靈芝酸A 對非小細胞肺癌PC9 細胞糖酵解及其關鍵限速酶的影響

［摘 要］ 目的：探討不同劑量靈芝酸 A （GAA） 對非小細胞肺癌 （NSCLC） PC9細胞的生物活性、糖酵解及其限速酶表達的影響，并闡明其作用機制。方法：體外培養 NSCLC PC9 細胞，將PC9 細胞分為空白對照組、低劑量（25 μmol·L－1） GAA 組、中劑量（50 μmol·L－1） GAA 組和高劑量（100 μmol·L－1） GAA 組。采用噻唑藍（MTT） 法檢測各組PC9 細胞存活率，Transwell 小室實驗檢測各組PC9 細胞遷移細胞數， 葡萄糖檢測試劑盒檢測各組PC9 細胞葡萄糖攝取量， 三磷酸腺苷（ATP） 檢測試劑盒檢測各組PC9 細胞中ATP 水平，乳酸檢測試劑盒檢測各組PC9 細胞中乳酸水平，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組PC9 細胞中己糖激酶2 （HK2） 和M2 型丙酮酸激酶（PKM2） mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組 PC9 細胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表達水平。結果：MTT法，培養24、48和72 h時，與空白對照組比較，中和高劑量GAA組PC9細胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）；培養72 h 時，與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組細胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。Transwell 小室實驗， 與空白對照組比較， 中和高劑量GAA 組細胞遷移數明顯減少（Plt;0. 05）；與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組細胞遷移數明顯減少（Plt;0. 05）。與空白對照組比較，中和高劑量GAA 組PC9 細胞中葡萄糖攝取量和乳酸水平均明顯降低（Plt;0. 05），高劑量GAA 組PC9細胞中ATP 水平明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法，與空白對照組比較，中和高劑量GAA 組PC9細胞中HK2 和PKM2 mRNA 表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法，與空白對照組比較，中和高劑量GAA組PC9細胞中HK2和PKM2蛋白表達水平明顯降低 （Plt;0. 05）。結論：中和高劑量GAA 可抑制PC9 細胞增殖及遷移的生物活性，降低糖酵解作用，其作用機制可能與抑制關鍵限速酶HK2 和PKM2 的表達有關。

［關鍵詞］ 靈芝酸A； 癌，非小細胞肺； 己糖激酶2； M2 型丙酮酸激酶； 糖酵解

［中圖分類號］ R734. 2 ［文獻標志碼］ A

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 約占全部肺癌患者的85% ［1-2］。研究［3］顯示：惡性腫瘤細胞通過糖酵解途徑較氧化磷酸化途徑產生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 的速度更快， 可為腫瘤細胞快速增殖提供能量。惡性腫瘤細胞為了具有較強的侵襲、增殖、遷移和躲避免疫細胞識別的能力，即使在有氧條件下也會選擇糖酵解獲能， 被稱為有氧糖酵解（Warburg 效應）［4］。糖酵解過程中可產生乳酸，乳酸使腫瘤局部維持酸性微環境，便于腫瘤細胞的侵襲和增殖［5］。郝萌萌等［6］ 發現：靈芝酸A （ganodericacid A，GAA） 是由靈芝中分離出來的三萜類活性成分，有解毒、鎮靜、止痛、保肝和抗腫瘤等作用。國內外研究［7-9］ 顯示： GAA 具有抑制腫瘤細胞增殖、減弱細胞侵襲能力及誘導腫瘤細胞凋亡的作用， 因此針對GAA 抗腫瘤方面的研究日趨增多。己糖激酶2 （hexokinase 2，HK2） 和M2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2） 是有氧糖酵解調控過程中的關鍵限速酶。因此，可以通過降低糖酵解限速酶活性，抑制腫瘤細胞糖酵解，進而減少腫瘤細胞的能量代謝，以達到抗癌的目的。目前關于GAA 對NSCLC 糖酵解的影響及其作用機制的報道較少。本研究探討不同劑量GAA 對NSCLC細胞增殖和侵襲及糖酵解方面的影響，并闡明其作用機制， 為GAA 對NSCLC 的臨床治療提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1. 1 細胞、藥物、主要試劑和儀器

NSCLC PC9細胞（北華大學基礎醫學院解剖教研室凍存）。GAA （純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）。胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國BI 公司），Transwell 小室試劑盒（美國Corning 公司）， 噻唑藍（methylthiazolydiphenyltetrazolium，MTT）（美國Sigma 公司）， 葡萄糖檢測試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司）， ATP 檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒（上海碧云天公司）， 逆轉錄PCR 試劑盒（北京艾德實驗室生物技術有限公司）、 PKM2、 HK2 和甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceralde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）。PCR儀（型號：Veriti96，美國ABI 公司），蛋白質電泳儀和凝膠成像分析系統（美國Syngene 公司）， 酶標儀（型號：1681130A，美國Bio-Rad 公司）。

1. 2 細胞培養及分組

PC9 細胞分別培養于含10% FBS 和1% 青-鏈霉素的DMEM 及RIPM 1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2 的恒溫細胞培養箱中培養，取狀態良好的對數生長期細胞進行實驗。將 PC9 細胞分為空白對照組、 低劑量 GAA（25 μmol·L－1 GAA） 組、中劑量GAA （50 μmol·L－1GAA） 組和高劑量GAA （100 μmol·L－1 GAA） 組，空白對照組細胞按照常規方法培養，未添加GAA。

1. 3 MTT 法檢測各組 PC9細胞存活率

取對數生長期的PC9 細胞， 以5×10４mL－1 的密度接種于96 孔細胞培養板，于37 ℃、5% CO2 培養箱中孵育24 h。分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA，于24、48 和72 h 時取出96 孔細胞培養板，棄上清，每孔加入20 μL、0. 5% MTT 溶液的完全培養液，繼續培養4 h 后再次棄上清，每孔加入 150 μL 二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide， DMSO）， 設定波長為490 nm，酶標儀測定各孔吸光度（A） 值，計算各組細胞存活率。細胞存活率= （實驗組A 值－空白組A 值） / （對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 4 Transwell小室實驗檢測各組PC9細胞遷移細胞數

取對數生長期 PC9 細胞，細胞密度為 5×104 mL－1， 各組細胞中分別加入 0、 25、 50 和100 μmol·L－1 GAA， 在各組細胞中取200 μL 接種于Transwell 小室上層， 下室均加入FBS 培養基，培 養 48 h 后， 磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphatebuffered saline， PBS） 洗滌， 4% 多聚甲醛固定30 min， 再用0. 1% 結晶紫染色15 min， 顯微鏡下計數發生遷移的細胞數并拍照。各組每孔隨機選取5 個視野計數細胞并取其平均值，每組重復3 次。

1. 5 葡萄糖含量檢測試劑盒檢測各組PC9細胞中葡萄糖攝取量

取對數生長期PC9細胞，細胞密度為 5×10４mL－1， 細胞接種于 24 孔細胞培養板中，分別加入0、25、50 和 100 μmol·L－1 GAA， 給藥48 h 后，PBS 緩沖液洗滌2 次，采用不含葡萄糖的培養基孵育細胞2 h， 加入2-NBDG 溶液50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，參照葡萄糖含量檢測試劑盒說明書步驟操作，采用酶標儀于波長570 nm 處檢測各孔A 值，實驗重復3 次。葡萄糖攝取量= （實驗組A 值－空白組A 值） / （對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 6 ATP檢測試劑盒檢測各組PC9細胞中ATP水平

取對數生長期PC9 細胞， 細胞密度為5×10４ mL－1， 接種于24 孔細胞培養板中， 分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA，給藥48 h 后，每孔加入 100 μL 細胞裂解液冰上裂解 15 min，12 000 r·min－1 離心10 min， 取上清液。每個樣品中加入100 μL 以1∶6 稀釋的ATP 檢測試劑，暗室中靜置5 min，使試劑與ATP 充分反應，立即向每孔添加10 μL 標準品，采用酶標儀于波長570 nm 處檢測各孔A 值，實驗重復3 次。ATP 水平= （實驗組A 值－ 空白組A 值） / （對照組A 值－ 空白組A 值） ×100%。

1. 7 乳酸檢測試劑盒檢測各組PC9細胞中乳酸水平

取對數生長期 PC9 細胞， 細胞密度為 5×10４ mL－1，細胞接種于24 孔細胞培養板中，分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA，給藥48 h 時，加入細胞裂解液，在1. 5 mL EP 管中，12 000 r·min－1離心30 min，取上清液，參照乳酸檢測試劑盒說明書操作。于波長570 nm 處檢測各孔A 值， 實驗重復3 次。 乳酸水平= （實驗組A 值－ 空白組A 值） / （對照組A 值－ 空白組A 值） ×100%。

1. 8 實 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR， RT-qPCR）法檢測各組PC9細胞中 HK2和 PKM2 mRNA表達水平

收集各組給藥后48 h 的 PC9 細胞，采用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。Primer 5. 0 軟件設計引物， 引物序列： HK2 上游引物， 5'-AGAACATCCTGTGGCTGGAC-3'， 下游引物， 5'-ACCTTTCTGCTTCACCTGGA-3'， 擴增產物為466 bp；PKM2上游引物，5'-ACAACGTCTFCTGTCCAC-3'， 下游引物， 5'-TAACTGGATGTGACACAGAG-3'， 擴增產物為325 bp； GAPDH 上游引物，5'-CGTGGGGGTCTTAATGACCA-3'， 下游引物， 5'-TCCAGAAGGACTCCTCCTTG-3'， 擴增產物為509 bp。PCR 反應條件： 60 ℃ 、2 min，94 ℃ 、2 min 預變性； 變性94 ℃ 、2 min； 退火60 ℃、1 min；循環40 次，延伸72 ℃、10 min。采用2－△△Ct法計算目的基因表達水平，每組重復3 次。

1. 9 Western blotting 法 檢 測 各 組 PC9 細 胞 中HK2和PKM2蛋白表達水平

取對數生長期PC9細胞，細胞密度為5×10４mL－1，接種于24 孔細胞培養板中培養，細胞貼壁后，分別加入0、25、50 和100 μmol·L－1 GAA 處理48 h。 收集各組細胞，采用細胞蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。取25 μg 總蛋白， 經10% SDS-PAGE 膠電泳，轉至PVDF 膜，以5% 脫脂奶粉室溫封閉。加入一抗，HK2 和PKM2 以1∶200 稀釋，GAPDH 以1∶1 000 稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST 溶液清洗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 溶液清洗。采用ECL 顯色曝光成像，成像分析系統攝取圖像，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值，每組實驗重復3 次。

1. 10 統計學分析

采用SPSS 21. 0統計軟件進行統計學分析。各組細胞存活率、乳酸水平、葡萄糖攝取量、ATP 水平、HK2 和PKM2 mRNA 及蛋白表達水平均符合正態分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組 PC9 細胞存活率

培養 24、48 和 72 h時，與空白對照組比較，低劑量GAA 組PC9 細胞存活率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， 中和高劑量GAA 組PC9 細胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。培養24 和48 h 時，與低劑量GAA 組比較，中和高劑量GAA 組PC9 細胞存活率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；培養72 h 時，與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組PC9 細胞存活率明顯降低（Plt;0. 05）。見表1。

2. 2 各組 PC9 細胞遷移細胞數

與空白對照組（108. 69 個±4. 66 個） 比較，低劑量GAA 組PC 細胞遷移細胞數（97. 29 個±5. 20 個） 差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， 中劑量GAA 組（84. 34 個±4. 98 個） 和高劑量GAA 組（77. 76 個±4. 35 個）PC9 細胞遷移細胞數明顯減少（Plt;0. 05）。與低劑量GAA 組比較， 高劑量GAA 組PC9 細胞遷移細胞數明顯減少（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 3 各組 PC9細胞中葡萄糖攝取量、ATP水平及乳酸水平

與空白對照組比較，低劑量 GAA 組PC9 細胞中葡萄糖攝取量、ATP 水平和乳酸水平差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）， 中和高劑量GAA 組PC9 細胞中葡萄糖攝取量及乳酸水平均明顯降低（Plt;0. 05）； 中劑量GAA 組PC9 細胞中ATP 水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05）， 高劑量GAA 組PC9 細胞中ATP 水平明顯降低（Plt;0. 05）。見表2。

2. 4 各組 PC9 細胞中 HK2 和 PKM2 mRNA 表達水平

與空白對照組比較，低劑量GAA組PC9細胞中HK2 和PKM2 mRNA 表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05），中和高劑量GAA 組PC9 細胞中HK2 及PKM2 mRNA 表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖2。

2. 5 各組 PC9 細胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表達水平

與空白對照組比較，低劑量GAA 組PC9 細胞中 HK2 和 PKM2 蛋白表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05），中和高劑量GAA 組PC9細胞中HK2 及PKM2 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖3。

3 討 論

晚期NSCLC 的生存率較低，腫瘤有氧糖酵解產生的乳酸與腫瘤的擴散和復發具有一定的相關性［10-11］。研究［12-14］ 顯示： 乳酸產生可以促進腫瘤血管生成、誘使腫瘤局部產生炎癥反應、減少機體對腫瘤細胞的免疫反應和增強腫瘤細胞侵襲遷移性。因此， 通過測定腫瘤細胞消耗葡萄糖量、ATP 水平和乳酸水平， 可以判斷腫瘤細胞糖酵解情況。本研究以NSCLC PC9 細胞為研究對象，觀察不同劑量GAA 對PC9 細胞的生物活性、糖酵解產物和糖酵解關鍵限速酶的影響。本研究結果顯示： 采用不同劑量GAA 處理PC9 細胞24、48 和72 h 后，中和高劑量GAA 組PC9 細胞存活率明顯降低，細胞增殖受到抑制。在細胞遷移實驗中，隨著GAA 劑量升高， PC9 細胞遷徙細胞逐漸減少；與空白對照組比較，中和高劑量GAA 組PC9 細胞對葡萄糖攝取量及乳酸水平明顯降低， 高劑量GAA 組PC9 細胞ATP 水平明顯降低。提示GAA濃度升高可以抑制PC9 細胞的生物學活性，抑制有氧糖酵解，阻斷腫瘤細胞能量供應，并可以作為重要的抗癌治療手段。

PKM2 是糖酵解的關鍵限速酶，對腫瘤的生長和增殖具有重要作用。研究［15-18］ 發現： 在肝癌、胃癌和膠質母細胞瘤中存在PKM2 蛋白過表達。降低PKM2 蛋白表達水平，減弱腫瘤細胞的有氧糖酵解，可以促進腫瘤細胞凋亡［19-20］。HK2 是有氧糖酵解的第一個關鍵限速酶， 與腫瘤相關性較高。研究［21-22］ 顯示：抑制HK2 活性可降低有氧糖酵解水平。GAA 抑制腫瘤細胞增殖的作用已被證實［23］，但是GAA 抗腫瘤的作用機制尚不明確。本研究結果顯示：中和高劑量GAA 組PC9 細胞中PKM2 和HK2 mRNA 及蛋白表達水平明顯降低，提示可以通過限制糖酵解及其關鍵限速酶的活性，抑制糖酵解關鍵限速酶PKM2 和HK2 蛋白表達， 進而實現抗腫瘤的作用。

綜上所述，GAA 劑量升高可以抑制PC9 細胞的存活率、遷移細胞數、葡萄糖攝取量、ATP 水平、乳酸水平、HK2 和PKM2 mRNA 及蛋白表達水平， 其主要作用機制可能與HK2 和PKM2 蛋白表達有關。GAA 在抑制PC9 細胞糖酵解方面發揮重要作用，本研究結果為探討抗NSCLC 的輔助用藥提供了理論依據。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：任愛華和董彥伯參與文獻檢索、實驗設計及論文撰寫，苗潤芝參與數據收集和分析，呂俞嬌參與論文結果分析和討論，劉巖峰參與論文寫作指導和審校。

[參考文獻]

［1］ UNG M H， MACKENZIE T A， ONEGA T L， et al.Statins associate with improved mortality among patientswith certain histological subtypes of lung cancer［J］.Lung Cancer， 2018， 126： 89-96.

［2］ OSMANI L， ASKIN F， GABRIELSON E， et al.Current WHO guidelines and the critical role ofimmunohistochemical markers in the subclassification ofnon-small cell lung carcinoma （NSCLC）： moving fromtargeted therapy to immunotherapy［J］. Semin CancerBiol， 2018， 52（Pt 1）： 103-109.

［3］ 張斯琦， 劉丹丹， 孫美琪， 等. 腫瘤細胞能量代謝特點的研究進展［J］. 吉林醫藥學院學報， 2023， 44（1）：49-52.

［4］ 王鳳麗， 胡 晶. 惡性腫瘤中泛素化修飾對Warburg效應調控機制的研究進展［J］. 腫瘤防治研究， 2022，49（6）： 616-622.

［5］ SUN H Y， CHEN L， CAO S， et al. Warburg effects incancer and normal proliferating cells： two tales of thesame Name［J］. GPB， 2019， 17（3）： 273-286.

［6］ 郝萌萌， 王金艷， 馮 娜， 等. 靈芝子實體中不同極性的三萜體外抗腫瘤及抗炎活性比較［J］. 菌物學報，2019， 38（6）： 917-925.

［7］ GILL B S， KUMAR S， NAVGEET. Evaluating antioxidantpotential of ganoderic acid A in STAT 3pathway in prostate cancer［J］. Mol Biol Rep， 2016，43（12）： 1411-1422.

［8］ SUN Z W， SUN L B， LI W W. Effect of ganoderic acidon diethylnitrosamine-induced liver cancer in mice［J］.Trop J Pharm Res， 2021， 19（12）： 2639-2644.

［9］ LAN X T， XIAO H. Cyclodextrins facilitate theefficient secretion of an anti-tumor triterpenoid ganodericacid HLDOA by Saccharomyces cerevisiae［J］. J BiosciBioeng， 2020， 130（2）： 142-148.

［10］周 倩， 譚榜憲. 晚期非小細胞肺癌維持治療的研究進展［J］. 中國腫瘤臨床， 2021， 48（12）： 631-635.

［11］GU H L， WANG Y Z， HUANG D S， et al. Clinicalfeatures and imaging manifestations of retinoblastoma with hepatic metastasis［J］. Pediatr Blood Cancer， 2021，68（10）： e28959.

［12］白日蘭， 白 玲， 李 薇， 等. 乳酸及其轉運蛋白對腫瘤和免疫的影響及相關治療進展［J］. 腫瘤代謝與營養電子雜志， 2021， 8（3）： 245-250.

［13］NIU D， WU Y W， LEI Z Y， et al. Lactic acid， a driverof tumor-stroma interactions［J］. Int Immunopharmacol，2022， 106： 108597.

［14］閆 焱， 焦碧航， 周 昆， 等. 基線 BMI 與免疫檢查點抑制劑治療晚期非小細胞肺癌療效的關系［J］. 鄭州大學學報（醫學版）， 2023， 58（3）： 373-377.

［15］GUO J S， XUE Q Q， LIU K H， et al.Dimethylaminomicheliolide （DMAMCL） suppresses theproliferation of glioblastoma cells via targeting pyruvatekinase 2 （PKM2） and rewiring aerobic glycolysis［J］.Front Oncol， 2019， 9： 993.

［16］曲顏麗， 王海峰， 唐 勇. 胃癌BGC-823細胞中缺氧誘導因子對葡萄糖轉運蛋白1、M2型丙酮酸激酶及血管內皮生長因子的調控作用［J］. 中華實驗外科雜志， 2018，35（4）： 627-630.

［17］韓家鑫， 宓余強， 徐 亮. 肝細胞癌早期篩查和診斷的研究進展［J］. 臨床肝膽病雜志， 2023， 39（6）： 1468-1475.

［18］YUAN Q， ZHANG J， LIU Y， et al. MyD88 inmyofibroblasts regulates aerobic glycolysis-drivenhepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclearrelocalization and activation［J］. J Pathol， 2022，256（4）： 414-426.

［19］黃 哲， 蔡朋株， 林 琳， 等. M2型丙酮酸激酶和張力蛋白同源物基因在胃癌及癌旁組織的表達及臨床意義［J］. 中華實驗外科雜志， 2018， 35（4）： 631-633.

［20］WANG C， JIANG J L， JI J， et al. PKM2 promotes cellmigration and inhibits autophagy by mediating PI3K/AKT activation and contributes to the malignantdevelopment of gastric cancer［J］. Sci Rep， 2017， 7（1）：2886.

［21］任 暉， 章 聯， 林曉燕. 小檗堿調節己糖激酶Ⅱ抑制乳腺癌細胞糖酵解的作用研究［J］. 中國藥師， 2017，20（11）： 1945-1949.

［22］王軍華， 陶明華， 王 滕， 等. 敲低己糖激酶2（HK2）抑制乳腺癌細胞增殖并降低其對氟尿嘧啶的耐藥［J］.細胞與分子免疫學雜志， 2021， 37（8）： 722-727.

［23］范炳芝， 王一鑫， 廉霄甜， 等. 三萜類化合物抗病毒的構效關系及其作用機制研究進展［J］. 化工學報， 2020，71（9）： 4071-4101.

[基金項目] 吉林省教育廳科學技術研究項目（JJKH20220069KJ，JJKH20180355KJ）；北華大學省級大學生創新創業訓練計劃項目（202310201135）