Mixture B。Mixture A：10 μg GV493 空載質粒或GV493-EIF4A3-shRNA重組質粒+5 μg 輔助質粒Helper 1. 0 型+5 μg 輔助質粒Helper 2. 0 型+750 μL Opti-MEM；Mixture B：15 μL Lipofactamine 2000+750 μL Opti-MEM。Mixture A 和Mixture B 體系各自混勻，室溫避光放置5 min，后2 個體系相互混勻，室溫孵育20 min。將Mixture A 和Mixture B 的混合物加入 3 mLOpti-MEM 至100 mm 培養皿中， 輕輕搖動混合，在37 ℃的細胞培養箱中培養4 h。待轉染結束后，將100 mm 培養皿中的培養液更換為正常生長的培養液，培養48 h。在熒光顯微鏡下，當細胞轉染效率約90% 時， 收集培養皿上清液， 采用0. 45 μm濾膜過濾，低溫超高速離心法去除上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 溶解沉淀。GV493 空載質粒轉染后收集的慢病毒為GV493 對照慢病毒， GV493-EIF4A3 shRNA 重組質粒轉染后收集的慢病毒為GV493-EIF4A3shRNA 慢病毒，將收集的病毒溶液進行滴度測定。

慢病毒滴度測定前1 d，將HEK293T 細胞鋪入96 孔細胞培養板，每孔4×104個細胞。分別在3 個EP 管中采用90 μL 無血清培養基培養病毒， 分別標記為1E+1 μL 組（含10 μL 病毒溶液）、1E+0 μL 組（1E-1 μL 組病毒溶液10 倍稀釋） 和1E-1 μL 組（1E+0 μL 組病毒溶液10 倍稀釋）。熒光顯微鏡下觀察病毒轉染后HEK293T 細胞熒光表達情況。

1. 6 EIF4A3 shRNA慢病毒感染 Neuro-2a細胞及穩定轉染細胞系構建

將 Neuro-2a細胞鋪于 12孔細胞培養板，待細胞密度達到70%～80% 時，按最佳慢病毒感染復數（multiplicity of infection，MOI）為100， 取相應病毒量進行慢病毒感染實驗。將Neuro-2a 細胞分為空白組、GV493 對照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組。空白組不做處理，GV493 對照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組分別采用GV493 對照慢病毒和GV493-EIF4A3 shRNA 慢病毒感染Neuro-2a 細胞，慢病毒感染24 h 后換液，繼續培養48 h， 加入嘌呤霉素（10 mg·L－1） 進行篩選，1 d后換液，之后維持嘌呤霉素濃度在5 mg·L－1，培養2 周。在熒光顯微鏡下觀察Neuro-2a 細胞，若細胞生長狀態良好且表達綠色熒光，則提示慢病毒感染穩定細胞系構建成功。

1. 7 RT-qPCR 法 檢 測 各 組 Neuro-2a 細 胞 中EIF4A3 mRNA表達水平

采用TRIzol法提取各組RNA，測純度和濃度后，取1 000 ng RNA 逆轉錄合成cDNA。采用2×增強型染料RT-qPCR 預混液進行RT-qPCR 法檢測， EIF4A3 PCR 引物： 上游引物，5'-GACCAAAGTGGAGTTCGAGACG-3'；下游引物，5'-TGATAGCACGCTGCTGAATCGC-3'。反應體系（10 μL）： 染料預混液5 μL， PCR 引物（10 μmol·L－1） 0. 2 μL， cDNA 1 μL， 加ddH2O 至10 μL。擴增條件： 95 ℃ 、10 s， 55 ℃ 、20 s，72 ℃、15 s，共40 個循環。溶解條件：65 ℃、60 s，95 ℃、1 s。以GAPDH 為內參，采用2—△△Ct法計算各組Neuro-2a 細胞中EIF4A3 mRNA 表達水平。

1. 8 Western blotting法檢測各組Neuro-2a細胞中EIF4A3 蛋白表達水平

收集各組 Neuro-2a細胞，采用BCA 法進行蛋白定量， 恒壓60 V、30 min，恒壓100 V、90 min 電泳。采用濕法轉膜，轉膜條件為恒壓100 V 、90 min。快速封閉液封閉膜30 min， 用TBST 溶液清洗膜3 次， 每次10 min。加入一抗，4 ℃孵育過夜，第2 天回收一抗，洗膜3 次， 二抗室溫孵育60 min， 洗膜3 次， 采用化學發光試劑顯影。于相對分子質量49 000 處出現一條特異性條帶，表明EIF4A3 蛋白在Neuro-2a 細胞中成功表達。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 9 統計學分析

采用 Graphpad Prism 6. 0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中EIF4A3 mRNA和蛋白表達水平符合正態分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 EIF4A3 shRNA 慢病毒載體的構建

將測序成功的DNA 序列與設計的EIF4A3 序列比較， 二者DNA 序列完全匹配， 表明EIF4A3 序列成功連接至GV493 載體中， 測序結果提示成功構建GV493-EIF4A3 慢病毒載體。見圖2。

2. 2 EIF4A3 shRNA慢病毒感染 Neuro-2a細胞并建 立 穩 定 轉 染 細 胞 系

將 GV493 空 載 質 粒 和GV493-EIF4A3 shRNA 重組質粒分別與輔助質粒共同轉染HEK293T 細胞，熒光顯微鏡下觀察可見HEK293T 細胞熒光表達強烈，生長狀態良好，慢病毒包裝成功。見圖3 和4。GV493 對照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒滴度均為2×108 TU·mL－1。熒光顯微鏡下觀察可見GV493 對照組和GV493-EIF4A3 shRNA組Neuro-2a 細胞生長狀態良好且表達綠色熒光，表明慢病毒感染穩定細胞系構建成功。見圖5。

2. 3 各組 Neuro-2a細胞中 EIF4A3 mRNA表達水平

與空白組（1. 00±0. 09） 和GV493 對照組（0. 78±0. 08） 比 較， GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細胞中EIF4A3 mRNA 表達水平（0. 49±0. 10） 明顯降低（Plt;0. 01）。

2. 4 各組 Neuro-2a 細胞中 EIF4A3 蛋白表達水平

Western blotting 法檢測結果顯示：各組在相對分子質量49 000處均出現特異性條帶，提示Neuro-2a細胞中EIF4A3 蛋白表達成功。與空白組（1. 05±0. 11） 和 GV493 對照組 （0. 78±0. 07） 比 較，GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細胞中EIF4A3蛋白表達水平（0. 35±0. 09） 明顯降低（Plt;0. 01）。見圖6。

3 討 論

顱內動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的一部分，可引起暫時性腦缺血發作、腦卒中和血管性癡呆等腦血管疾病。盡管不同部位的動脈粥樣硬化病變程度并不平行，但晚期顱內動脈粥樣硬化的病變程度與顱外動脈粥樣硬化的病變程度相似［15］。顱內動脈粥樣硬化是一種終生全身性和進行性疾病，是全世界缺血性卒中發生的主要原因。顱內動脈粥樣硬化的發生發展涉及內皮功能障礙、炎癥、氧化應激和細胞凋亡等多種機制［16］。

研究［17-18］ 顯示：EIF4A3 與動脈粥樣硬化疾病的發生發展密切關聯。hsa_circ_0030042 通過靶向EIF4A3 調節異常自噬并保護動脈粥樣硬化斑塊穩定性［13］。環狀泛素特異性肽酶9×-連鎖基因（circubiquitinspecific peptidase 9×-linked gene， circ-USP9×） 可與細胞質中的EIF4A3 蛋白結合， 并與其相互作用。此外， EIF4A3 的過表達消除了circ-USP9× 敲低誘導的氧化修飾低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， ox-LDL） 處理的hUVECs 焦亡。研究［17］ 顯示：circ-USP9×通過海綿作用抑制EIF4A3 的功能從而促進內皮細胞焦亡。細胞焦亡是一種炎癥性細胞死亡。與細胞凋亡和壞死不同，細胞焦亡的特征是細胞膜破裂，導致細胞內容物釋放，從而激活炎癥反應。內皮焦亡也是動脈粥樣硬化的重要病理機制［18］。研究［15］ 證實： EIF4A3 蛋白誘導的circ_0086296 通過miR-576-3p/IFIT1/STAT1 通路反饋回路加重了hUVECs 的動脈粥樣硬化病變表型。因此，EIF4A3 可能是動脈粥樣硬化治療的靶標。提示EIF4A3 可能在顱內動脈粥樣硬化形成和發生發展過程中發揮重要作用。

Neuro-2a 細胞具有神經細胞特性，生長繁殖速度快，被廣泛用于神經系統疾病方面的研究［19-20］。但目前尚未見EIF4A3 蛋白在Neuro-2a 細胞系中構建缺血缺氧疾病模型的報道， 因此本研究選用Neuro-2a 細胞作為病毒感染和觀察的研究對象。本研究結果顯示：GV493-EIF4A3 慢病毒表達載體成功構建，并成功感染Neuro-2a 細胞，Neuro-2a 細胞中EIF4A3 mRNA 和蛋白成功表達。

綜上所述，本研究成功構建GV493-EIF4A3 慢病毒表達載體， 建立了穩定感染shRNA GV493-EIF4A3 慢病毒的Neuro-2a 細胞系， 為EIF4A3 在顱內動脈粥樣硬化中的作用機制研究提供了參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：何嘉文參與論文設計、撰寫和修改，廖科棋參與實驗數據的獲取和分析，李友和李勝男參與實驗設計。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（81571157）；廣東省衛生廳醫學科研基金項目（A2022139，A2023193）；湛江市科學技術局科技攻關計劃項目（2021B01370）