HPLC法同時(shí)測(cè)定不同基原甘草中8種黃酮類(lèi)成分的含量

［摘要］ 目的： 建立一種同時(shí)測(cè)定甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A含量的方法，并對(duì)烏拉爾甘草、光果甘草與脹果甘草藥材中上述成分含量進(jìn)行測(cè)定。方法： 采用InertSustainTM ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm和360 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果： 芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷在10～500 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r≥0.999 7），甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A在1～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 8），平均加樣回收率為98.73%～100.54%，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3%。芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素在烏拉爾甘草中的含量最高，甘草查爾酮A和甘草查爾酮B在脹果甘草中的含量最高。結(jié)論： 本研究建立了同時(shí)測(cè)定甘草藥材中8種黃酮類(lèi)成分的HPLC方法，該方法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確，可為甘草藥材的質(zhì)量控制提供有益參考。

［關(guān)鍵詞］ 烏拉爾甘草；光果甘草；脹果甘草；高效液相色譜法；含量測(cè)定；質(zhì)量控制；黃酮類(lèi)成分

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R917" ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A" ［文章編號(hào)］ 1671-7783（2024）04-0349-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230174

［引用格式］魏旭，周麗紅，姬孝軒，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定不同基原甘草中8種黃酮類(lèi)成分的含量［J］. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2024， 34（4）： 349-353，363.

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074286）；江蘇省“六大人才高峰”高層次人才（SWYY-013）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20191428）；江蘇省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)（2020ZX21）；鎮(zhèn)江市國(guó)際科技合作項(xiàng)目（GJ2021012）

［作者簡(jiǎn)介］魏旭（1998—），男，碩士研究生；馮春來(lái)（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： feng@ujs.edu.cn

甘草為我國(guó)中醫(yī)處方中使用最為廣泛的一味藥材，素有“國(guó)老”之稱(chēng)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛咳止痰等功效［1］。研究表明［2-3］，甘草中的主要活性成分為黃酮類(lèi)和三萜皂苷類(lèi)，其中黃酮類(lèi)成分最多，共發(fā)現(xiàn)300余種，這些黃酮類(lèi)成分主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查爾酮、異黃酮等。黃酮類(lèi)化合物對(duì)于評(píng)價(jià)甘草的質(zhì)量具有極其重要的作用，在2005版中國(guó)藥典中還將甘草中二氫黃酮類(lèi)成分甘草苷新增為甘草中成分含量控制的指標(biāo)之一。在甘草眾多黃酮類(lèi)化合物中，二氫黃酮類(lèi)和查爾酮類(lèi)含量較高，研究也最為廣泛，其中二氫黃酮類(lèi)成分具有抗抑郁、抗炎等藥理作用［4-5］，代表成分有芹糖甘草苷、甘草素、甘草苷；查爾酮類(lèi)成分具有抗癌、抗炎等藥理作用［6-7］，代表成分有芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、異甘草素、甘草查爾酮A。研究甘草的藥效以及質(zhì)量控制，準(zhǔn)確測(cè)定以上8種黃酮類(lèi)成分的方法具有重要意義。本研究擬在中國(guó)藥典規(guī)定的3種基原的甘草（烏拉爾甘草、脹果甘草或光果甘草）［8］中建立以上8種黃酮類(lèi)成分的高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），BSA 124S型電子天平（賽多利斯儀器有限公司），KQ-250DB型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司），高速多功能粉碎機(jī)（武義海納電器有限公司）。對(duì)照品芹糖甘草苷（批號(hào)：CYR-G0042）、甘草苷（批號(hào)：CYR-G0058）、芹糖異甘草苷（批號(hào)：CYR-Q0080）、異甘草苷（批號(hào)：CYR-Y0074）、甘草素（批號(hào)：CYR-G0020）、甘草查爾酮B（批號(hào)：CYR-G0018）、異甘草素（批號(hào)：CYR-Y0199）、甘草查爾酮A（批號(hào)：CYR-G0017）均購(gòu)自四川翠益潤(rùn)生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用甘草樣品為市售的烏拉爾甘草（批號(hào)：20211101）、光果甘草（20211104）和脹果甘草（20211109），經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為豆科植物烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.和光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取50 mg芹糖甘草苷對(duì)照品、50 mg甘草苷對(duì)照品、50 mg芹糖異甘草苷對(duì)照品、50 mg異甘草苷對(duì)照品、5 mg甘草查爾酮B對(duì)照品、5 mg甘草素對(duì)照品、5 mg異甘草素對(duì)照品、5 mg甘草查爾酮A對(duì)照品于10 mL容量瓶中，加色譜級(jí)甲醇溶解，定容，搖勻，得到8個(gè)成分質(zhì)量濃度依次為5.0、5.0、5.0、5.0、0.5、0.5、0.5、0.5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 首先將甘草藥材用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩，精密稱(chēng)取1 g甘草藥材粉末，放置于具塞錐形瓶中，按照料液比1∶20加入20 mL 的95%乙醇，在室溫下采用水浴式超聲提取45 min（25 ℃，250 W，40 kHz），待冷卻至室溫后用95%乙醇補(bǔ)足失重，然后抽濾，將濾液在3 700 r/min離心10 min后取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 采用InertSustainTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，20%～30% A；10～30 min，30%～60% A；30～40 min，60%～70% A）；進(jìn)樣量為20 μL；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm（芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素），360 nm（芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、異甘草素、甘草查爾酮A）。

1.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用色譜級(jí)甲醇分別稀釋10、20、50、100、500倍，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液適量，稀釋一定倍數(shù)后，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄待測(cè)成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取光果甘草藥材（批號(hào)：20211104），按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取光果甘草藥材粉末（批號(hào)：20211104）6份，按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取待測(cè)成分含量已知的光果甘草藥材粉末（批號(hào)：20211104）6份，每份1 g，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并分別加入對(duì)照品溶液適量。然后按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積，計(jì)算平均加樣回收率及其RSD值。

1.2.9 樣品含量測(cè)定 取3種不同基原的甘草藥材（烏拉爾甘草批號(hào)：20211101、光果甘草批號(hào)：20211104、脹果甘草批號(hào)：20211109），按照“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液20 μL，按“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件考察

按照“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，混合對(duì)照品溶液及不同基原甘草供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。8種待測(cè)成分與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計(jì)算均不低于5 000。

2.2 線性關(guān)系考察

以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表1）。結(jié)果顯示，8種待測(cè)成分在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度考察

計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A峰面積的RSD依次為0.70%、0.66%、0.95%、0.64%、0.80%、0.51%、0.52%和0.59%，8種成分的RSD均小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A峰面積的RSD依次為1.69%、0.95%、1.49%、1.06%、1.15%、0.61%、1.47%和1.00%，8種成分的RSD均小于2%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性考察

計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A峰面積的RSD依次為1.42%、1.89%、1.47%、2.63%、0.87%、0.86%、0.56%和0.87%，8種成分的RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率考察

計(jì)算得到芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A的平均加樣回收率依次為99.56%、98.73%、99.08%、100.09%、99.64%、99.21%、99.80%和100.54%（表2），RSD依次為1.28%、0.76%、0.76%、1.55%、1.61%、1.00%、0.59%和0.85%，8種成分平均加樣回收率為98.73%～100.54%，RSD均小于2%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

分別計(jì)算3種不同基原甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A的含量，結(jié)果表明，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素在烏拉爾甘草中的含量最高，分別為2.878、5.794、1.715、2.898、0.699、0.759 mg/g；甘草查爾酮A和甘草查爾酮B在脹果甘草中的含量最高，分別為0.093、0.137 mg/g；光果甘草中8種黃酮類(lèi)成分均較低（表3）。

3 討論

本研究通過(guò)紫外檢測(cè)器在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)甘草中8種待測(cè)成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素在276 nm處有最大吸收，芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B在360 nm處有最大吸收，其余2種成分（異甘草素、甘草查爾酮A）在360 nm也有良好的吸收。其次，8種待測(cè)成分在各自設(shè)置的波長(zhǎng)處響應(yīng)值均較高，且分離較為理想。因此，本研究選擇276 nm和360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)［9-12］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇水、甲醇0.1%乙酸水、乙腈0.1%乙酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈0.1%乙酸水時(shí)的分離效果最理想，峰形均較好且無(wú)拖尾現(xiàn)象，故在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了不同流動(dòng)相比例的梯度洗脫效果，最終確定了“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件。

本實(shí)驗(yàn)前期以水、不同比例的甲醇和乙醇為溶劑考察了提取溶劑對(duì)甘草中8種黃酮類(lèi)成分含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)95%乙醇的提取效果最佳，各待測(cè)成分的含量均較高，且分離效果較好。同時(shí)，分別對(duì)45、90和120 min這三個(gè)提取時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯差異。因此，本研究選擇45 min作為提取時(shí)間。

芹糖甘草苷與芹糖異甘草苷、甘草苷與異甘草苷、甘草素與異甘草素為3對(duì)同分異構(gòu)體，研究發(fā)現(xiàn)它們是甘草發(fā)揮抗炎、抗氧化等多種藥理作用的關(guān)鍵成分［13-18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素在烏拉爾甘草中的含量最高，甘草查爾酮A和甘草查爾酮B在脹果甘草中的含量最高，光果甘草中8種黃酮類(lèi)成分均較低。因此，根據(jù)不同藥理活性需求，選擇不同基原甘草，有利于發(fā)揮更好的治療作用。

本研究建立了一種雙波長(zhǎng)條件下同時(shí)測(cè)定甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草查而酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A 8種黃酮類(lèi)成分的HPLC方法。所建立的方法簡(jiǎn)單高效，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好，可以為不同基原甘草的質(zhì)量控制提供參考。

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［收稿日期］ 2023-07-11" ［編輯］ 郭 欣