高磷誘導下肢血管平滑肌細胞成骨分化關鍵差異表達基因篩選及驗證

［摘 要］ 目的：采用mRNA高通量測序技術篩選高磷誘導下肢血管平滑肌細胞（VSMCs）鈣化差異表達基因 （DEGs），分析VSMCs鈣化的關鍵基因及信號通路。方法：將人VSMCs分為對照組和模型組，模型組細胞中加入高磷培養基，對照組細胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 培養基于相同條件下培養。調整2 組穩定轉染VSMCs 的狀態，培養12 d，倒置顯微鏡下觀察細胞形態表現并拍照。采用Hisat2 軟件篩選DEGs，采用Stringtie 軟件從生物過程（BP）、分子功能（MF） 和細胞成分（CC）3 個方面進行基因本體論（GO） 功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 信號通路富集分析。Von Kossa 染色法觀察各組細胞鈣化情況，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測2 組細胞中堿性磷酸酶（ALP）、骨形態發生蛋白2 （BMP2）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、腫瘤蛋白53 （Tp53）、谷胱甘肽過氧化物酶4 （GPX4）、鐵蛋白輕鏈1 （Ftl1） 和糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D1 （GPLD1）mRNA表達水平。結果：與對照組比較，模型組共2 524個DEGs，其中1 368個DEGs表達上調，1 156個DEGs 表達下調； 2 組細胞DEGs 聚類分離明顯。GO 功能和KEGG 信號通路富集分析表達上調的DEGs 主要參與微管細胞骨架組織的調節、細胞極性、蛋白質定位和細胞周期調控等BP，構建細胞膜部分、微管組織、染色體和著絲粒區等CC， 發揮與磷脂酰肌醇磷酸鹽、Rho 鳥苷酸三磷酸酶（GTPase） 蛋白結合、參與跨膜轉運和調節蛋白激酶活性等MF；表達下調的DEGs 主要參與細胞質翻譯、蛋白質膜定位、mRNA 代謝和蛋白質內質網定位等BP，構建核糖體亞單位、細胞膜和自噬體等CC，發揮與單鏈DNA、核糖核蛋白復合物、生長因子結合、調節蛋白激酶活性和催化作用等MF。差異表達上調的基因富集7 條信號通路，其中最為顯著的是糖基磷脂酰肌醇（GPI） 錨定的生物合成；差異表達下調的基因富集18 條信號通路，其中最為顯著的是鐵死亡。RT-qPCR 法，與對照組比較，模型組細胞中GPX4、Ftl1 和Tp53 mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01），GPLD1 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）； 與對照組比較， 模型組細胞中α-SMA mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01），ALP和BMP2 mRNA表達水平明顯升高 （Plt;0. 01）。結論：鈣化的VSMCs與正常細胞存在DEGs，鐵死亡和GPI 錨定的生物合成信號途徑是高磷誘導下肢VSMCs 鈣化的關鍵信號通路，主要由GPX4、Ftl1、Tp53 和GPLD1 共同介導完成。

［關鍵詞］ 血管平滑肌細胞； 成骨分化； 細胞鈣化； mRNA 測序； 鐵死亡

［中圖分類號］ Q254 ［文獻標志碼］ A

血管鈣化（vascular calcification， VC） 是2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM） 的重要危險因素， 其細胞學基礎是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs） 的成骨樣分化。與正常人群比較，T2DM 患者的VC 患病率明顯升高［1-3］。與T2DM 有關的VC 在線粒體功能障礙［4］、慢性炎癥［5］ 和自噬［6］ 等方面的研究有新的進展，但其研究方向多集中于心血管動脈粥樣硬化［7］ 和慢性腎病［8］ 等方面， 糖尿病下肢VC 的研究較少。臨床針對糖尿病下肢VC 的治療較為困難，尚無特效藥物，主要以預防為主。因此，探討糖尿病下肢VC 的發病機制有助于臨床精準治療，對提高患者生存質量及預后具有重要意義。目前，糖尿病下肢VC 具體發病機制尚不明確。隨著測序技術的發展， 轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-Seq） 技術和生物信息學分析在醫學及藥學領域中得到廣泛應用，可輔助相關醫藥學研究。本研究基于RNA-Seq 技術篩選并驗證高磷誘導下肢VSMCs 鈣化中差異表達基因（differentiallyexpressed genes， DEGs）， 分析關鍵差異基因及信號通路，為糖尿病VC 發病機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器

人 VSMCs（中國科學院細胞庫）。總RNA 文庫制備相關試劑盒（美國因美納公司），核酸片段篩選試劑盒（美國貝克曼庫爾特公司），SuperScript Ⅳ反轉錄酶（美國賽默飛公司），鐵蛋白輕鏈1 （ferritin light polypeptide-1，Ftl1）、腫瘤蛋白53 （tumor protein 53，Tp53）、糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D1 （glycosylphosphatidy linositol specific phospholipase D1，GPLD1） 和谷胱甘肽過氧化酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4） 試劑盒（英國Abcam 公司），4% 多聚甲醛（上海碧云天生物技術股份有限公司），Von Kossa 銀溶液（上?？道噬锟萍加邢薰荆?。超速冷凍離心機（湖南湘儀公司）， 酶標儀（美國 BioTek 公司），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），紫外分光光度計（型號：NanoDrop 2000）、熒光定量儀（型號：Invitrogen Qubit 3. 0）、 PCR 擴增儀（型號：ABI 2720 Thermal Cycler） 和 Ambion 磁性底座（美國賽默飛公司），離心機（型號：Eppendorf 5810R，德國艾本德公司），核酸電泳分析儀（型號：Agilent2100 bioanalyzer， 美國安捷倫公司）， 基因測序儀（型號：Illumina novaseq 6000，美國因美納公司），實時熒光定量 PCR （real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR） 儀（瑞士羅氏公司）。

1. 2 細胞分組和造模

將人 VSMCs分為對照組和模型組。根據參考文獻［9-10］ 中方法建立模型。模型組細胞中加入高磷培養基（含10 mmol·L－1β-甘油磷酸鹽、50 g·L－1維生素C 和 1×10－7 mol·L－1胰島素的高糖DMEM 培養基） 誘導細胞鈣化，于37 ℃、5% CO2 條件下進行培養。為模擬T2DM 患者體內環境， 在鈣化誘導的平滑肌細胞中加入50 mg·L－1 氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein， ox-LDL） 和10 μmol·L－1 羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyl-lysine，CML）。對照組細胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 培養基于模型組相同條件下培養。調整2 組穩定轉染VSMCs的狀態，培養12 d，倒置顯微鏡下觀察細胞形態表現并拍照。由合肥麟美生物科技有限公司提供穩定轉染細胞轉錄組測序。

1. 3 DEGs 篩選和基因本體論（Gene Ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析

采用Hisat2軟件篩選DEGs，采用Stringtie 軟件從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function， MF） 和細胞成分（cellular componen，CC） 3 個方面進行GO 功能及KEGG 信號通路富集分析。采用微生信在線作圖（http：//www. bioinformatics. com. cn/） 進行可視化處理，繪制圖像。

1. 4 Von Kossa 染色法觀察各組細胞鈣化情況

采用4% 多聚甲醛固定細胞，加入Von Kossa 銀溶液， 強光照射15～60 min， 蒸餾水洗滌1 min，加入硫代硫酸鈉溶液處理2 min。Van Gieson 染色液復染細胞，于電鏡下觀察并拍照。

1. 5 RT-qPCR 法 檢 測 2 組 細 胞 中 堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨形態發生蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、α-平滑肌肌動蛋白 （alpha-smooth muscle actin， α-SMA）、Tp53、GPX4、Ftl1和 GPLD1 mRNA 表達水平

采用TRIzol 法提取細胞總RNA，反轉錄獲取cDNA，進行PCR 擴增。反應條件：95 ℃預變性3 min，擴增95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環。引物序列見表1。采用2—△△Ct法計算目的基因表達水平。

1. 6 統計學分析

采用 SPSS 23. 0統計軟件進行統計學分析。2 組細胞中ALP、BMP2、α-SMA、Tp53、GPX4、Ftl1 和GPLD1 mRNA 表達水平均符合正態分布，以x±s 表示，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 2組細胞 DEGs和聚類分析

與對照組比較，模型組細胞共有2 524 個DEGs， 其中1 368 個DEGs 表達上調， 1 156 個DEGs 表達下調。將DEGs 進行聚類分析， 結果顯示： 2 組細胞DEGs聚類分離明顯。見圖1。

2. 2 GO 功能和 KEGG 信號通路富集分析

表達上調的DEGs 主要參與微管細胞骨架組織的調節、細胞極性、蛋白質定位和細胞周期調控等BP，構建細胞膜部分、微管組織、染色體和著絲粒區等CC， 發揮與磷脂酰肌醇磷酸鹽、Rho 鳥苷酸三磷酸酶（guanosine triphosphatase， GTPase） 蛋白結合、參與跨膜轉運和調節蛋白激酶活性等MF；表達下調的DEGs 主要參與細胞質翻譯、蛋白質膜定位、mRNA 代謝和蛋白質內質網定位等BP，構建核糖體亞單位、細胞膜和自噬體等CC，發揮與單鏈DNA、核糖核蛋白復合物、生長因子結合、調節蛋白激酶活性和催化作用等 MF。 見圖2。 差異表達上調的基因富集 7 條信號通路，其中最為顯著的是糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI） 錨定的生物合成； 表達下調的 DEGs 富集18 條信號通路，其中最為顯著的是鐵死亡。GPI 錨定的生物合成信號通路中共3 個上調的DEGs，分別為磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成V（phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesisclass V，Pigv）、GPLD1 和磷脂酰肌醇聚糖錨定生物合成C （phosphatidylinositol glycan anchorbiosynthesis class C，Pigc）。鐵死亡信號通路共8 個下調的 DEGs， 分別為 LOC100360087、AABR07004746. 1、Ftl1、Rho 家族相互作用細胞極化調節因子2 （Rho family interacting cellpolarization regulator 2，Ripor2）、精脒/精胺N1-乙?；D移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1，Sat1）、GPX4、Tp53 和電壓依賴性陰離子通道2 （voltage-dependent anionchannel 2，Vdac2）。見圖3。

2. 3 2組細胞形態表現

Von Kossa染色法觀察可見對照組細胞生長正常，細胞密度高，細胞形態正常，未見明顯的鈣化細胞；模型組細胞生長緩慢，細胞密度較低，細胞形態發生變化，可見明顯的鈣化細胞黑褐色位點。見圖4。

2. 4 2組細胞中 α-SMA、ALP 和 BMP2 mRNA 表達水平

與對照組比較，模型組細胞中 α -SMAmRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01）， ALP 和BMP2 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。見表2。

2. 5 2組細胞中GPX4、Ftl1、Tp53和GPLD1 mRNA表達水平

與對照組比較，模型組細胞中 GPX4、Ftl1 和Tp53 mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 01）， GPLD1 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。見表3。

3 討 論

目前全球糖尿病患病率逐年升高， 預計至2030 年約有5. 784 億人患有糖尿?。?1］。VC 是糖尿病患者常見的并發癥，也是糖尿病患者疾病惡化、心血管疾病發病率升高和患者死亡的危險因素。VSMCs 是負責血管功能的主要細胞，在受到氧化應激和高葡萄糖水平等條件刺激時， 分泌大量的ALP、α-SMA 和BMP2 等骨相關蛋白，進而發生細胞表型轉化，由原始的收縮表型轉變為成骨細胞樣表型［12］。重組BMP2 增強了高鈣和磷酸鹽誘導的VSMCs 鈣化，同時失去收縮表型標記α-SMA［12-13］。細胞通過產生局部的前鈣化促進內側鈣化環境，為鈣和磷酸鹽提供成核位點沉淀及磷酸鈣晶體生長。

為更好地從轉錄組學水平了解糖尿病下肢VC的發病機制，本研究采用高磷誘導人下肢VSMCs鈣化，RNA-seq 技術分析DEGs，結果顯示：鈣化細胞中共有2 524個DEGs，其中1 368個上調，1 156個下調；對照組和模型組細胞DEGs 聚類顯著分離。DEGs 通過參與微管細胞骨架組織的調節、蛋白質定位、細胞周期調控、mRNA 代謝和蛋白質內質網定位等細胞BP 影響細胞鈣化的發生。KEGG 信號通路富集分析結果顯示：高磷誘導的下肢VSMCs中上調的DEGs 主要富集于7 條信號通路上，最顯著的是GPI 錨定的生物合成途徑。GPLD1 與多種慢性疾病的發生發展有關， 可以裂解細胞膜上被GPI 錨定的蛋白質，從而發揮生物學效應，如糖脂代謝調節和神經系統疾病調控等［14-16］。研究［17］ 顯示：糖尿病模型大鼠血液中GPLD1 水平顯著高于正常組大鼠。GPLD1 通過裂解GPI 錨定細胞膜蛋白，上調巨噬細胞的細胞因子表達，影響糖尿病進程［18］。研究［19］ 顯示： 胰島素可以抑制GPLD1 的合成， 降低血循環中 GPLD1 水平， 改善大鼠血糖。本研究結果顯示：下調的DEGs 主要富集于18條信號通路上，最為顯著的是鐵死亡途徑。細胞中鐵蛋白重鏈1 （ferritin heavy polypeptide 1，Fth1） 和Ftl1 表達下調導致鐵過載［20］。鐵過載通過誘導細胞凋亡和鐵死亡而促進內皮細胞鈣化。鐵螯合劑和鐵死亡抑制劑可減輕鐵過載引起的鐵死亡及鈣化［21］。在促成骨條件下，鐵死亡誘導劑誘導谷胱甘肽（glutathione，GSH） 消耗，促進VSMCs 鈣化，而N-乙酰半胱氨酸補充GSH，抑制VSMCs 鈣化。高鈣和磷酸鹽下調GPX4 的表達，并降低谷胱甘肽過氧化物酶活性，促進VSMCs 鈣化［8］。

本研究結果顯示：模型組細胞生長緩慢，有明顯的鈣化點， 表明高磷誘導的VSMCs 發生鈣化。為進一步驗證參與細胞鈣化的關鍵分子，本研究在生物信息學分析結果的基礎上對目標分子進行RT-qPCR 法檢測結果顯示：與對照組比較，模型組細胞鐵死亡通路的GPX4、Ftl1 和Tp53 mRNA 表達水平明顯降低， GPI 錨定的生物合成通路的GPLD1 mRNA 表達水平明顯升高，同時表型蛋白α-SMA mRNA 表達水平明顯降低，ALP 和BMP2mRNA 表達水平明顯升高。提示高磷誘導的VSMCs 鈣化可能是由鐵死亡和GPI 錨定的生物合成途徑共同介導完成的。

綜上所述， 鈣化的VSMCs 與正常細胞存在DEGs 的基因，鐵死亡和 GPI 錨定的生物合成信號途徑是高磷誘導下肢 VSMCs 鈣化的關鍵信號通路，主要由GPX4、Ftl1、Tp53 和GPLD1 共同介導完成。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：倪英群參與論文選題、研究設計、論文撰寫和審校，楊矛、楊迪和郭呈林參與統計學分析， 朱文君、俞雅琴、盧芹、駱金芝和吳春琴參與數據采集及文獻檢索，方朝暉參與論文選題、研究設計和論文審校。

[參考文獻]

［1］ ALMAN A C， MAAHS D M， REWERS M J， et al.Ideal cardiovascular health and the prevalence andprogression of coronary artery calcification in adults withand without type 1 diabetes［J］. Diabetes Care，2014， 37（2）： 521-528.

［2］ BERRY C， TARDIF J C， BOURASSA M G.Coronary heart disease in patients with diabetes： part Ⅰ：recent advances in prevention and noninvasivemanagement［J］. J Am Coll Cardiol， 2007， 49（6）：631-642.

［3］ YAHAGI K， KOLODGIE F D， LUTTER C， et al.Pathology of human coronary and carotid arteryatherosclerosis and vascular calcification in diabetesmellitus［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2017，37（2）： 191-204.

［4］ WANG P W， PANG Q， ZHOU T， et al. Irisinalleviates vascular calcification by inhibiting VSMCosteoblastic transformation and mitochondria dysfunctionvia AMPK/Drp1 signaling pathway in chronic kidneydisease［J］. Atherosclerosis， 2022， 346： 36-45.

［5］ SáNCHEZ-DUFFHUES G， GARCíA DE VINUESA A，VAN DE POL V， et al. Inflammation inducesendothelial-to-mesenchymal transition and promotesvascular calcification through downregulation ofBMPR2［J］. J Pathol， 2019， 247（3）： 333-346.

［6］ LIU Q， LUO Y， ZHAO Y， et al. Nano-hydroxyapatiteaccelerates vascular calcification via lysosomeimpairment and autophagy dysfunction in smooth musclecells［J］. Bioact Mater， 2021， 8： 478-493.

［7］ AHN B Y， JEONG Y， KIM S， et al. Cdon suppressesvascular smooth muscle calcification via repression of theWnt/Runx2 Axis［J］. Exp Mol Med， 2023， 55（1）：120-131.

［8］ YE Y Z， CHEN A， LI L， et al. Repression of theantiporter SLC7A11/glutathione/glutathione peroxidase 4axis drives ferroptosis of vascular smooth muscle cellsto facilitate vascular calcification［J］. Kidney Int， 2022，102（6）： 1259-1275.

［9］ WANG Z Q， JIANG Y C， LIU N F， et al. Advancedglycation end-product Nε-carboxymethyl-Lysineaccelerates progression of atherosclerotic calcification indiabetes［J］. Atherosclerosis， 2012， 221（2）： 387-396.

［10］高 敏， 陳天雷， 吳 琳， 等. 吡格列酮通過 Wnt/β-catenin信號通路減輕大鼠血管平滑肌細胞鈣化［J］.腎臟病與透析腎移植雜志， 2016， 25（4）： 340-346.

［11］YAO H P， SUN Z， ZANG G Y， et al. Epidemiologicalresearch advances in vascular calcification in diabetes［J］.J Diabetes Res， 2021， 2021： 4461311.

［12］VOELKL J， LANG F， ECKARDT K U， et al.Signaling pathways involved in vascular smooth musclecell calcification during hyperphosphatemia［J］. Cell MolLife Sci， 2019， 76（11）： 2077-2091.

［13］KONG Y L， LIANG Q C， CHEN Y T， et al.Hyaluronan negatively regulates vascular calcificationinvolving BMP2 signaling［J］. Lab Invest， 2018，98（10）： 1320-1332.

［14］MASUDA S， FUJISHIMA Y， MAEDA N， et al.Impact of glycosylphosphatidylinositol-specificphospholipase D on hepatic diacylglycerol accumulation，steatosis， and insulin resistance in diet-inducedobesity［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2019，316（2）： E239-E250.

［15］RAIKWAR N S， BOWEN-DEEG R F， DU X S， et al.Glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase Dimproves glucose tolerance［J］. Metabolism， 2010，59（10）： 1413-1420.

［16］TORRETTA S， RAMPINO A， BASSO M， et al.NURR1 and ERR1 modulate the expression of genes ofa DRD2 coexpression network enriched for schizophreniarisk［J］. J Neurosci， 2020， 40（4）： 932-941.

［17］ABDOLMALEKI F， HEIDARIANPOUR A.Endurance exercise training restores diabetes-inducedalteration in circulating Glycosylphosphatidylinositolspecificphospholipase D levels in rats［J］. DiabetolMetab Syndr， 2020， 12： 43.

［18］QIN W， LIANG Y Z， QIN B Y， et al. The clinicalsignificance of glycoprotein phospholipase D levels indistinguishing early stage latent autoimmune diabetes inadults and type 2 diabetes［J］. PLoS One， 2016， 11（6）：e0156959.

［19］SCHOFIELD J N， STEPHENS J W， HUREL S J，et al. Insulin reduces serum glycosylphosphatidylinositolphospholipase D levels in human type I diabetic patientsand streptozotocin diabetic rats［J］. Mol Genet Metab，2002， 75（2）： 154-161.

［20］WANG K， CHEN X Z， WANG Y H， et al. Emergingroles of ferroptosis in cardiovascular diseases［J］. CellDeath Discov， 2022， 8（1）： 394.

［21］ZHAO L L， YANG N， SONG Y Q， et al. Effect ofiron overload on endothelial cell calcification and itsmechanism［J］. Ann Transl Med， 2021， 9（22）： 1658.

[基金項目] 國家自然科學基金項目（82274468）；安徽省教育廳高校優秀人才支持計劃項目（gxyqZD2021114）；安徽中醫藥大學 新安醫學教育部重點實驗室開放項目（2022XAYX06）； 安徽中醫藥大學臨床科研項目（2021yfylc07）