細胞焦亡相關蛋白在胎膜早破孕婦胎膜組織中的表達及其與妊娠結局的關系

［摘要］ 目的： 探究細胞焦亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1）和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）在胎膜早破孕婦胎膜組織中的表達及其與妊娠結局的關系。方法： 選擇2020年1月至2023年1月于常熟市中醫院婦產科就診并分娩的胎膜早破孕婦135例作為觀察組，另選擇同期產檢并分娩的健康孕婦135例作為對照組，比較兩組孕婦胎膜組織中NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達。依據妊娠結局將135例胎膜早破孕婦分為妊娠不良組（n=50）和妊娠良好組（n=85），通過單因素和多因素Logistic分析胎膜早破孕婦妊娠不良的獨立危險因素；應用Logistic回歸模型結合限制性立方樣條（restricted cubic splines，RCS）分析胎膜早破孕婦胎膜組織中細胞焦亡相關蛋白表達量與妊娠不良的劑量反應關系；依據獨立因素構建列線圖預測模型，并對模型進行驗證。結果： 觀察組胎膜組織中NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達顯著高于對照組（Plt;0.001）。就診時間≥2 h、生殖道感染、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA高表達是胎膜早破孕婦妊娠結局不良的獨立危險因素（Plt;0.05）；RCS結果顯示，胎膜早破孕婦胎膜組織中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表達量與妊娠結局不良呈非線性劑量反應關系，在NLRP3 mRNA表達量為1.20（OR=1.818，95%CI：1.673～1.932）和Caspase-1 mRNA表達量為1.25（OR=2.735，95%CI：1.132～3.821）處發生妊娠結局不良的風險最大；構建的列線圖預測模型具有良好的區分度、準確性和臨床適用性。結論： NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA在胎膜早破孕婦胎膜組織中呈高表達，二者是胎膜早破孕婦妊娠結局不良的獨立危險因素，隨著表達量升高，胎膜早破孕婦妊娠不良的危險性也隨之升高。

［關鍵詞］ 細胞焦亡相關蛋白；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3；胎膜早破；胎膜組織；妊娠結局

［中圖分類號］ R737.31" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2024）04-0283-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230104

［引用格式］錢云英，錢桂英，蔡奚梅，等. 細胞焦亡相關蛋白在胎膜早破孕婦胎膜組織中的表達及其與妊娠結局的關系［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（4）： 283-289，306.

［作者簡介］錢云英（1982—），女，碩士，副主任醫師，主要從事圍產醫學及生殖內分泌研究；蔡奚梅（通訊作者），主任醫師，E-mail： caiximeics@163.com

Expression of pyroptosis related proteins in fetal membranes of pregnant women with premature rupture of membranes and its relationship with pregnancy outcome

QIAN Yunying QIAN Guiying CAI Ximei GU Weiqun NI Haiyan ZHU Danying XU Yingfang JI Wenxia1

（1. Department of Gynaecology and Obstetrics， 2. Department of Pharmacy， Changshu Traditional Chinese Medicine Hospital， Jiangsu Changshu 215500， China）

［Abstract］ Objective： To explore the expression of pyroptosis related protein cysteinyl aspartate specific proteinase-1 （Caspase-1） and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein-3 （NLRP3） in fetal membranes of pregnant women with premature rupture of membranes （PROM） and their relationship with pregnancy outcomes. Methods： A total of 135 pregnant women with PROM who received medical treatment and delivered at the Obstetrics and Gynecology Department of Changshu Traditional Chinese Medicine Hospital from January 2020 to January 2023 were selected as the observation group， and other 135 healthy pregnant women who received prenatal examination and delivered during the same period were selected as the control group. The expression of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNA in the fetal membrane tissue of the two groups of pregnant women was compared. One hundred and thirty-five pregnant women with PROM were divided into a poor pregnancy group （n=50） and a good pregnancy group （n=85） based on pregnancy outcomes. Independent risk factors for poor pregnancy in pregnant women with PROM were analyzed using univariate and multivariate Logistic analysis. Logistic regression model and restricted cubic splines （RCS） were used to analyze the dose-response relationship between the expression of pyroptosis related proteins in fetal membranes of pregnant women with PROM and adverse pregnancy. A nomogram prediction model was constructed by using independent influencing factors and the model was also verified. Results： The expression of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNA in the fetal membrane tissue of the observation group was significantly higher than that of the control group （Plt;0.001）. Visit time， reproductive tract infections， and the mRNA expression levels of NLRP3 and Caspase-1 are independent risk factors for poor pregnancy outcomes in pregnant women with PROM （Plt;0.05）. The RCS results showed that the expression levels of NLRP3 and Caspase-1 in the fetal membrane tissue of pregnant women with PROM showed a non-linear dose-response relationship with adverse pregnancy outcomes. The highest risk of adverse pregnancy outcomes occurred at NLRP3 mRNA expression levels of 1.20 （OR=1.818， 95%CI： 1.673-1.932） and Caspase-1 mRNA expression levels of 1.25 （OR=2.735， 95%CI： 1.132-3.821）. The constructed nomogram prediction model has good discrimination， accuracy， and clinical applicability. Conclusion： Caspase-1 mRNA and NLRP3 mRNA are highly expressed in the fetal membrane tissue of pregnant women with PROM， and they are independent risk factors for adverse pregnancy outcomes in pregnant women with PROM. With the increase of expression levels， the risk of adverse pregnancy in pregnant women with PROM also increases.

［Key words］ pyroptosis related protein; cysteinyl aspartate specific proteinase （Caspase-1）; nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3）; premature rupture of membranes （PROM）; fetal membrane tissue; pregnancy outcome

胎膜早破是指在臨產前胎膜發生自發性破裂［1］，為圍生期常見的并發癥之一，是早產、胎兒畸形、胎兒死亡等多種不良妊娠結局的重要因素［2］。研究顯示，胎膜結構缺陷和炎癥是胎膜早破的基本病理變化，炎癥因子釋放及免疫應答在其發生發展中起重要作用［3］。細胞焦亡是機體一種重要的天然免疫反應，在多種病理變化中發揮重要作用［4］。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1）介導的細胞程序性壞死是細胞焦亡的主要機制［5］，而在Caspase-1的激活中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein-3，NLRP3）常作為炎癥小體的激活劑。研究顯示，Caspase-1和NLRP3在離體的胎膜組織中呈高表達［6］，但其是否參與胎膜早破的發生發展尚不清楚。因此，本研究擬通過探究胎膜早破孕婦胎膜組織中Caspase-1 mRNA和NLRP3 mRNA表達量的變化，分析二者與胎膜早破孕婦妊娠結局的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020年1月至2023年1月于常熟市中醫院就診并分娩的胎膜早破孕婦135例作為研究對象，年齡21～39歲，平均年齡（27.35±3.17）歲。另選擇同期于我院產檢并分娩的正常妊娠孕婦135例為對照組，年齡22～40歲，平均年齡（27.29±2.84）歲。納入標準：自然妊娠；單胎；符合胎膜早破的診斷標準［7］；懷孕前月經規律；有完整的產檢和分娩記錄。排除標準：合并妊娠期高血壓、糖尿病等并發癥；合并自身免疫系統疾病；合并惡性腫瘤者；肝腎功能異常者；精神障礙者。本研究獲常熟市中醫院倫理委員會批準（20190384），所有患者或家屬知情同意并且簽署知情同意書。

1.2 臨床資料及血樣采集

通過電子病歷收集孕婦臨床資料，包括年齡、體重指數（body mass index，BMI）、平均收縮壓、平均舒張壓、受教育水平、家庭收入、孕周、孕次、產次、吸煙史、飲酒史、盆腹腔手術史、流產史、孕期腹痛史、陰道流血史、羊水情況、分娩方式以及新生兒性別。

胎膜早破孕婦入組后第2天，禁食12 h以上抽取空腹靜脈血，采用ELISA法，按照試劑盒（碧云天生物科技有限公司）的操作說明，檢測總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖、尿素氮、肌酐、血小板計數、血紅蛋白、紅細胞計數、白細胞計數以及C反應蛋白。采用日本Sysmex CA-7000全自動凝血分析儀，依據試劑盒（德國美創醫療儀器生產貿易有限公司）說明書，檢測血液樣本中凝血酶時間、纖維蛋白原、凝血酶原時間和活化部分凝血酶時間。

1.3 實時熒光定量PCR檢測胎膜中NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達

1.3.1 引物設計與合成 在GenBank中搜索人類NLRP3基因序列和Caspase-1基因序列，采用prier express v2.0設計引物及探針，由美國Life Technologies公司合成。NLRP3引物序列：上游5′-ATTCGGAGATTGTGGTTGGG-3′，下游5′-GAGTCTGGTCAGGGAATGGCT-3′；Caspase-1引物序列：上游5′-GGAAACAAAAGTCGGCAGAGAT-3′，下游5′-CC-AGATTTTGTAGCAGCATTGTC-3′。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測 孕婦分娩完成后迅速取其胎盤標本，取新鮮胎膜組織約1.0 cm×1.0 cm，無核酶水沖洗后于-80 ℃保存。用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA，DU-800紫外分光光度計（Beckman公司）檢測RNA濃度，采用High Capacity RNA-to-cDNATM試劑盒（美國Invitrogen公司）合成cDNA。采用Luminaris HiGreen qPCR Master Mix（美國Invitrogen公司）制備擴增體系行實時熒光定量PCR，反應條件：95 ℃ 6 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35個循環。以GAPDH作為內參對照，根據2-ΔΔCT法計算NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA相對表達量。

1.4 評估標準

所有胎膜早破孕婦入院后依據具體情況給予對癥治療并適時分娩，不良妊娠結局包括早產、宮內感染、胎兒宮內窘迫、絨毛膜羊膜炎和新生兒窒息。

依據妊娠結局將135例胎膜早破孕婦分為妊娠不良組（n=50）和妊娠良好組（n=85），比較兩組臨床資料、生化指標和NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達量，探究妊娠不良的風險因素。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立t檢驗；計數資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；通過單因素和多因素Logistic分析胎膜早破孕婦妊娠不良的獨立危險因素；應用Logistic回歸模型結合限制性立方樣條模型（restricted cubic splines，RCS）分析胎膜早破孕婦胎膜組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA表達量與妊娠結局的劑量反應關系；采用R（R3.5.3）軟件包和rms程序包制作列線圖，在項目標尺上定位患者的每個變量的取值，在首行的單項得分軸上畫一條垂直線對應每個變量的取值點，以確定每個變量的得分；采用Bootstrap自抽樣法進行驗證，采用一致性指數（concordance index，C-index）、受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線以及ROC曲線下面積（area under curve，AUC）評價模型的準確性和區分度；采用決策曲線評估列線圖模型在不同閾值概率下的凈效益；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料比較

結果顯示，觀察組和對照組年齡、BMI、平均孕周、平均收縮壓、平均舒張壓、受教育水平、家庭月收入、吸煙史、飲酒史、孕次和產次比較，差異均無統計學意義（P均gt;0.05）。見表1。

2.2 兩組胎膜組織中細胞焦亡相關蛋白mRNA表達比較

與對照組相比，觀察組胎膜組織中NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA相對表達量明顯升高（P均lt;0.001）。見表2。

2.3 胎膜早破孕婦妊娠結局不良的單因素分析

結果顯示，與妊娠良好組相比，妊娠不良組產婦就診時間≥2 h、生殖道感染和胎位異常占比顯著增高（P均lt;0.001），C反應蛋白、白細胞計數、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達量明顯增高（P均lt;0.001），平均孕周明顯降低（P均lt;0.001），其余指標比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

2.4 胎膜早破孕婦妊娠結局不良的多因素分析

將篩選出的因素作為自變量并進行賦值，其中連續變量以中位數為取界值進行二分類，平均孕周（lt;37周=0，≥37周=1）、就診時間（lt;2 h=0，≥2 h=1）、生殖道感染（否=0，是=1）、胎位異常（否=0，是=1）、C反應蛋白（lt;8 mg/L=0，≥8 mg/L=1）、白細胞計數（lt;15×109/L=0，≥15×109/L=1）、NLRP3 mRNA表達（lt;1.20=0，≥1.20=1）、Caspase-1 mRNA表達（lt;1.25=0，≥1.25=1），是否妊娠結局不良（否=0，是=1）為因變量。多因素Logistic回歸分析顯示，就診時間≥2 h、生殖道感染、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA高表達是胎膜早破孕婦妊娠結局不良的獨立危險因素（Plt;0.05）。見表4。

2.5 細胞焦亡相關蛋白mRNA表達與妊娠結局不良的關系

采用4個節點的RCS模型分析NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達量與妊娠結局不良的關系，結果顯示，胎膜早破孕婦胎膜組織中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表達量與妊娠結局不良呈非線性劑量反應關系，在NLRP3 mRNA相對表達量為1.20（OR=1.818，95%CI=1.673～1.932）和Caspase-1 mRNA相對表達量為1.25（OR=2.735，95%CI=1.132～3.821）處發生妊娠結局不良的風險最大。見圖1。

2.6 胎膜早破孕婦妊娠結局不良的預測模型構建

納入上述妊娠結局不良的獨立危險因素。結果如圖2所示，就診時間≥2 h、生殖道感染、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA相對表達量的評分分別為53.62、62.74、56.70、56.21分，所得總分（229.27分）對應的概率即為列線圖模型預測胎膜早破孕婦妊娠結局不良的概率，81.82%。

2.7 胎膜早破孕婦妊娠結局不良的預測模型驗證

由分析結果可知，內部驗證前后AUC分別為0.924（95%CI：0.875～0.953）和0.920（95%CI：0.869～0.948），靈敏度分別為89.51%和89.73%，特異度分別為90.68%和90.57%。Hosmer-Lemeshow檢驗結果提示，該模型預測胎膜早破孕婦妊娠結局不良的風險預測值與實際觀測值的偏差比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），模型準確性較高。見圖3～4。決策曲線結果顯示，細胞焦亡相關蛋白的表達和預測模型預測胎膜早破孕婦妊娠結局不良與實際基本符合，模型具有良好的臨床適用性。見圖5。

3 討論

NLRP3和Caspase-1為細胞焦亡經典通路的重要組成部分［8］。研究顯示，Caspase-1和NLRP3可能參與胎膜早破的免疫應答過程［9］。值得注意的是，既往研究多關注NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA在患者外周血中的表達［10］，而胎膜早破的病理變化主要為胎膜本身結構缺陷和炎癥，故Caspase-1和NLRP3在胎膜早破中的作用尚存在一定爭議。本研究結果表明，胎膜早破孕婦胎膜組織中NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達顯著高于正常孕婦。由此可見，Caspase-1和NLRP3與胎膜早破有關，兩者表達量上調可能增加胎膜早破的發生風險。

胎膜早破可增加多種不良妊娠結局的發生風險［11］。因此，探尋胎膜早破孕婦不良妊娠結局的影響因素仍是臨床亟待解決的問題。研究顯示，Caspase-1和NLRP3在多種不良妊娠的過程中起促進作用［12］。本研究結果表明，妊娠結局不良孕婦胎膜組織中NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達量顯著高于妊娠良好孕婦。RCS分析發現，胎膜早破孕婦胎膜組織中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表達量與妊娠結局不良呈非線性劑量反應關系。由此推測，兩者高表達可能導致機體炎癥介質升高，使免疫細胞聚集，級聯放大炎癥反應，導致血管內皮細胞損傷，增加不良妊娠結局風險。此外，本研究還發現，妊娠不良組產婦就診時間≥2 h、生殖道感染占比顯著增高，就診時間≥2 h和生殖道感染是胎膜早破孕婦妊娠不良的獨立危險因素。既往研究顯示，胎膜早破孕婦就診時間≥2 h發生宮內感染的概率增加，并可能增加產褥感染、新生兒感染和呼吸窘迫綜合征等風險［13］。究其原因，可能是胎膜破裂后未及時干預，暴露時間過長而致病原菌侵入的概率增加所致。另有研究顯示，孕婦下生殖道微生物可借助上行性感染影響胎盤，使之出現炎癥性病變，增加胎兒發生窒息、肺炎和呼吸窘迫綜合征等概率［14］。由此提示，分娩后及時送檢胎盤，嚴格監測胎膜組織中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表達量，有助于采取選擇性干預治療改善妊娠結局預后。

綜上所述，NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA在胎膜早破孕婦胎膜組織中的高表達是胎膜早破孕婦妊娠結局不良的獨立危險因素，隨著NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達量升高，胎膜早破孕婦妊娠不良的危險性隨之升高。

［參考文獻］

［1］ 楊柳， 付欣， 張小飛. 胎膜早破孕婦生殖道無乳鏈球菌血清型分型和耐藥基因分析［J］. 現代檢驗醫學雜志， 2023， 38（3）： 123-127.

［2］ Gibson KS， Brackney K. Periviable premature rupture of membranes［J］. Obstet Gynecol Clin North Am， 2020， 47（4）： 633-651.

［3］ Bennett PR， Brown RG， Macintyre DA. Vaginal microbiome in preterm rupture of membranes［J］. Obstet Gynecol Clin North Am， 2020， 47（4）： 503-521.

［4］ Guo MX， Lu J， Yu XM， et al. The protective role of serum uric acid against premature membrane rupture in gestational diabetes： a cross-sectional study［J］. BMC Endocr Disord， 202 21（1）： 95.

［5］ Wang S， Bai J. Functions and roles of IFIX， a member of the human HIN-200 family， in human diseases［J］. Mol Cell Biochem， 202 477（3）： 771-780.

［6］ Liu L， Xu H， Chen JL， et al. Detection of vaginal metabolite changes in premature rupture of membrane patients in third trimester pregnancy： a prospective cohort study［J］. Reprod Sci， 202 28（2）： 585-594.

［7］ 虞湘玲. 足月胎膜早破危險因素及妊娠結局分析［J］. 中國婦幼保健， 202 36（6）： 1243-1245.

［8］ Zhu JM， Ma CL， Luan XM， et al. Inflammasome components and ADAMTS4 in premature rupture of membranes［J］. Mol Med Rep， 202 23（2）： 101.

［9］ 郭一恒， 朱錦明， 彭鳳云， 等. NLRC5和Caspase-1在胎膜早破合并組織學絨毛膜羊膜炎患者中的表達及臨床意義［J］. 實用婦產科雜志， 202 38（12）： 943-947.

［10］ Alifu X， Si S， Qiu Y， et al. The association of vitamin D during pregnancy and mRNA expression levels of inflam-matory factors with preterm birth and prelabor rupture of membranes［J］. Nutrients， 2023， 15（15）： 3423.

［11］ 符春麗， 唐梅， 林麗慧， 等. NLRP3通路相關蛋白在胎膜早破孕婦胎膜組織中的表達及其與組織學絨毛膜羊膜炎的關系［J］. 中華醫院感染學雜志， 202 31（16）： 2502-2506.

［12］ 鄭勝英， 趙志平， 李蓓. 未足月胎膜早破合并宮內感染產婦胎盤NLRP3、 IL-1β、 Fasl表達及其臨床意義［J］. 中南醫學科學雜志， 2023， 51（1）： 57-60.

［13］ Wang X， Jia Y， Wen L， et al. Porphyromonas gingivalis promotes colorectal carcinoma by activating the hematopoietic NLRP3 inflammasome［J］. Cancer Res， 202 81（10）： 2745-2759.

［14］ Freeman SW， Denoble A， Kuller JA， et al. Management of preterm premature rupture of membranes in the late preterm period［J］. Obstet Gynecol Surv， 202 77（5）： 283-292.

［收稿日期］ 2023-04-03" ［編輯］ 劉星星