NDRG1 過表達對去勢抵抗性前列腺癌耐藥細胞株C4-2/ENZA耐藥性的影響及其機制

［摘 要］ 目的：探討N-myc下游調節基因1（NDRG1） 對去勢抵抗性前列腺癌 （CRPC） 恩雜魯胺 （ENZA） 耐藥的影響，并闡明其作用機制。方法：體外培養人 CRPC C4-2細胞和 ENZA耐藥株C4-2/ENZA 細胞，采用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測C4-2/ENZA 細胞及其親本C4-2 細胞中NDRG1 mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測C4-2/ENZA 細胞及其親本C4-2 細胞中NDRG1、雄激素受體（AR） 和前列腺特異性抗原（PSA） 蛋白表達水平， 以驗證細胞轉染效率。將C4-2/ENZA 細胞分為空白組（正常培養不進行處理）、陰性對照慢病毒（Lv-NC） 組（轉染Lv-NC）、Lv-NDRG1 組（ 轉染Lv-NDRG1）、 Lv-NC+ENZA 組（ 轉染 Lv-NC 后加入 ENZA 處理）、Lv-NDRG1+ENZA 組（轉染Lv-NDRG1 后加入ENZA 處理）、Lv-NDRG1+表皮生長因子（EGF） 組（轉染Lv-NDRG1 后加入EGF 處理） 和Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組（轉染Lv-NDRG1 后加入EGF 和ENZA 處理）。采用噻唑藍（MTT） 法檢測各組細胞半數抑制濃度（IC50）、耐藥指數（RI） 和細胞增殖活性，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，RT-qPCR 法檢測各組細胞中NDRG1 mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組細胞中NDRG1、AR、第213 位絲氨酸磷酸化雄激素受體（p-ARSer213）、第 81 位絲氨酸磷酸化雄激素受體 （p-ARSer81 ） 和PSA蛋白表達水平。 結果：與 C4-2 細胞比較，C4-2/ENZA 細胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 01），AR 和PSA 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）， 提示ENZA 耐藥株C4-2/ENZA 中NDRG1 低表達； 與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組細胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01），提示成功構建NDRG1 基因過表達C4-2/ENZA 耐藥細胞株。MTT 法，與C4-2 細胞比較，C4-2/ENZA 細胞IC50明顯升高（Plt;0. 01）， RI 為17. 78； 與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細胞IC50 明顯降低（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NC 組比較， Lv-NC+EGF 組C4-2/ENZA 細胞IC50 明顯升高（Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1組比較，Lv-NDRG1+EGF 組C4-2/ENZA 細胞IC50明顯升高（Plt;0. 01）。與ENZA 處理前比較，不同濃度ENZA 處理24 h，C4-2 和C4-2/ENZA 細胞增殖活性均逐漸降低（F=223. 80，Plt;0. 01；F=81. 46，Plt;0. 01）。ENZA 處理24 h，與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NC 組比較， Lv-NC+EGF 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）， Lv-NDRG1+EGF 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。選擇10. 000 μmol·L－1 ENZA 和干預24 h 作為后續檢測濃度及時間點。流式細胞術，ENZA 處理24 h，與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）； 與Lv-NC+ENZA 組比較，Lv-NDRG1+ENZA 組細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NDRG1 組比較，Lv-NDRG1+EGF 組細胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01），Lv-NDRG1+ENZA 組細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1+ENZA 組比較，Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組細胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting 法，ENZA 處理24 h，與Lv-NC 組比較，Lv-NDRG1 組細胞中AR 和PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NC 組比較， Lv-NC+EGF 組細胞中AR 和PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1 組比較， Lv-NDRG1+EGF 組細胞中AR 和PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（Plt;0. 01）。結論：NDRG1過表達可降低CRPC對ENZA的耐藥性，其作用機制可能與抑制AR信號轉導有關。

［關鍵詞］ 去勢抵抗性前列腺癌； N-myc 下游調節基因1； 恩雜魯胺； 耐藥性； 雄激素受體

［中圖分類號］ R737.25 ［文獻標志碼］ A

前列腺癌（prostate cancer，PCa） 是全球范圍內最常見的男性惡性腫瘤之一，也是導致男性癌癥死亡的主要因素［1］。研究［2］ 顯示： 2020 年PCa 在男性癌癥中發病率位居第2 位， 占新發癌癥的14. 1%。雄激素剝奪療法是目前臨床治療PCa 的常規方法，通過藥物或手術去勢，并結合雄激素受體拮抗劑恩雜魯胺（enzalumide， ENZA） 降低體內雄激素水平，從而抑制癌癥發展［3-4］。然而，大部分患者均會出現耐藥性， 雄激素受體（androgenreceptor， AR） 轉錄活性恢復甚至增強，導致 PCa發展為去勢抵抗性PCa （castration-resistantprostate cancer， CRPC）， 從而對化療藥物ENZA不敏感， 對患者的治療效果較差。因此， 探討CRPC 耐藥發生的分子機制并尋找逆轉耐藥的靶點具有重要的意義，有助于開發新的治療方法延長患者生存期。N-myc 下游調節基因1 （N-mycdownstream regulatory gene 1， NDRG1） 是NDRG家族成員之一，在大部分腫瘤中發揮抑癌基因的作用， 調控腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲等進程［5-7］。LIM 等［8］ 發現： NDRG1 能夠抑制PCa 細胞中AR信號通路激活從而抑制癌癥發展。郭曉波等［9］ 研究發現： NDRG1 在PCa 細胞PC-3 中低表達，NDRG1 表達上調可逆轉PCa 細胞多西他賽耐藥。但NDRG1 是否可調控AR 信號通路參與CRPC 耐藥目前尚未見報道。因此，本研究探討NDRG1 對CRPC 耐藥的影響， 并闡明其作用機制， 為尋找CRPC 新的治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 細胞、病毒、主要試劑和儀器

人CRPC C4-2細胞（雄激素非依賴性PCa 細胞系） 購自美國ATCC 公司。NDRG1 過表達慢病毒（Lv-NDRG1）及其陰性對照慢病毒（Lv-NC） 購自上海漢恒生物科技有限公司。 ENZA 購自美國Selleck 公司，RPMI-1640 培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 購自美國 Gibco 公司， 噻唑藍［3- （4，5-dimethyl-2-thiazolyl） -2， 5-diphenyl tetrazoliumbromide， MTT］ 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR （real-time florescence quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗人NDRG1 抗體、AR 抗體、第213 位絲氨酸磷酸化雄激素受體（phosphorylated AR atserine 213，p-ARSer213） 抗體、第81 位絲氨酸磷酸化雄激素受體（phosphorylated AR at serine 81，p-ARSer81） 抗體、 前列腺特異性抗原（prostatespecific antigen， PSA） 抗體和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司， 辣根過氧化物酶（horse radishperoxidase， HRP） 標記的山羊抗兔抗體購自美國Affinity 公司。二氧化碳培養箱（型號： MCO-18AC） 購自日本松下公司， 流式細胞儀（型號：Accuri C6） 購自美國BD 公司， 酶標分析儀（型號： AMR-100） 購自杭州奧盛儀器有限公司， 化學發光成像系統（型號：Tanon-5200） 購自上海天能科技有限公司。

1. 2 細胞培養及耐藥細胞株構建

采用 ENZA梯度遞增法逐步誘導獲得耐藥株C4-2/ENZA 細胞。將親本C4-2 細胞置于0、0. 500、1. 000、3. 125、6. 250、12. 500、25. 000、50. 000 和100. 000 μmol·L－1ENZA 的完全培養液中逐步誘導篩選，整個過程持續時間約7 個月。C4-2 細胞及耐藥株C4-2/ENZA細胞使用含10% FBS 的RPMI-1640 培養基置于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養。取對數生長期C4-2和C4-2/ENZA 細胞，以每孔2 500 個細胞的密度接種至 96 孔細胞培養板中， 過夜。分別加入 0、0. 500、1. 000、3. 125、6. 250、12. 500、25. 000、50. 000 和100. 000 μmol·L－1 ENZA 繼續培養24 h。

1. 3 細胞轉染和實驗分組

取對數生長期 C4-2/ENZA 細胞， 按每孔5×106 個細胞的密度接種至6 孔細胞培養板中培養過夜。次日，按病毒感染復數（multiplicity of infection， MOI） =100 加入Lv-NDRG1 （慢病毒滴度為5. 21×108 TU·mL－1） 和Lv-NC （慢病毒滴度為3. 15×108 TU·mL－1），24 h后更換新配制的RPMI-1640 完全培養基繼續培養，感染72 h 后采用RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測細胞轉染效率，收集細胞進行后續實驗。

根據實驗處理方式不同，將C4-2/ENZA 細胞分為空白組（正常培養不進行處理）、Lv-NC 組（轉染Lv-NC）、Lv-NDRG1 組（轉染Lv-NDRG1）、Lv-NC+ENZA 組（轉染Lv-NC 后加入ENZA 處理）、Lv-NDRG1+ENZA 組（轉染Lv-NDRG1 后加入ENZA 處理）、Lv-NDRG1+ 表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF） 組（ 轉染Lv-NDRG1 后加入EGF 處理） 和Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組（轉染Lv-NDRG1 后加入EGF 和ENZA處理）。Lv-NC+ENZA 組和Lv-NDRG1+ENZA 組細胞 NDRG1 基因過表達后聯合 ENZA 處理，ENZA 干預濃度為10 μmol·L－1，干預時間為24 h。Lv-NDRG1+EGF組和Lv-NDRG1+EGF+ENZA組細胞 NDRG1 基因過表達后聯合 ENZA 及100 mg·L－1 雄激素非依賴性受體激動劑EGF處理［10］。

1. 4 MTT 法檢測各組細胞半數抑制濃度（50%inhibitory concentration， IC50）、 耐 藥 指 數（resistance index， RI）和細胞增殖活性

取對數生長期C4-2/ENZA 細胞，以每孔2 500 個細胞的密度接種至96 孔細胞培養板中培養過夜， 慢病毒感染后分別加入不同濃度（0、3. 125、6. 250、12. 500、25. 000、50. 000 和100. 000 μmol·L－1） ENZA 或聯合加入10 μmol·L－1 ENZA 或100 mg·L－1 EGF，另設調零孔（培養基對照）。培養24 h 后提前4 h 取出培養板， 每孔加入10 μL 0. 5% MTT 溶液， 置于培養箱中繼續培養4 h， 棄培養液， 每孔加入100 μL 二甲基亞砜，置于搖床上避光震蕩15 min，采用酶標分析儀檢測波長490 nm處吸光度（ A） 值，計算ENZA 對C4-2和C4-2/ENZA 細胞的IC50、RI 和各組細胞增殖活性。RI=C4-2/ENZA細胞IC50/C4-2細胞IC50；細胞增殖活性= ［（實驗孔A 值－空白孔A 值） / （對照孔A 值－空白孔A 值）］。

1. 5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

取病毒感染后的C4-2/ENZA 細胞，以每孔5×106 個細胞的密度接種至6 孔細胞培養板中培養過夜，分組處理24 h， 收集各組細胞， 加入500 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 重懸， 調整細胞密度至1×106 mL－1， 加入5 μL Annexin Ⅴ -FITC輕輕混勻，后加入10 μL 碘化丙啶染液輕輕混勻，室溫避光20 min 后， 采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率= 凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1. 6 RT-qPCR法檢測各組細胞中NDRG1 mRNA表達水平

分組干預后收集各組細胞，加入預冷PBS 緩沖液清洗2 次，加入TRIzol 溶液于冰上提取總RNA， 采用逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA，使用RT-qPCR 試劑盒檢測細胞中NDRG1mRNA 表達水平。引物序列：GAPDH 上游引物，5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物，5'-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3'； NDRG1上游引物，5'-AGGGTCCCATTCATCTCCCC-3'，下游引物，5'-GCTGTCACCTGCCTAGTCC-3'。反 應 條 件： 95 ℃ 預變性 5 min， 95 ℃ 、 10 s，60 ℃、25 s，共40 個循環。以GAPDH 為內參，采用2—△△Ct法計算NDRG1 mRNA 表達水平。

1. 7 Western blotting法檢測各組細胞中NDRG1、AR、PSA、p-ARSer213 和 p-ARSer81 蛋白表達水平

分組處理后收集各組細胞， 加入預冷PBS 緩沖液清洗2 次，加入裂解液于冰上裂解提取總蛋白，采用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品置于金屬浴上煮沸10 min，每孔取40 μg 蛋白上樣，電泳分離蛋白，采用濕轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上， 室溫封閉1 h， 加入一抗NDRG1 抗體（1∶1 000）、AR 抗體（1∶1 000）、p-ARSer213抗體（1∶ 1 000）、p-ARSer81 抗體（1∶ 1 000）、PSA 抗體（1∶1 000） 和GAPDH 抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST 溶液清洗3 次，加入HRP 標記的二抗（1∶5 000）， 室溫孵育 1 h， TBST 溶液清洗3 次，滴加顯影液，曝光，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 或AR 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 或AR 蛋白條帶灰度值。

1. 8 統計學分析

采用 SPSS 26. 0統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖活性和細胞凋亡率，各組細胞中NDRG1 mRNA 表達水平及各組細胞中NDRG1、PSA 和AR 蛋白表達水平以及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均符合正態分布，以- x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組細胞轉染效率

RT-qPCR法檢測結果顯示：與C4-2 細胞（1. 00±0. 03） 比較，C4-2/ENZA細胞中NDRG1 mRNA 表達水平（0. 11±0. 03） 明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測結果顯示： 與 C4-2 細 胞 比 較， C4-2/ENZA 細 胞 中NDRG1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01），AR 和PSA 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。提示ENZA 耐藥株C4-2/ENZA 中NDRG1 低表達。見圖1。

與空白組比較，Lv-NC 組C4-2/ENZA 細胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達水平差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組細胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。提示成功構建NDRG1 基因過表達C4-2/ENZA 耐藥細胞株。見圖2 和3。

2. 2 各組細胞 IC50、RI和細胞增殖活性

與 C4-2細胞（2. 16 μmol·L－1±0. 37 μmol·L－1） 比較，C4-2/ENZA 細胞IC50 （38. 40 μmol·L－1±6. 31 μmo·l L－1）明顯升高（Plt;0. 01）， RI=17. 78。與空白組（39. 73 μmol·L－1±5. 70 μmol·L－1） 比較， Lv-NC組 C4-2/ENZA 細 胞 IC50 （36. 14 μmol·L－1 ±6. 04 μmol·L－1） 差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；與Lv-NC 組比較，Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細胞IC50 （11. 13 μmol·L－1±0. 42 μmol·L－1） 明顯降低（Plt;0. 01）。 EGF 處 理 24 h， 與 Lv-NC 組（37. 76 μmol·L－1±3. 66 μmol·L－1） 比較，Lv-NC+EGF 組 C4-2/ENZA 細胞 IC50 （49. 81 μmol·L－1±4. 07 μmo·l L－1） 明顯升高（ Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1組（10. 57 μ mol·L － 1 ± 0. 33 μ mol·L － 1） 比 較，Lv-NDRG1+EGF 組C4-2/ENZA 細胞IC50（20. 16 μmol·L－1 ± 3. 24 μmol·L－1） 明 顯 升 高（Plt;0. 01）。

與 ENZA 處理前比較，不同濃度 ENZA 處理24 h，C4-2 和C4-2/ENZA 細胞增殖活性均逐漸降低（F=223. 80， Plt;0. 01； F=81. 46， Plt;0. 01）。ENZA 處理24 h， 與空白組比較， Lv-NC 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；與Lv-NC 組比較，Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h，與Lv-NC 組比較，Lv-NC+EGF 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）， Lv-NDRG+EGF 組C4-2/ENZA 細胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。根據Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細胞的IC50， 選擇10. 000 μmol·L－1 ENZA 和干預24 h 作為后續檢測濃度及時間點。見圖4。

2. 3 各組細胞凋亡率

ENZA 處理 24 h，與 Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組和Lv-NC+ENZA 組細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）； 與Lv-NC+ENZA 組比較，Lv-NDRG1+ENZA 組細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）。見圖5 和6。EGF 處理24 h，與Lv-NDRG1 組比較， Lv-NDRG1+EGF 組細胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01），Lv-NDRG1+ENZA組細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）； 與Lv-NDRG1 + ENZA 組 比 較， Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組細胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01）。見圖7 和8。

2. 4 各組細胞中AR、PSA、p-ARSer213和p-ARSer81蛋白表達水平

ENZA 處理 24 h，與空白組比較，Lv-NC 組細胞中 AR 和 PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值差異均無統計 學 意 義（Pgt;0. 05）； 與 Lv-NC 組 比 較，Lv-NDRG1 組細胞中 AR 和 PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。提示NDRG1 過表達可抑制 C4-2/ENZA 細胞中 AR 通路的活化。見圖9。EGF 處理24 h，與Lv-NC 組比較，Lv-NC+EGF 組細胞中AR 和PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1 組比較，Lv-NDRG1+EGF 組細胞中AR 和PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（ Plt;0. 01 ）。見圖10。

3 討 論

腫瘤耐藥機制是腫瘤細胞通過調控基因表達或改變藥物在腫瘤細胞中的分布和利用度而發生的一系列病理變化［11］。識別ENZA 影響的基因并評價其作為治療CRPC 靶點的作用具有重要的臨床意義。研究［12-13］ 報道： 基因的異常表達與 CRPC 的發展及ENZA 耐藥有密切關聯。番茄紅素通過蛋白激酶B （protein kinase B， AKT） /Zeste 增強子同源物2 （enhancer of Zeste homolog 2，EZH2） /AR信號通路增強CRPC 細胞對ENZA 的敏感性［14］。研究［15］ 發現： 敲低SOX8 通過靶向抑制Notch 信號通路逆轉CRPC 細胞的ENZA 耐藥。但目前關于NDRG1 是否參與了CRPC ENZA 耐藥機制的研究尚未見報道。

NDRG1 是NDRG 家族成員之一，參與調控腫瘤細胞增殖、凋亡和耐藥等進程，并在多種腫瘤中發揮抗癌作用。王蓓等［16］ 發現： NDRG1 在人卵巢癌細胞中表達下調，上調NDRG1 可抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，抑制腫瘤發展。崔喆等［17］ 研究發現：在結腸癌細胞中，NDRG1 通過上調抑癌基因p53 表達抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡，進而提高化療敏感性并抑制腫瘤進展。YANG 等［18］發現：NDRG1 可以增強西妥昔單抗在結直腸癌細胞系中的敏感性。本研究結果顯示：與CRPC 親本C4-2 細胞比較， 耐藥株C4-2/ENZA 細胞IC50 明顯升高， 細胞中NDRG1、AR 和PSA 蛋白表達水平明顯降低； 過表達NDRG1 可抑制C4-2/ENZA 細胞中AR 信號通路活化，降低細胞IC50，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，并提高細胞對ENZA 的敏感性， 提示NDRG1 參與了C4-2/ENZA 細胞耐藥過程，與上述其他腫瘤中有關NDRG1 的研究結果一致。但 NDRG1 是否通過調控 AR 信號通路影響C4-2/ENZA 耐藥性尚未完全闡明。

AR 是屬于核受體超家族中的類固醇受體，參與調控細胞生長、增殖、死亡和蛋白質合成等進程［19］。 AR 是腫瘤發生、 發展的關鍵因子， 是目前被廣泛發現治療癌癥的靶點之一［20-21］。研究［22］顯示： AR 異常表達被認為是腫瘤耐藥的主要因素。AR 在乳腺癌耐藥株細胞中表達上調，而下調其表達可促進細胞凋亡并抑制癌細胞耐藥。在CRPC 中， 長鏈非編碼 RNA （long noncodingRNA， lncRNA） NXTAR 可抑制AR 表達， 降低癌細胞ENZA 耐藥［23］。研究［24-25］ 顯示：EGF 是雄激素非依賴性AR 激活的關鍵因子，可通過激活下游磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase， PI3K） /AKT 信號通路促進AR 轉錄活性和CRPC 發展。本研究結果顯示：聯合EGF 處理后，細胞中AR 和PSA 蛋白表達水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均升高，提示EGF 處理可激活AR 信號轉導， 這與HSIEH 等［26］ 研究結果一致。進一步研究結果顯示： EGF 處理NDRG1 過表達的C4-2/ENZA 細胞，可增強細胞增殖活性，升高細胞IC50， 降低細胞凋亡率， 提示EGF 可通過激活AR 信號轉導逆轉NDRG1 對C4-2/ENZA 細胞增殖抑制和凋亡促進作用，提高細胞耐藥性。

綜上所述，NDRG1 在C4-2 細胞ENZA 耐藥中起著關鍵作用，能夠抑制AR 通路逆轉CRPC 耐藥細胞株C4-2/ENZA 對ENZA 的耐藥性。NDRG1可能是CRPC 患者有效的治療靶點和預后監測指標。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張鷹和萬朝輝參與論文設計、撰寫及修改，張鷹和蔣先訓參與實驗設計、實驗數據獲取及分析。

[參考文獻]

［1］ SEKHOACHA M， RIET K， MOTLOUNG P， et al.Prostate cancer review： genetics， diagnosis， treatmentoptions， and alternative approaches ［J］. Molecules，2022， 27（17）： 5730.

［2］ SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Globalcancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates ofincidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-249.

［3］ LIU J Z， DONG L， ZHU Y J， et al. Prostate cancertreatment - China’s perspective［J］. Cancer Lett， 2022，550： 215927.

［4］ RITCH C， COOKSON M. Recent trends in themanagement of advanced prostate cancer［J］. F1000Res，2018， 7.DOI：10.12688/f1000vesearch.15382.1.

［5］ HE Y X， SHEN H， JI Y Z， et al. N-myc downstreamregulated gene 1 inhibition of tumor progression in Caco2cells［J］. World J Gastrointest Oncol， 2022， 14（12）：2313-2328.

［6］ VILLODRE E S， HU X D， ECKHARDT B L， et al.NDRG1 in aggressive breast cancer progression andbrain metastasis［J］. J Natl Cancer Inst， 2022， 114（4）：579-591.

［7］ MAO M S， JIA Y L， CHEN Y X， et al. HJURPregulates cell proliferation and chemo-resistance viaYAP1/NDRG1 transcriptional axis in triple-negativebreast cancer［J］. Cell Death Dis， 2022， 13（4）： 396.

［8］ LIM S C， GELETA B， MALEKI S， et al. Themetastasis suppressor NDRG1 directly regulatesandrogen receptor signaling in prostate cancer［J］. J BiolChem， 2021， 297（6）： 101414.

［9］ 郭曉波， 李 崗， 趙宇峰， 等. 長非編碼RNA linc00641通過調節miR-362-5p/NDRG1逆轉前列腺癌細胞多西他賽耐藥的研究［J］. 沈陽藥科大學學報， 2022， 39（6）：703-708.

［10］楊嘉昕， 夏 僮， 周駟杰， 等. 雙氫青蒿素對前列腺癌PC-3 細胞自噬的誘導作用及其機制［J］. 解放軍醫學雜志， 2023， 48（6）： 676-685.

［11］李 芳， 蔣妮諺含， 柳文潔， 等. 腫瘤耐藥發生機制的研究進展［J］. 腫瘤藥學， 2018， 8（3）： 307-312.

［12］NGUYEN D T， YANG W ， RENGANATHAN A，et al. Acetylated HOXB13 regulated super enhancer genesdefine therapeutic vulnerabilities of castration-resistantprostate cancer［J］. Clin Cancer Res， 2022， 28（18）：4131-4145.

［13］DUTTA S， POLAVARAM N S， ISLAM R， et al.Neuropilin-2 regulates androgen-receptor transcriptionalactivity in advanced prostate cancer ［J］. Oncogene，2022， 41（30）： 3747-3760.

［14］CHEN X， YANG G， LIU M， et al. Lycopene enhancesthe sensitivity of castration-resistant prostate cancer toenzalutamide through the AKT/EZH2/androgenreceptor signaling pathway［J］. Biochem Biophys ResCommun， 2022， 613： 53-60.

［15］DU Z B， CHEN X B， ZHU P Y， et al. SOX8knockdown overcomes enzalutamide resistance incastration-resistant prostate cancer by inhibiting theNotch signaling pathway［J］. Biomed Res Int， 2022，2022： 9235837.

［16］王 蓓， 代聰偉， 李 娜， 等. 上調NDRG1基因對人卵巢癌OVCAR3細胞周期和凋亡的影響［J］. 中國老年學雜志， 2021， 41（14）： 3045-3049.

［17］崔 喆， 商 震， 谷 樂， 等. 上調NDRG1表達降低奧沙利鉑耐藥結腸癌細胞的存活率［J］. 實用藥物與臨床，2020， 23（4）： 289-293.

［18］YANG G， HUANG L， JIA H T， et al. NDRG1enhances the sensitivity of cetuximab by modulatingEGFR trafficking in colorectal cancer［J］. Oncogene，2021， 40（41）： 5993-6006.

［19］ANESTIS A， ZOI I， PAPAVASSILIOU A G， et al.Androgen receptor in breast cancer-clinical andpreclinical research insights［J］. Molecules， 2020，25（2）： 358.

［20］PLATA BELLO A， TAMAYO JOVER M A，GUTIERREZ NICOLAS F， et al. Biomarkers forcharacterization and therapeutic orientation in castrationresistantprostate cancer［J］. Arch Esp Urol， 2022，75（2）： 195-202.

［21］KHAN A， MAO Y S， TAHREEM S， et al. Structuraland molecular insights into the mechanism of resistanceto enzalutamide by the clinical mutants in androgenreceptor （AR） in castration-resistant prostate cancer（CRPC） patients［J］. Int J Biol Macromol， 2022， 218：856-865.

［22］孫 紅， 侯佳林， 蔡加琴， 等. SUMO E3連接酶介導雄激素受體的轉錄促進乳腺癌他莫昔芬耐藥［J］. 中國臨床藥理學與治療學， 2021， 26（3）： 285-291.

［23］GHILDIYAL R， SAWANT M， RENGANATHAN A，et al. Loss of long noncoding RNA NXTAR in prostatecancer augments androgen receptor expression andenzalutamide resistance［J］. Cancer Res， 2022， 82（1）：155-168.

［24］BONACCORSI L， MURATORI M， CARLONI V，et al. The androgen receptor associates with the epidermalgrowth factor receptor in androgen-sensitive prostatecancer cells［J］. Steroids， 2004， 69（8/9）： 549-552.

［25］SHORNING B Y， DASS M S， SMALLEY M J， et al.The PI3K-AKT-mTOR pathway and prostate cancer：At the crossroads of AR， MAPK， and WNTsignaling［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（12）： 4507.

［26］HSIEH T F， CHEN C C， MA W L， et al. Epidermalgrowth factor enhances androgen receptor-mediatedbladder cancer progression and invasion via potentiationof AR transactivation［J］. Oncol Rep， 2013， 30（6）：2917-2922.

[基金項目] 湖南省衛健委衛生科研項目（D202304058812，D202213014836）