二十碳五烯酸通過調節Nrf2通路抑制脂多糖誘導腎小球系膜細胞焦亡

［摘要］ 目的： 以核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）蛋白為切入點，基于Nrf2/NLRP3/GSDMD信號通路探究二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導腎小球系膜細胞焦亡的調控作用，結合Nrf2激動劑（4-OI）、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor protein 3，NLRP3）受體抑制劑（MCC950）探究EPA調控焦亡信號通路的機制。方法： LPS體外誘導腎小球系膜細胞（HBZY-1）焦亡模型，并根據不同藥物處理分別設置空白對照組、LPS組、LPS+EPA組、LPS+EPA+4-OI組和LPS+EPA+MCC950組，其中LPS濃度為10 μg/mL，EPA、4-OI和MCC950的濃度均為200 μmol/L，按分組將藥物同時加入培養板中處理48 h，利用CCK-8法、乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗、TUNEL染色檢測細胞損傷，ELISA檢測細胞上清液中炎癥因子IL-1β、IL-18釋放量，蛋白免疫印跡法檢測Nrf2、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平。結果： LPS與EPA共處理HBZY-1細胞的細胞活力實驗表明，10 μg/mL LPS刺激48 h顯著降低了細胞活力（Plt;0.05），但20～200 μmol/L EPA對其有明顯的保護作用（Plt;0.05）。采用200 μmol/L EPA進行后續實驗發現，EPA可明顯保護LPS造成的細胞損傷（Plt;0.01），減少炎性因子（Plt;0.01）、LDH的釋放（Plt;0.01）和DNA的斷裂并抑制焦亡信號通路的激活，促進Nrf2蛋白的表達（Plt;0.01）。結合4-OI、MCC950共處理發現4-OI可以促進EPA對焦亡的抑制作用（Plt;0.05），減少相關蛋白的表達以及因子的釋放（Plt;0.05），并增強EPA對細胞的保護（Plt;0.01），而MCC950對EPA發揮的作用無顯著影響。結論： EPA通過Nrf2抑制LPS誘導的HBZY-1細胞焦亡信號通路各分子的表達，發揮細胞保護作用。

［關鍵詞］ 二十碳五烯酸；焦亡；細胞損傷；核因子E2相關因子2（Nrf2）

［中圖分類號］ R692.6" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2024）04-0277-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230096

［引用格式］李潔，馮燁，陸慶雪，等. 二十碳五烯酸通過調節Nrf2通路抑制脂多糖誘導腎小球系膜細胞焦亡［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（4）： 277-282.

［作者簡介］李潔（1982—），女，碩士研究生；馮燁（通訊作者），主治醫師，E-mail： Fengye1101@outlook.com

Eicosapentaenoic acid inhibited lipopolysaccharide-induced mesangial cell pyroptosis by regulating Nrf2 pathway

LI Jie， FENG Ye， LU Qingxue， LIANG Junmeng

（Department of Rheumatology， Minzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Nanning 53000 China）

［Abstract］ Objective： To explore the regulatory effect of eicosapentaenoic acid （EPA） on lipopolysaccharide （LPS）-induced HBZY-1 cell pyroptosis based on the Nrf2/NLRP3/GSDMD signaling pathway. Additionally， nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2） agonist （4-OI） and nucleotide-bound oligomerized domain-like receptors （NLRP3） receptor inhibitor （MCC950） were chosen to explore the regulating mechanism of EPA on Nrf2. Methods： According to different drug treatments strategy， HBZY-1 cells were divided into five groups： control group， LPS group， LPS+EPA group， LPS+EPA+4-OI group， and LPS+EPA+MCC950 group， in which 10 μg/mL LPS was applied to induce the cell pyroptosis in vitro， and the concentration of EPA， 4-OI， MCC950 was all 200 μmol/L， the drugs were added to the culture plate and treated for 48 h. In addition， CCK-8 assay， LDH release test， and TUNEL staining were performed to detect cell damage. The release of inflammatory factors IL-1β and IL-18 in the cell supernatant were detected by ELISA kits， protein levels of Nrf NLRP3， Caspase-1 and GSDMD were detected by Western Blotting. Results： Cell viability assay showed that 10 μg/mL LPS stimulation for 48 hours significantly reduced the cell viability （Plt;0.05）， but 20-200 μmol/L EPA had significantly protective effects （Plt;0.05）. Moreover， 200 μmol/L EPA significantly attenuated the cell damage caused by LPS （Plt;0.01）， reduced the release of inflammatory factors （Plt;0.01）， LDH release （Plt;0.01） and DNA fragmentation， inhibited the activation of the pyroptosis， and promoted the expression of Nrf2 protein （Plt;0.01）. In addition， co-treatment with 4-OI and MCC950 found that 4-OI can promote the inhibitory effect of EPA on pyroptosis （Plt;0.05）， reduce the expression of related proteins and the release of IL-1β and IL-18 （Plt;0.05）， and enhance the protection effect of EPA （Plt;0.01）， while MCC950 has no significant on the effect of EPA. Conclusion： EPA inhibits the expression of various molecules in the pyroptosis of HBZY-1 cells induced by LPS through Nrf and exerts a significant cytoprotective effect.

［Key words］ eicosapentaenoic acid （EPA）； pyroptosis； cell damage； nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2）

細胞焦亡是機體清除體內功能異常或感染損傷細胞的一種常見的程序性死亡方式，對于自身穩態的維持十分重要。在經典激活通路中，細胞可通過模式識別受體識別脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激物，促進細胞炎癥通路活化，激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體，隨后釋放含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1），切割焦孔素D（GSDMD），促進N-GSDMD孔形成并引起細胞膜損傷，DNA斷裂以及大量促炎因子（如IL-1β、IL-18等）的釋放［1］。近年來研究發現［2］，多種腎臟疾病過程中都有細胞焦亡通路的參與，包括急性腎損傷、糖尿病腎病和慢性腎病等。當前已有眾多藥物在靶向焦亡治療腎臟疾病中展現出了較好的效果［3-4］，因此細胞焦亡作為治療腎臟疾病的治療切入點具有重要臨床意義。

二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）與α-亞麻酸、二十二碳六烯酸等同屬于n-3多不飽和脂肪酸（PUFAs），是一類機體所必需的PUFAs。一項針對慢性腎病患者的研究發現，血漿PUFAs與腎衰竭風險呈負相關［5］。大量研究表明，飲食中添加n-3 PUFAs可以促生長并有效降低患心血管疾病、糖尿病和癌癥等慢性病的風險［6-7］。

近年來，n-3 PUFAs在焦亡調節中的重要作用不斷被闡明，比如在飲食中添加n-3 PUFAs可以通過減少GSDMD的激活，減少NLRP3的表達，從而抑制焦亡并緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎［8］。核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是重要的抗氧化轉錄因子，在應對氧化應激、炎癥以及其他細胞損傷時被激活，抑制NLRP3的激活從而發揮抗焦亡作用［9］。近年來，有研究表明n-3 PUFAs具有增強Nrf2激活的能力［10-11］，故推測n-3 PUFAs可以通過激活Nrf2蛋白緩解細胞焦亡從而發揮治療腎病的作用。本研究旨在研究EPA對腎小球系膜細胞（HBZY-1）焦亡的保護作用，并利用激動劑和抑制劑闡明Nrf2通路在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

大鼠腎小球系膜細胞株（HBZY-1細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清（上海依科賽生物科技有限公司）；4-辛基衣康酸（4-OI，美國Sigma公司）；MCC950（美國Selleck公司）；小鼠抗GAPDH抗體、兔抗Nrf2抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗Caspase-1抗體、兔抗GSDMD抗體、辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗（北京博奧森生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海碧云天生物試劑有限公司）；大鼠IL-18、IL-1β酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM（青霉素、鏈霉素雙抗）將HBZY-1細胞培養至融合度為90%時，棄去舊培養基，用PBS沖洗2次，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶進行消化，置于顯微鏡下觀察約30 s。當在鏡下觀察到細胞變圓并開始脫落時，立即加入2 mL完全培養基終止消化，輕柔吹打，收集細胞，800 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，并用完全培養基重懸細胞，分瓶培養，隔天換液。

1.2.2 CCK-8法測定細胞活力 將處于對數生長期的HBZY-1細胞以1 000個/孔的數量接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2環境下培養細胞至60%融合后，加入10 μg/mL LPS和0～200 μmol/L濃度的EPA，孵育8、24、48 h，每組設置3個復孔，并設置空白對照孔。細胞處理結束前2 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于細胞培養板中繼續孵育2 h后用酶標儀于450 nm處測定光密度。

1.2.3 實驗分組 為探究EPA是否通過Nrf2蛋白發揮其對LPS誘導的焦亡的調控作用，基于LPS與EPA共處理對細胞活力的影響，結合Nrf2激動劑及NLRP3受體抑制劑將細胞分為5組：① 空白對照（CON）組；② LPS組（10 μg/mL）；③ LPS+EPA組；④ LPS+EPA+4-OI組；⑤ LPS+EPA+MCC950組，EPA、4-OI和MCC950濃度均為200 μmol/L，分別將各組藥物同時加入細胞培養板中處理48 h后，收集樣品待測。

1.2.4 細胞培養上清液中LDH、IL-1β和IL-18水平測定 細胞如“1.2.3”所述處理完成后，將96孔板400×g離心5 min，收集細胞培養上清液，根據試劑盒說明書檢測LDH、IL-1β和IL-18含量。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測焦亡相關蛋白的表達 細胞如“1.2.3”所述處理完成后，提取各組細胞總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度后，調整蛋白濃度并使用5×上樣緩沖液進行預變性。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，電泳完成后轉印至PVDF膜上（200 mA、105 min）；隨后依次利用快速封閉液進行封閉30 min，TBST洗滌3次，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。最后，將膜浸入ECL發光液顯影并拍照。蛋白表達量使用Image J軟件對光密度值進行分析，蛋白相對表達量計算為目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.2.6 TUNEL染色檢測DNA損傷情況 在24孔細胞板中加入細胞玻片，取對數生長期的細胞消化后調整細胞密度，調整細胞密度為1×105個/mL接種于24孔板中，待細胞融合度為70%時，根據“1.2.3”分組加藥處理48 h后，用PBS輕柔洗滌3次；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛室溫下固定30 min；隨后用PBS洗滌3次；加1 mL 0.3% Triton X-100，在室溫下通透5 min；用PBS輕柔洗滌3次；在爬片上滴加50 μL TUNEL染色檢測液，室溫避光孵育60 min；用PBS輕柔洗滌3次；每孔加入300 μL DAPI染色；用PBS輕柔洗滌3次；用抗熒光淬滅劑封片后熒光顯微鏡觀察拍照，并用Image J量化熒光強度。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 9.4.0進行統計學分析與繪圖，所有數據均為獨立進行的3次實驗獲得，數據以均數±標準差（x±s）表示。多組間的數據比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPA減輕LPS誘導的HBZY-1細胞損傷

如圖1所示，EPA作用8 h時，10 μg/mL LPS單獨處理顯著抑制了HBZY-1的細胞活力（Plt;0.05），與LPS單獨處理組比較，10～200 μmol/L EPA+10 μg/mL LPS共處理組HBZY-1細胞活力明顯增加（Plt;0.05）；處理24 h時，各組之間細胞活力無明顯差異（P均gt;0.05）；10 μg/mL LPS處理48 h顯著抑制了細胞活力（Plt;0.05），與LPS單獨處理組相比，0.1～10 μmol/L EPA+10 μg/mL LPS共處理HBZY-1細胞活力無顯著差異（P均gt;0.05），而20～200 μmol/L的EPA+10 μg/mL LPS共處理組細胞活力與LPS單獨處理組比較明顯增加（Plt;0.05）。

2.2 EPA通過Nrf2通路抑制LPS誘導的HBZY-1細胞IL-1β、IL-18釋放

如圖2所示，10 μg/mL LPS處理48 h后，HBZY-1細胞培養上清液中IL-1β、IL-18釋放量均顯著上升（Plt;0.01）；與LPS組相比，LPS+EPA處理組可以顯著降低IL-1β、IL-18的釋放量（P均lt;0.01）。對比LPS+EPA組，LPS+EPA+4-OI組對IL-1β、IL-18釋放的抑制效果更強（Plt;0.05或Plt;0.01），而LPS+EPA+MCC950組與LPS+EPA組比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。

2.3 EPA通過Nrf2通路減輕LPS誘導的HBZY-1細胞損傷

結果表明，10 μg/mL LPS處理48 h后，培養上清液中LDH的釋放量顯著上升（Plt;0.01），細胞活力顯著下降（Plt;0.01），但LPS+EPA組細胞活力與CON組比較無明顯差異（Pgt;0.05）。與LPS+EPA組相比，LPS+EPA+4-OI組細胞活力顯著上升（Plt;0.01），且LDH的釋放量被顯著抑制（Plt;0.01），但LPS+EPA+MCC950組與LPS+EPA組比較無明顯差異（Pgt;0.05）。見圖3。

2.4 EPA通過NRF2通路減少LPS誘導的HBZY-1細胞焦亡

如圖4所示，與對照組比較，LPS刺激顯著提高了焦亡通路關鍵蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD的表達水平（Plt;0.01），并顯著降低了Nrf2的蛋白表達水平（Plt;0.01）。與LPS組比較，LPS+EPA組Nrf2蛋白表達水平顯著增加（Plt;0.01），而NLRP3、GSDMD蛋白的表達水平均顯著降低（Plt;0.01），Caspase-1蛋白的表達水平雖然有所下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與LPS+EPA組相比，LPS+EPA+4-OI組中Nrf2蛋白的表達水平顯著增加（Plt;0.01），且NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表達水平均降低（Plt;0.01），LPS+EPA+MCC950組的Nrf2蛋白表達水平增加（Plt;0.05），而NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表達水平無明顯差異（Pgt;0.05）。

2.5 EPA通過NRF2通路減輕LPS對HBZY-1細胞DNA損傷

圖5表明LPS造成了DNA嚴重損傷，而LPS+EPA組損傷明顯減少；與LPS+EPA組相比，LPS+EPA+4-OI組HBZY-1細胞的DNA損傷進一步減少，而LPS+EPA+MCC950與LPS+EPA沒有明顯差異。

3 討論

EPA可以通過多種機制改善腎臟疾病，例如通過減少高脂飲食引起的自噬流從而減輕小鼠腎臟脂毒性［12］，或通過抑制腎臟中的氧化應激和線粒體介導的細胞凋亡從而預防或減輕高血壓腎病［13］。研究指出，細胞焦亡參與腎臟疾病的發展［14］，但尚不清楚EPA對腎臟疾病的改善作用與細胞焦亡的關聯，其對焦亡的調控機制也暫不明確。慢性腎臟病患者血漿中LPS含量較高，其與腎臟細胞焦亡有著密切關系且可能是主要誘因之一，且大劑量LPS是體內誘導腎損傷的常用手段［15］。因此本研究選用LPS誘導HBZY-1細胞焦亡，并以此探究EPA通過焦亡調控對腎臟疾病預防或治療的潛力。

本研究發現，10 μg/mL LPS作用不同時間均造成了HBZY-1細胞損傷。而100 μmol/L、200 μmol/L的EPA對LPS誘導HBZY-1細胞活力下降有顯著的保護作用。因此本研究采用LPS刺激48 h并用200 μmol/L EPA干預進行后續實驗。研究表明，炎性通路的激活會造成細胞膜損傷，并導致IL-1β、IL-18等促炎因子的釋放從而引起DNA損傷［16］。LDH是存在于幾乎所有細胞中的一種穩定的酶，在細胞受到損傷后，會迅速釋放到胞外，因此，其釋放量是細胞毒性的重要指標［17］。通過檢測HBZY-1細胞LDH釋放量并結合細胞活力測定，結果發現200 μmol/L EPA干預明顯減輕10 μg/mL LPS造成的細胞損傷，并對細胞DNA損傷表現出明顯的保護作用。同時，200 μmol/L EPA處理還顯著減少了細胞培養上清液中LPS引起的IL-1β、IL-18釋放量，并下調NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平，但EPA對Caspase-1的調節作用差異并不顯著。這可能是由于EPA傾向于抑制NLRP3和凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）的結合，而非Caspase-1蛋白表達水平［18］。以上結果表明10 μg/mL LPS刺激48 h顯著引起了HBZY-1細胞損傷并激活焦亡信號通路，但200 μmol/L EPA對LPS造成的細胞損傷具有明顯的保護效果，且可以抑制焦亡信號通路的激活。

Nrf2介導重要的細胞抗應激機制，對細胞穩態的維持十分重要。近年研究表明Nrf2的抗氧化作用與細胞焦亡信號通路密切相關［19-20］，Nrf2的缺失還會導致糖尿病腎病的病程加速［21］。此外，研究還發現飼料中添加EPA可有效提高大黃魚肌肉中Nrf2的表達水平，表明EPA有較好的Nrf2誘導作用［22］。本研究也發現EPA可上調Nrf2蛋白的表達水平，推測EPA可能通過上調Nrf2蛋白的水平發揮其抗焦亡作用。

為了明確EPA抗焦亡過程中誘導上調Nrf2蛋白所發揮的作用，本研究采用Nrf2激動劑（4-OI）、NLRP3受體抑制劑（MCC950）探究EPA是否通過Nrf2發揮抗焦亡作用。結果表明，4-OI可增強EPA對細胞損傷的保護作用，顯著減少培養上清液中LDH、IL-1β、IL-18的釋放量，減少DNA損傷，并進一步降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD等蛋白的表達水平，表現出了更強的抗焦亡作用。而MCC950作為NLRP3抑制劑，其與EPA聯用并沒有在細胞損傷保護以及對焦亡通路的影響上表現出明顯的差異，這可能與EPA上調Nrf2從而較好地抑制NLRP3激活有關，表明EPA主要是通過Nrf2蛋白發揮其抗焦亡作用，而非靶向NLRP3炎性小體。MCC950應用后，Nrf2蛋白表達水平有所升高，可能因為其減少了NLRP3的細胞損傷和氧化應激作用［23］。

綜上，本研究表明EPA通過Nrf2蛋白發揮對LPS誘導的HBZY-1細胞焦亡的保護作用。

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［收稿日期］ 2023-03-27" ［編輯］ 郭 欣