白屈菜堿對小鼠肺癌細胞皮下移植瘤生長和血管生成的抑制作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討白屈菜堿對肺癌移植瘤小鼠腫瘤生長和血管生成的影響，并闡明其作用機制。方法：選取 32 只健康 C57BL/6 小鼠，制備 Lewis 肺癌移植瘤小鼠模型。將小鼠隨機分為模型組（0. 9% 氯化鈉）、低劑量白屈菜堿組（25 mg·kg－1白屈菜堿）、高劑量白屈菜堿組（50 mg·kg－1白屈菜堿） 和陽性對照組（60 mg·kg－1環磷酰胺），每組8 只。稱量各組小鼠移植瘤質量并計算抑瘤率，計算各組小鼠胸腺指數和脾臟指數，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA） 法檢測各組小鼠血清中白細胞介素2（IL-2）、γ 干擾素（INF-γ） 和腫瘤壞死因子α （TNF-α） 水平，免疫組織化學法檢測各組小鼠腫瘤組織中血管內皮生長因子（VEGF） 蛋白表達情況并計算微血管密度（MVD） 及VEGF 蛋白表達評分，Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中核因子κB （NF-κB） 和缺氧誘導因子1α （HIF-1α） 蛋白表達水平。結果：與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠移植瘤質量均降低（Plt;0. 05）；與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠移植瘤質量均降低（Plt;0. 05），抑瘤率均升高（Plt;0. 05）；與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠移植瘤質量均降低（Plt;0. 05），抑瘤率升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠脾臟指數和胸腺指數均升高（Plt;0. 05）；與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠脾臟指數及胸腺指數均升高（Plt;0. 05）；與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠脾臟指數和胸腺指數均升高（Plt;0. 05）。ELISA 法，與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠血清中IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平均升高（Plt;0. 05）；與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠血清中IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平均升高（Plt;0. 05）；與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠血清中IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平均升高（Plt;0. 05）。與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠腫瘤組織MVD 降低（Plt;0. 05）；與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織MVD 降低（Plt;0. 05）；與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠腫瘤組織中MVD 降低（Plt;0. 05）。與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠腫瘤組織中VEGF 蛋白表達量減少；與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織中VEGF 蛋白表達量減少；與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠腫瘤組織中VEGF 蛋白表達量減少；模型組、低劑量白屈菜堿組、高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織VEGF 蛋白表達評分比較差異有統計學意義（Plt;0. 05）。Western blotting 法，與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠腫瘤組織中NF-κB 和HIF-1α 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）；與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織中NF-κB 和HIF-1α 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）；與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠腫瘤組織中NF-κB和HIF-1α蛋白表達水平降低 （Plt;0. 05）。結論：白屈菜堿能夠抑制Lewis 肺癌移植瘤小鼠腫瘤組織生長、保護免疫器官和抑制腫瘤血管生成，可能通過靶向NF-κB/HIF-1α 信號通路和下調NF-κB 及HIF-1α 蛋白表達水平發揮治療作用。

［關鍵詞］ 白屈菜堿； 核因子κB； 缺氧誘導因子1α； 肺癌移植瘤； 血管生成

［中圖分類號］ R392 ［文獻標志碼］ A

肺癌是目前常見的惡性腫瘤，也是全球死亡率和發病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅患者的生命健康［1-3］。肺癌的發病機制復雜，與吸煙、空氣污染、職業致癌因子、飲食和遺傳等因素密切相關［4-5］。對于早期肺癌患者而言， 手術切除是最佳治療方法，但大部分患者就診時病情已發展至中晚期，治療手段有限，因此患者預后較差［6-7］。白屈菜為罌粟科白屈菜屬多年生草本植物白屈菜全草，其化學成分主要包括白屈菜堿、白屈菜紅堿和原阿片堿等， 具有抗菌、鎮痛和興奮平滑肌的作用， 在腸炎、慢性支氣管炎和百日咳等疾病及多種惡性腫瘤中發揮重要作用［8-9］。本研究通過建立肺癌移植瘤小鼠模型，探討白屈菜堿對腫瘤生長、免疫功能及血管生成的影響，并闡明其作用機制，為后續研究提供依據。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、細胞、藥物、主要試劑和儀器

健康清潔級C57BL/6 小鼠32 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質量18～22 g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK （浙） 2019-0004。Lewis 肺腺癌細胞購自中國科學院細胞資源中心。白屈菜堿（批號150706， 純度≥98%） 購自成都普菲德生物技術有限公司。環磷酰胺購自美國Sigma-Aldrich 公司，多聚甲醛購自武漢塞維爾生物科技有限公司，酶聯免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自江蘇菲亞生物科技有限公司，SP 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司， DAB 顯色試劑盒和蘇木精染色劑購自武漢塞維爾生物科技有限公司。游標卡尺購自西安艾瑞澤商貿有限公司，101-1AB 型恒溫鼓風干燥箱購自北京偉科永興有限公司，離心機購自湖南長沙湘儀儀器有限公司，電泳儀購自北京君意公司， 凝膠成像系統購自法國VILBER BIOIMAGING 公司。

1. 2 實驗動物造模、分組和給藥

收集Lewis肺腺癌細胞， 調整細胞懸液濃度至6×106 mL－1， 每只小鼠右側腋部皮下注射細胞懸液0. 2 mL， 建立皮下移植瘤小鼠模型。接種后8～10 d， 可觸摸到腫瘤， 腫瘤直徑約為2～3 mm， 成瘤率為100%。將32 只C57BL/6 小鼠按照數字表法隨機分為模型組、低劑量白屈菜堿組、高劑量白屈菜堿組和陽性對照組，每組8 只。建模10 d 后給藥，模型組小鼠腹腔注射0. 200 mL 0. 9% 氯化鈉， 低劑量白屈菜堿組和高劑量白屈菜堿組小鼠腹腔注射0. 125 mL（25 mg·kg－1） 和0. 250 mL （50 mg·kg－1） 白屈菜堿，陽性對照組小鼠腹腔注射0. 300 mL （60 mg·kg－1）環磷酰胺，每日1 次，連續給藥14 d。給藥結束7 d 后處死小鼠，剝離小鼠腫瘤組織，部分組織置于4% 多聚甲醛液中固定，剩余組織置于－80 ℃冰箱凍存備用。

1. 3 稱量各組小鼠移植瘤質量并計算抑瘤率

稱量各組小鼠腫瘤組織質量， 并計算各組小鼠抑瘤率。抑瘤率= （模型組小鼠腫瘤組織平均質量－給藥組小鼠腫瘤組織平均質量） /模型組小鼠腫瘤組織平均質量×100%。

1. 4 計算各組小鼠脾臟指數和胸腺指數

離各組小鼠脾臟組織和胸腺組織，計算各組小鼠脾臟指數和胸腺指數。脾臟指數=脾臟質量（mg） /小鼠體質量（g）；胸腺指數=胸腺質量（mg） /小鼠體質量（g）。

1. 5 采用ELISA法檢測各組小鼠血清中白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2）、γ 干擾素（interferon- γ，INF-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平

小鼠處死后眼眶取血，存放至無抗凝劑的試管中， 室溫靜置30 min， 移液器吸取上層淡黃色血清， 轉移至離心管中， 3 000 g 離心15 min。取上清液， 采用ELISA 法檢測各組小鼠血清中IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平。

1. 6 免疫組織化學法檢測各組小鼠腫瘤組織中血管 內 皮 生 長 因 子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）蛋 白 表 達 情 況 和 微 血 管 密 度（microvessel density，MVD）

10% 多聚甲醛固定小鼠腫瘤組織，石蠟切片，免疫組織化學染色按照SP 試劑盒操作說明書進行。VEGF 蛋白陽性表達為腫瘤細胞中細胞漿或細胞膜上的陽性物質呈棕黃色。采用Bresalier 半定量法計算各組小鼠VEGF 蛋白表達評分［10］。細胞染色程度評分：0 分為不顯色，1 分為淺黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；陽性細胞數評分：0 分為陽性細胞數≤5%，1 分為陽性細胞數gt;5% 且≤25%， 2 分為陽性細胞數gt;25%且≤50%，3 分為陽性細胞數gt;51% 且≤75%，4 分為陽性細胞數gt;75%。VEGF 蛋白表達評分=細胞染色程度評分+陽性細胞數評分。VEGF 蛋白表達評分0～1 分為（－）， 2～3 分為（＋）， 4～5 分為（＋＋）， 6～7 分為（＋＋＋）。采用Weidner 法計算各組小鼠腫瘤組織中微血管數，在低倍鏡（×40） 下選取小鼠組織切片中微血管數最多的3 個區域，并在高倍鏡（×400） 下計數［11］。其中被CD34 抗體染成棕黃色孤立的內皮細胞或內皮細胞簇團且與鄰近微血管分開，即為一個微血管，以3 個視野下微血管數平均值代表MVD。

1. 7 Western blotting法檢測各組小鼠腫瘤組織中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和缺氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表達水平

取各組小鼠腫瘤組織，預冷RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法定量蛋白，95 ℃震蕩5 min變性，10% SDS-PAGE 分離， 轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉膜 1 h， 加入一抗 NF- κB（1∶500）、HIF-1α （1∶500） 和β-actin （1∶2 500），4 ℃ 孵育過夜， TBST 溶液洗滌 3 次， 加入二抗（1∶ 3 000）， 室溫孵育2 h， TBST 溶液洗滌3 次，ECL 顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 8 統計學分析

采用 SPSS 22. 0統計軟件進行統計學分析。各組小鼠移植瘤質量、抑瘤率、脾臟指數、胸腺指數、血清中IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平、腫瘤組織中MVD、VEGF 蛋白表達評分和NF- κB 及HIF-1α 蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組小鼠移植瘤質量和抑瘤率

與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠移植瘤質量均減小（Plt;0. 05）。與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠移植瘤質量均減小（Plt;0. 05），抑瘤率均升高（Plt;0. 05）。與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠移植瘤質量減小（Plt;0. 05）， 抑瘤率升高（Plt;0. 05）。見表1。

2. 2 各組小鼠脾臟指數和胸腺指數

與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠脾臟指數和胸腺指數均升高（Plt;0. 05）。與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠脾臟指數及胸腺指數均升高（Plt;0. 05）。與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠脾臟指數和胸腺指數均升高（Plt;0. 05）。見表2。

2. 3 各組小鼠血清中 IL-2、INF-γ 和 TNF-α 水平

與模型組比較， 低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠血清中IL-2 、INF- γ 和TNF- α 水平均升高（Plt;0. 05）。與低劑量白屈菜堿組比較， 高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠血清中IL-2、INF- γ 和TNF- α 水平均升高（Plt;0. 05）。與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠血清中IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平均升高（Plt;0. 05）。見表3。

2. 4 各組小鼠腫瘤組織MVD

與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠腫瘤組織MVD 降低（Plt;0. 05）。與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織MVD 降低（Plt;0. 05）。與高劑量白屈菜堿組比較， 陽性對照組小鼠腫瘤組織MVD 降低（Plt;0. 05）。見圖1 和表4。

2. 5 各組小鼠腫瘤組織中VEGF蛋白表達情況和VEGF蛋白表達評分

與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠腫瘤組織中VEGF蛋白表達量減少。與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織中VEGF蛋白表達量減少。與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠腫瘤組織中VEGF 蛋白表達量減少。模型組、低劑量白屈菜堿組、高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織VEGF 蛋白表達評分比較差異有統計學意義（Plt;0. 05）。見圖2 和表5。

2. 6 各組小鼠腫瘤組織中NF-κB和HIF-1α蛋白表達水平

與模型組比較，低和高劑量白屈菜堿組及陽性對照組小鼠腫瘤組織中NF-κB 和HIF-1α 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。與低劑量白屈菜堿組比較，高劑量白屈菜堿組和陽性對照組小鼠腫瘤組織中NF- κB 和HIF-1α 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。與高劑量白屈菜堿組比較，陽性對照組小鼠腫瘤組織中NF-κB 和HIF-1α 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。見圖3 和表6。

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來世界范圍內肺癌的發病率和死亡率逐年升高，給人類的健康及生命安全帶來巨大威脅。目前，常見的放療、化療和分子靶向治療等方法雖能夠改善肺癌患者病情，但毒性和不良反應顯著，因此發現有效治療肺癌的藥用植物材料具有重要的研究價值［12］。

白屈菜是罌粟科白屈菜屬種， 全草入藥有鎮痛、止咳、利尿和解毒等功效，白屈菜中具有藥理活性的主要有效成分是次生代謝產物中的生物堿類，如白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿和黃連堿等 ［13］。其中白屈菜堿在治療直腸癌、胰腺癌和乳腺癌等多種癌癥中通過不同的機制發揮抗腫瘤作用，具有較好的臨床效果［14-15］。

研究［16］ 顯示：白屈菜堿對惡性腫瘤有特異性抑制作用，白屈菜堿可以抑制腫瘤細胞增殖，且白屈菜堿可作為抑制劑治療非小細胞肺癌的毒性。惡性腫瘤患者的病情進展與腫瘤細胞的浸潤生長密切相關。本研究結果顯示：不同劑量的白屈菜堿均具有明顯抑制Lewis 肺癌移植瘤小鼠移植瘤發展的作用，其移植瘤質量減小且抑瘤率升高。提示白屈菜堿可以抑制Lewis 肺癌的發展，具有一定的抑瘤作用且呈現劑量依賴性。

近年來，免疫系統在腫瘤微環境和癌癥進展中的重要性逐漸被重視［17］。脾臟是重要的免疫器官，是細胞免疫及體液免疫的中心，其中含有大量淋巴細胞及巨噬細胞，在抗腫瘤過程中發揮巨大作用。胸腺是中樞免疫器官，具有調節機體免疫的作用，是T 淋巴細胞分化、發育和成熟的場所，胸腺可以通過分泌胸腺激素調節T 淋巴細胞［18］。本研究結果顯示：模型小鼠脾臟指數及胸腺指數升高且呈現劑量依賴性，提示白屈菜堿可以保護Lewis 肺癌小鼠的免疫器官。機體抗腫瘤免疫反應需要多種淋巴細胞參與，而細胞因子在淋巴細胞成熟和功能中起重要作用， 已有多種細胞因子用于癌癥患者治療［19-20］。IL-2、INF- γ 和TNF- α 均具有廣泛活性，其中 IL-2、INF- γ 由輔助性T 淋巴細胞1 （helperT-lymphocytes 1，Th1） 分泌，能夠刺激 T 淋巴細胞增生增殖并增強其殺傷活性，具有抗病毒、抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用。TNF-α 主要由單核細胞和巨噬細胞產生，是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子［21］。本研究結果顯示：經白屈菜堿干預后，小鼠模型的血清IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平均升高，提示白屈菜堿可通過升高血清IL-2、INF-γ 和TNF-α 水平調節免疫功能并發揮抗腫瘤作用。

腫瘤生長、擴散和轉移與腫瘤新血管生成密切相關，隨著腫瘤體積增大，需生成新血管為其提供營養物質及氧氣，而生成的新血管結構不完善，因此易被腫瘤細胞侵犯從而產生血行轉移，嚴重威脅患者生命。阻斷腫瘤新血管生成，可抑制腫瘤細胞轉移和侵襲， 對于腫瘤的治療具有重要意義［22］。MVD 能夠反映腫瘤的血管生成情況，VEGF 則是目前公認的最強的血管生成促進因子，能夠反應血管內皮細胞的生長狀態［23-24］。本研究結果顯示：經白屈菜堿干預后，各組小鼠 MVD 降低，且 VEGF蛋白表達評分降低，提示白屈菜堿可以通過切斷腫瘤細胞的營養物質及氧氣、抑制內皮細胞和抑制血管生成從而達到抗腫瘤作用。

NF-κB 蛋白是轉錄因子家族蛋白，在眾多生理過程中起重要作用，可以作為炎癥因子信號通路的開關，調控IL-2、INF-γ 和TNF-α 等多個炎癥因子水平參與炎癥反應； HIF-1α 是缺氧應答因子， 能夠讓腫瘤細胞適應缺氧狀態，在腫瘤發生發展過程中扮演重要角色［23］。研究［24-25］ 顯示： 白屈菜堿可能通過肝內磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase， PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 信號通路發揮抗乳腺癌的作用， 且在黑色素瘤中， 白屈菜堿通過激活Wnt/β-catenin 信號通路抑制B16 細胞增殖及誘導凋亡。本研究結果顯示： 白屈菜堿可以降低小鼠模型NF-κB 和HIF-1α蛋白表達水平， 提示白屈菜堿通過降低NF-κB 和HIF-1α 蛋白表達水平抑制腫瘤生長和新血管生成，從而達到治療作用。

綜上所述，白屈菜堿能夠抑制Lewis 肺癌移植瘤小鼠腫瘤組織生長，保護免疫器官，抑制腫瘤血管生成，并降低小鼠模型中NF-κB 和HIF-1α 蛋白表達水平。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：金學軍參與實驗設計、論文撰寫和修改，盧楚沅參與實驗研究、數據整理和統計學分析。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（81660608）