基于生活方式與肝膽惡性腫瘤發生發展因果關系的孟德爾隨機化研究

［摘 要］ 目的：探討使用孟德爾隨機化研究方法分析生活方式與肝膽惡性腫瘤發生發展的因果關系，為肝膽惡性腫瘤預防和治療提供潛在臨床證據。方法：納入相互獨立的大規模全基因組關聯研究（GWAS） 匯總數據，設定七步納入標準進行工具變量篩選。暴露的生活方式包括飲食中碳水化合物攝入百分率、脂肪攝入百分率、蛋白質攝入百分率、咖啡攝入量、每周飲酒次數、閑暇時電子屏幕接觸時間、閑暇時中高強度體育運動（MVPA）、工作時的久坐行為、首次吸煙年齡、每日吸煙數量、目前吸煙狀態和既往吸煙狀態共12 種表型。采用逆方差加權法（IVW） 的隨機效應模型作為主分析方法，采用Cochrane’s Q檢驗評估異質性，采用MR-Egger截距法檢驗水平多效性。結果：目前吸煙狀態與易患肝外膽管癌呈顯著因果關系（OR=1. 607，95%CI：1. 113～2. 322，P=0. 011）。咖啡攝入量較高與患肝癌及肝內膽管癌的較高風險有顯著因果關系（OR=1. 000，95%CI：0. 999～1. 000，P=0. 012）。在體育活動中， 較多的MVPA 與患肝癌及肝內膽管癌的較低風險具有顯著因果關系（OR=0. 998，95%CI： 0. 996～0. 999，P=0. 002）。Cochrane’s Q 檢驗提示MVPA 與肝外膽管癌（Q=18. 354， P=0. 049） 和蛋白質攝入百分率與肝癌及肝內膽管癌（Q=12. 715， P=0. 026） 具有輕度異質性，MR-Egger截距法顯示本研究無水平多效性。結論：目前吸煙狀態與患肝外膽管癌的高風險具有因果關系，較多的MVPA 與患肝癌及肝內膽管癌的較低風險具有因果關系。對患者進行適當的戒煙勸導和體育運動教育可能會為預防肝膽惡性腫瘤提供潛在益處。

［關鍵詞］ 生活方式； 肝內膽管腫瘤； 膽管腫瘤； 肝腫瘤； 孟德爾隨機化研究

［中圖分類號］ R735 ［文獻標志碼］ A

肝膽惡性腫瘤是一類進展迅猛且發病隱匿的惡性腫瘤，根據其解剖位置，可分為位于肝內的肝細胞癌和肝內膽管癌、位于肝外的肝外膽管癌及肝門部膽管癌［1］。目前， 肝膽惡性腫瘤的病因尚不明確， 對其發生和進展分子機制的研究較少［2］。因此，了解其病因，對其進行預防，能夠極大地減少患者痛苦。近年來，許多肝膽惡性腫瘤的危險因素被逐漸發現，包括病毒感染、肝吸蟲感染、酒精性肝病、肥胖、糖尿病、黃曲霉素暴露、非酒精性脂肪性肝病和生活方式等［3-5］。隨著流行病學和營養學的發展和進步，生活方式對于疾病的影響逐漸被重視。研究［6-11］ 顯示：飲食構成、抽煙、飲酒和體育活動等生活方式均與肝膽惡性腫瘤的發生發展存在關聯。但生活方式和肝膽惡性腫瘤發生的因果關系尚未完全闡明。生活方式作為一種日常活動和行為習慣，需要較長時間才能夠對人體和疾病的發生發展產生作用。常規的隨機對照試驗成本高昂，也較難為其因果關系提供證據。隨著DNA 測序技術的進一步發展和成本的降低， 全基因組關聯分析（genome-wide association studies， GWAS） 可以探索個體全基因組中遺傳多態性與疾病的關系［12］。孟德爾隨機化作為一種新型的流行病學研究方法，以孟德爾第二遺傳定律為原理，以 GWAS 為數據基礎， 逐漸被應用于探索暴露與表型因果關系方面的研究［13］。 由于基因在受精卵形成時的隨機性和基因多態性自由組合的時序性，基于樣本量較大的GWAS 數據能夠探索基因多態性所對應表型之間的因果關系和使用較低的成本提供較高等級的臨床證據，減少結果偏倚，為臨床工作提供潛在的信息。近年來， 國內外研究［14-18］ 使用孟德爾隨機化探索糖尿病、肥胖、骨關節炎和腦卒中等多種疾病發生的因果關系。目前關于生活方式和肝膽惡性腫瘤相關關系的研究報道較少，本研究通過兩樣本孟德爾隨機化研究方法，探索最常見的生活方式，包括飲食構成、咖啡攝入、飲酒、日常身體活動和吸煙等與肝膽惡性腫瘤發生發展的因果關系，為肝膽惡性腫瘤的預防和治療提供參考。

1 資料與方法

1. 1 研究設計

本研究遵循孟德爾隨機化研究設計的報告規范（Strengthening the Reporting ofObservational Studies in Epidemiology-MendelianRandomization，STROBE-MR）［19］。試驗設計暴露因素為12 種生活方式表型， 包括飲食中碳水化合物攝入百分率、脂肪攝入百分率、蛋白質攝入百分率、咖啡攝入量、每周飲酒次數、閑暇時電子屏幕接觸時間、閑暇時中高強度體育運動（moderateto vigorous intensity physical activity， MVPA）、工作時的久坐行為（久坐工作或非久坐工作）、首次吸煙年齡、每日吸煙數量、目前吸煙狀態和既往吸煙狀態。暴露的GWAS 樣本量為33 355～848 460 例， 均來源于歐洲血統的 GWAS 薈萃分析， 以保證和結局的隊列相互獨立。具體各隊列的研究設計可通過PubMed ID 進行查詢。本研究暴露的生活方式表型定義、數據來源PubMed ID 和樣本量見表1 。根據腫瘤解剖位置， 肝外膽管癌、肝癌和肝內膽管癌等肝膽惡性腫瘤被定為本研究的結局。 肝外膽管癌的 GWAS 數據來源于一項匯總分析［20］， 其樣本量為 635 710 例，數據庫 ID 為 GCST90018803； 肝癌和肝內膽管癌的 GWAS 數據來源于英國生物銀行， 樣本量為 372 366 例， 英國生物銀行數據庫 ID 為ieu-b-4915。

1. 2 工具變量篩選

孟德爾隨機化研究包括 3項假設：①相關性假設，作為工具變量的遺傳變異與暴露有關；②獨立性假設，遺傳變異與目標結果無共同的混雜因素；③排斥性假設，除暴露外，遺傳變異與結果之間無獨立的因果途徑。為了滿足孟德爾隨機化三大假設，本研究設定嚴格的七步工具變量篩選步驟。首先，為滿足相關性假設，工具變量與暴露顯著強相關，根據GWAS 匯總數據的原始研究設定了單核苷酸多態性（single nucleotidepolymorphism， SNP） 與暴露相關性P 值的閾值，以代表工具變量與暴露的相關性，閾值越小，相關性越強。為保證每一項暴露均可獲得足夠的工具變量，需選擇不同的閾值，對于飲食（碳水化合物、脂肪和蛋白質攝入百分率）， 閾值設定為5×10－5 ［21］；對于咖啡攝入量和吸煙（首次吸煙年齡、每日吸煙數量、目前吸煙狀態和既往吸煙狀態） 及每周飲酒次數，SNP 與暴露相關性P 值的閾值設定為5×10－6 ［22-23］； 對于身體活動（閑暇時電子屏幕接觸時間、閑暇時MVPA 和工作時的久坐行為），SNP 與暴露相關性P 值的閾值設定為5×10－8 ［24］。第二步，為了避免連鎖不平衡效應，基因座位點間物理距離lt;10 000 kb范圍內且相關系數（r2） ≥0. 001的SNP 被排除。在DNA 序列中，距離較近的SNP在減數分裂及受精卵形成過程中合并組合， 導致假隨機效應的產生， 將基因座位點間物理距離lt;10 000 kb 范圍內且r2≥0. 001 的SNP 排除可降低該效應。體質量指數（body mass index， BMI） 是膽管相關腫瘤的一個重要危險因素。為了滿足孟德爾隨機化的第二大假設，即工具變量與混雜因素無關， 本研究設計第三步和第四步工具變量篩選步驟， 刪除了各個生活方式暴露中重復的SNP 和與BMI 相關的SNP。第五步進行生活方式暴露與結局的對應， 排除在結局中不存在的SNP。為了滿足假設三， 第六步中排除了與結局相關的SNP。最后進行孟德爾隨機化多態性個數總和與離群值（Mendelian Randomization Pleiotropy RESidualSum and Outlier，MR-PRESSO） 檢驗，剔除了SNP中的離群值。為了評價工具變量的預測強度，計算工具變量的F 值和R2 值，F 值用于評估暴露相關的SNP 的遺傳效力， R2 用于評價該工具變量對于結局的解釋程度［25］。

1. 3 統 計 學 分 析

采 用 R 4. 2. 1 軟 件 及TwoSampleMR” 包和“forestplot” 包進行數據分析和可視化。采用逆方差加權法（inverse varianceweighted， IVW） 的隨機效應模型作為主分析方法， 可保證結果的假陽性率較低［26］。采用加權中位數法和MR-Egge 回歸法進行數據分析， 并對IVW 隨機效應模型進行敏感性分析， 采用Cochrane’s Q 檢驗法對SNP 進行異質性檢驗，MR-PRESSO 法剔除帶有異質性的SNP， MREgger截距法檢驗水平多效性。以 Plt;0. 05 為差異有統計學意義。 為減少多次測量產生的數據偏倚， 采用 Bonferroni 校正法調整 P 值， 共進行了 24 次校正， 最終以 Plt;0. 002 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 工具變量篩選

283個SNPs用于探索生活方式與肝外膽管癌的因果關系，同時234 個SNPs 用于探索生活方式與肝癌和肝內膽管癌的因果關系。所有的工具變量F 值均gt;10，表明納入的SNPs 具有較高較好的預測強度，不受弱工具變量的影響。見表2。

2. 2 生活方式與肝外膽管癌的因果關系

在肝外膽管癌與吸煙的關系中，目前吸煙狀態與易患肝外膽管癌呈顯著因果關系（OR=1. 607， 95%CI：1. 113～2. 322，P=0. 011），首次吸煙年齡（OR=1. 239，95%CI：0. 528～2. 905，P=0. 622）、每日吸煙數量（OR=1. 351， 95%CI： 0. 703～2. 599，P=0. 367） 和既往吸煙狀態（OR=1. 383，95%CI：0. 987～1. 938，P=0. 059） 與患肝外膽管癌的風險無因果關系。飲食中碳水化合物攝入百分率（OR=1. 004， 95%CI： 0. 917～1. 099， P=0. 931）、脂肪攝入百分率（OR=0. 927， 95%CI：0. 766～1. 121， P=0. 433）、蛋白質攝入百分率（OR=1. 044，95%CI：0. 822～1. 325，P=0. 727）、咖啡攝入量（OR=1. 010，95%CI：0. 980～1. 040，P=0. 522）、每周飲酒次數（OR=0. 984，95%CI：0. 336～2. 876， P=0. 976）、閑暇時電子屏幕接觸時間（OR=0. 970， 95%CI： 0. 644～1. 462， P=0. 886）、MVPA （OR=0. 306， 95%CI： 0. 062～1. 503， P=0. 145） 和工作時的久坐行為（OR=1. 234， 95%CI： 0. 535～2. 845， P=0. 622） 與患肝外膽管癌的風險無因果關系。見圖1。

2. 3 生活方式與肝癌及肝內膽管癌因果關系

飲食中碳水化合物攝入百分率（OR=1. 000，95%CI：0. 999～1. 001，P=0. 480）、脂肪攝入百分率（OR=1. 000，95%CI：0. 999～1. 001，P=0. 073）、蛋白質攝入百分率（OR=1. 000，95%CI：0. 999～1. 001，P=0. 519） 和每周飲酒次數（OR=0. 925，95%CI：0. 998～1. 002，P=0. 925） 均與患肝癌及肝內膽管癌的風險無因果關系。咖啡攝入量與患肝癌及肝內膽管癌的較高風險具有顯著因果關系（OR=1. 000，95%CI： 0. 999～1. 000， P=0. 012）。在身體活動中， MVPA 與患肝癌及肝內膽管癌的較低風險具有顯著因果關系（OR=0. 998， 95%CI： 0. 996～0. 999， P=0. 002）， 閑暇時電子屏幕接觸時間（OR=1. 000，95%CI：0. 999～1. 001，P=0. 408）和工作時的久坐行為（OR=1. 000， 95%CI：0. 999～1. 002，P=0. 667） 與患肝癌及肝內膽管癌的風險無因果關系。首次吸煙年齡（OR=1. 000，95%CI： 0. 998～1. 002， P=0. 871）、每日吸煙數量（OR=1. 001， 95%CI： 1. 000～1. 002， P=0. 244）、既往吸煙狀態（OR=1. 001， 95%CI：1. 000～1. 002，P=0. 152） 和目前吸煙狀態（OR=1. 000， 95%CI： 0. 999～1. 001， P=0. 785） 均與患肝癌及肝內膽管癌的風險無因果關系。見圖2。

2. 4 敏感性分析

敏感性分析結果顯示：本研究具有較好的穩定性。 Cochrane’s Q 檢 驗 中，MVPA 與肝外膽管癌（Q=18. 354， P=0. 049）和蛋白質攝入百分率與肝癌及肝內膽管癌（Q=12. 715，P=0. 026） 具有輕度異質性。 多效性分析中， MR-Egger 截距法檢驗結果顯示：本研究無水平多效應， 所有 P 值均 gt;0. 05。見表3。

3 討 論

既往觀察性研究［6-11］ 主要分析生活方式與肝膽惡性腫瘤發生發展的關聯性，對于二者之間的因果關系的研究較少。生活方式作為日常生活中常見的暴露因素，分析其與肝膽惡性腫瘤發生發展的因果關系，并為調控日常生活方式對疾病的發生發展提供較高等級的臨床證據，有利于減少肝膽惡性腫瘤的發生率，減少患者和社會的負擔。

本研究采用IVW 隨機效應模型分析生活方式與肝膽惡性腫瘤的因果關系。IVW 模型要求遺傳變異對結果變量的影響預估準確，確保不同遺傳變異之間相互獨立，以避免相關性引入估計的偏差，并且需要保證結果變量測量準確以獲取準確的預估結果。

本研究結果顯示： 僅較多的MVPA 與較低患肝癌及肝內膽管癌的風險有因果關系。研究［27］ 顯示：每周較高頻率的劇烈體育運動與肝細胞癌有顯著相關關系，與肝外細胞癌無相關性。因此，適當進行較多的MVPA 可能會降低患肝癌和肝內膽管癌的風險， 但這一效應可能在肝外膽管癌中并不明顯。

既往隊列研究［11］ 顯示：吸煙和飲酒與肝膽惡性腫瘤的發生有密切關聯。薈萃分析研究［28］ 發現：既往吸煙和目前吸煙狀態均與肝外膽管癌發生的高風險有關，目前吸煙狀態與肝內膽管癌有關，而飲酒僅與肝內膽管癌具有相關性。前瞻性研究［29］ 也得出了類似的結論，酒精與肝內膽管癌無相關性，但目前吸煙狀態與肝內膽管癌發生的高風險具有相關性。本研究結果顯示：目前吸煙狀態與易患肝外膽管癌呈顯著因果關系。提示目前吸煙狀態與肝外膽管癌發生的高風險具有相關性，因此制定適當的健康指導措施和戒煙教育具有潛在降低肝外膽管癌發生的作用。

飲食構成與肝膽惡性腫瘤發生的關系中，高碳水化合物飲食會促進全身代謝和腸道生態失調及慢性炎癥， 進而影響肝膽惡性腫瘤的發生發展［30］。然而，關于飲食構成與肝膽惡性腫瘤的相關性研究結果存在矛盾。 研究［31］ 顯示： 較高的紅肉攝入和較低的谷物、茶葉及膳食纖維攝入與肝癌發生的風險升高有顯著相關關系。但日本的一項隊列研究［32］ 結果顯示：飲食構成與肝膽惡性腫瘤的相關性并不明顯。本研究結果顯示：碳水化合物、脂肪和蛋白質3 種主要營養素的攝入百分率與患肝膽惡性腫瘤的風險均無因果關系。

咖啡攝入量與肝膽惡性腫瘤之間的關系同樣存在爭議。一項隊列研究［33］ 結果顯示：咖啡攝入量與肝外膽管癌無關聯。但另一項多中心隊列研究［34］ 發現： 咖啡攝入量與肝內膽管癌無相關性，但高咖啡攝入量與降低肝細胞癌的患病風險具有顯著相關性。咖啡中的綠原酸能夠通過其抗氧化作用，減少癌細胞凋亡和DNA 損傷，起到潛在的癌細胞保護作用［35］。本研究結果顯示： 咖啡攝入量與肝癌及肝內細胞癌具有因果關系，但咖啡攝入量較高可能會增加患癌風險， 與既往研究［33-34］ 結果相矛盾。咖啡攝入量在肝膽惡性腫瘤中的具體作用仍需要進一步確認。

本研究具有一定的局限性：①研究基于的數據庫均來源于歐洲，以歐洲血統樣本為主，種族的單一性可能會引起結果偏倚；②本研究部分分析存在一定的異質性，但異質性均較為輕微，且在本研究中使用了隨機效應模型進行統計分析，更加保守的模型能夠減少異質性所引起的結果偏倚；③本研究采用的生活方式需要長時間的暴露才能對結果產生影響， 但SNPs 的測量常常是在某一時間點進行，因此可能會引起結果偏倚。

綜上所述， 基于大樣本量的GWAS 分析， 孟德爾隨機化研究方法仍能夠提供較強的臨床證據，規避隨機對照試驗的大成本，為患者的臨床決策提供更加系統和科學的循證醫學證據。目前吸煙狀態與患肝外膽管癌的高風險具有顯著因果關系，較多的MVPA 與患肝癌及肝內膽管癌的較低風險具有顯著因果關系。因此，對患者進行適當的戒煙勸導和體育運動教育對肝膽惡性腫瘤發病具有潛在的預防作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉華青參與論文設計、撰寫和修改，陳慶凱、陳永新、邱潤昊、丁緒鵬、宋奉京、王巖和王葆林參與實驗數據的獲取和分析，曹宏參與實驗設計。

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[基金項目] 吉林省教育廳科學技術研究項目（JJKH20211062KJ）