紅外光譜結合化學計量學方法測定人體腎結石中三聚氰胺

［摘要］ 目的： 建立傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectrometer，FTIR）結合化學計量學鑒別腎結石中三聚氰胺的方法。方法： 通過制備含三聚氰胺的體外模擬草酸鈣（CaOx）結石，分析其中三聚氰胺特征基團信息，篩選出用于化學計量學分析的1 535～1 548 cm-1、983～997 cm-1和704～716 cm-1的特征響應波段。以模擬CaOx腎結石和人體腎結石樣品建立訓練集，以人腎結石建立驗證集，對所獲腎結石樣品紅外譜圖進行基線校正、平滑、矢量歸一化、二階求導、標準正態變量變換法等預處理，采用光譜分析OPUS軟件及數據分析軟件Unscrambler對腎結石樣品進行聚類分析、主成分分析，鑒別人體腎結石中三聚氰胺。結果： 訓練集中，聚類分析對含三聚氰胺腎結石的識別率達到90.9%，主成分分析對含三聚氰胺腎結石的識別率為91.8%；驗證集中，95.0%的含三聚氰胺腎結石被識別。結論： FTIR結合化學計量學可以有效鑒定結石中是否含有三聚氰胺。

［關鍵詞］ 腎結石；三聚氰胺；傅里葉變換紅外光譜；化學計量法；主成分分析；聚類分析

［中圖分類號］ R692.4" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2024）04-0312-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230306

［引用格式］戴江名，龍啟來，徐志兵，等. 紅外光譜結合化學計量學方法測定人體腎結石中三聚氰胺［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（4）： 312-316，323.

［基金項目］浙江省公益技術研究計劃/分析測試項目（LGC20B050005）

［作者簡介］戴江名（2001—），女，碩士研究生；陳亮（通訊作者），高級工程師，碩士生導師，E-mail： chliang88@vip.163.com

Detection of melamine in human kidney stones by infrared spectroscopy combined with chemometrics

DAI Jiangming LONG Qilai XU Zhibing CHEN Bo3， ZHENG Hanxiao LIU Le CHEN Liang1

（College of Biological amp; Environmental Sciences， Zhejiang Wanli University， Ningbo Zhejiang 315100; Department of Urology， Zhongshan Hospital Fudan University， Shanghai 200032; Key Laboratory of Public Health Safety， Ministry of Education， School of Public Health， Fudan University， Shanghai 20003 China）

［Abstract］ Objective： To establish a method for identifying melamine in stones by fourier transform infrared spectrometer （FTIR） combined with chemometrics. By preparing in vitro simulated calcium oxalate （CaOx） stones containing melamine， the characteristic group information of melamine was analyzed， and the characteristic response bands of 1 535～1 548 cm- 983～997 cm-1 and 704～716 cm-1 were selected for stoichiometric analysis. The training set was established with simulated CaOx stones and human kidney stone samples， and the validation set was established with human kidney stones， and the IR spectra of obtained stone samples were preprocessed by baseline correction， smoothing， vector normalization， second-order derivation， and standard normal variable transformation. OPUS software and Unscrambler software were used for cluster analysis and principal component analysis of stone samples to identify melamine in human kidney stones. Results： In the training set， the identification rate of melamine-containing stones was 90.9% by cluster analysis， and 91.8% was identified by principal component analysis. In the validation set， 95.0% of the stones containing melamine were successfully identified. Conclusion： FTIR combined with chemometrics can effectively identify melamine in stones.

［Key words］ kidney stones; melamine; fourier transform infrared spectrum; chemometrics; principal component analysis; cluster analysis

三聚氰胺因2008年的“三鹿奶粉事件”而被熟知［1］，且已被證實可以誘發泌尿系統結石癥（簡稱“尿石癥”）［2-3］。但近年來有研究表明，三聚氰胺暴露與罹患尿石癥的關系不僅限于三鹿奶粉事件等高暴露場景。如我國臺灣學者曾報道環境本底水平的三聚氰胺暴露也可能導致成年人罹患尿石癥［4］。Shi等［5］發現上海市成年居民暴露于三聚氰胺的內負荷水平以國際通用管理限值來評估存在著一定致尿石癥風險。此外，Meta分析顯示我國大陸腎結石的患病率逐年上升，從1991—2000年的5.95%上升至2001—2010年的8.86%和2011—2013年的10.63%［6］。學者Zilberman等［7］認為三聚氰胺暴露可能是尿石癥患病率上升的原因之一。與非法添加相比，人們更應關注日常生活中其他暴露途徑：如三聚氰胺被用于制造密胺餐具并可從中遷移進食物［8］；又如三聚氰胺是殺蟲劑環丙氨嗪的次要代謝產物，可因環丙氨嗪的使用而進入食物鏈［9］。因此，有必要研究三聚氰胺暴露水平與尿石癥的關系，對腎結石標本進行三聚氰胺成分檢測將有助于探討兩者的關系。

國內有學者采用高效液相色譜質譜法檢測腎結石樣品中的三聚氰胺含量［10］。Wu等［11］則采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術檢測了54例鈣結石標本中的三聚氰胺成分。但三聚氰胺參與結石形成的過程中三聚氰酸、尿酸及其他物質可能起協同作用，基于質譜或色譜鑒定三聚氰胺的技術可能存在錯檢或漏檢。相對而言，紅外光譜法對樣品監測無需復雜的處理，建立模型后可在短時間內完成檢測，與化學計量學結合后能對掃描所得光譜數據進行優化處理，從而可有效提高分析方法的靈敏度、選擇性和準確度。本研究擬將傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectrometer，FTIR）與化學計量學結合，對結石譜圖信息進行基線校正（baseline correction，BC）、平滑、矢量歸一化（vector normalization，VN）、一階求導（first derivative，FD）、二階求導（second derivative，SD）、標準正態變量變換（standard normal variable，SNV）、多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）等預處理，計算后得到識別模型，運用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析對腎結石中是否含有三聚氰胺進行識別，建立快速鑒別腎結石中三聚氰胺的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

Vertex70傅里葉紅外光譜儀（OPUS分析軟件、德國Bruker公司）；HY-12壓片機（天津天光新光學儀器科技有限公司）；HW-10型遠紅外線干燥箱（北京興爭儀器設備廠）；電子天平（賽多利斯集團）；pH計（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；磁力攪拌裝置（上?？婆d儀器有限公司）；超聲波清洗機（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；Unscrambler數據處理軟件。

溴化鉀、草酸鉀、三聚氰胺、尿酸均為分析純；人體術后尿路結石樣品共91個；微孔濾膜。

1.2 體外模擬結石的制備

人體混合尿液制備：取5名成年大學生志愿者（2名男性和3名女性）的晨尿，每人尿樣量相同（50 mL），混合并振蕩混勻，經濾膜過濾，測得pH值為6.58。

三聚氰胺儲備液制備：取0.05 g三聚氰胺與適量水于燒杯中，經超聲水?。?0 ℃）溶解后定容于50 mL的容量瓶中，得濃度為1 000 mg/L的三聚氰胺溶液。

體外模擬結石制備：在5個結晶皿中各加入一定體積的人體混合尿液（pH值6.58）和三聚氰胺儲備液的稀釋溶液（濃度依次為1、2、5、10、25 mg/L），同時滴加等量0.01 mol/L的CaCl2及K2C2O4溶液，使［Ca2+］=［C2O42-］=0.60 mmol/L，反應溫度37 ℃，磁力攪拌20 min后陳化4 h，去掉結晶皿中上清液，用濾紙吸去殘留液體，得到不同三聚氰胺含量的模擬CaOx結石。固定CaC2O4亞穩溶液為0.60 mmol/L，三聚氰胺濃度10 mg/L，調整混合尿液的pH值分別為4.00、5.00、6.00、7.00、8.00，制備不同pH值的CaOx結石。另固定三聚氰胺10 mg/L，混合尿液pH值6.58，調整CaC2O4亞穩溶液濃度為0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mmol/L，制備不同CaC2O4亞穩濃度的CaOx結石。同時制取3例不含三聚氰胺的CaOx結石（對應的pH值和CaC2O4濃度分別為6.58、0.60 mmol/L，6.58、1.20 mmol/L，6.00、0.60 mmol/L）。上述CaOx結石置遠紅外干燥箱中干燥1 h后稱量備用。

1.3 結石紅外光譜的采集

取前述模擬CaOx結石及正常泌尿結石樣品，研磨，稱取樣品粉末約1.0 mg于瑪瑙研缽中，再加溴化鉀粉末（樣品∶溴化鉀=1∶100）研磨均勻，取適量樣品平鋪于壓片模具中，壓至20 MPa，取出，對光檢視，以樣片均勻、半透明、完整者為佳。掃描次數16次，分辨率4 cm-1，測定區域4 000～400 cm-1，得到樣品紅外光譜圖。

1.4 結石中三聚氰胺識別模型的建立

對模擬CaOx結石一維紅外光譜進行二階求導，研究結石二階導數譜圖中三聚氰胺的特征峰及峰位，篩選響應波段，設定訓練集和驗證集，選擇體外模擬結石標本（含三聚氰胺15個和無三聚氰胺3個）及患者腎結石標本（含三聚氰胺7個、無三聚氰胺24個）組成訓練集（共49個樣本）；另60個患者腎結石作為驗證集。所獲紅外譜圖通過預處理后利用FTIR配套的OPUS軟件對結石進行聚類分析，配套的Unscrambler數據分析軟件進行PCA分析，建立結石中三聚氰胺的識別模型。聚類分析時，對訓練集和驗證集譜圖進行平滑、基線校正、矢量歸一化、一階求導、二階求導等不同預處理模式。PCA分析時則對光譜數據進行標準正態變量變換、多元散射校正、二階求導、平滑等降維處理。

2 結果與分析

2.1 模擬CaOx結石譜圖解析及波段選取

模擬CaOx結石二階導數譜圖如圖1所示，相較于不加三聚氰胺的模擬CaOx結石，不論人體混合尿液的初始pH值和CaC2O4亞穩溶液的濃度如何變化，加入三聚氰胺后所得CaOx結石在1 546 cm-1、992 cm-1、707 cm-1附近均出現了三聚氰胺特征吸收峰。992 cm-1、707 cm-1兩處是三聚氰胺尿酸結合物的吸收峰。故后續實驗中選取1 535～1 548 cm-1、983～997 cm-1和704～716 cm-1等特征波段區間作為三聚氰胺鑒別判斷的依據。

2.2 結石中三聚氰胺的聚類分析

如圖2可知，選取1 535～1 548 cm-1，983～997 cm-1、704～716 cm-1特征波段，對樣品進行平滑（25點）、基線校正、二階求導、矢量歸一化處理，當49個訓練集樣品類間距離gt;4時，含三聚氰胺的結石被聚為1組，當類間距離gt;6時，訓練集樣品被分為2組，即含三聚氰胺和不含三聚氰胺的結石組，與已知分類歸屬結果相符。在不含三聚氰胺結石的一類子集中，2例含三聚氰胺體外模擬結石的樣品被判為該類；在含三聚氰胺結石的一類子集中，不含三聚氰胺的模擬結石2例和患者結石2例被判為該類。結合表1可知，選擇二階求導+矢量歸一化預處理方法，訓練集27例不含三聚氰胺的結石樣本的正確識別率為85.2%，22例含三聚氰胺的結石樣本的正確識別率則為90.9%，優于其他預處理模型，說明該模型聚類效果較好，可以有效地識別結石中的三聚氰胺。

將驗證集與訓練集樣品在前述模型條件下進行聚類分析，發現驗證集60個結石中22個樣品與訓練集含三聚氰胺的結石聚為一類。實際上，該60個結石樣品中19個含三聚氰胺結石全被識別（識別率95.0%），另有1個被遺漏，同時出現3個錯判，說明該方法用于結石中三聚氰胺的定性鑒別有一定的可行性。

2.3 結石中三聚氰胺的主成分分析

表2表明，訓練集樣品紅外譜圖截取1 535～1 548 cm-1、984～997 cm-1和704～716 cm-1三個波段數據導入Unscrambler軟件，采用二階求導+SNV預處理組合方式的正確識別率為91.8%，優于其他預處理方法。此時第一主成分得分為52%，是結石樣品紅外光譜的最重要信息，第二、第三主成分得分分別為31%和10%，前3個主成分累計貢獻率為93%，僅7%信息丟失，能夠反映紅外光譜大量信息。從圖3中可以看出，含有三聚氰胺的結石樣品的得分分布能夠成簇聚集，與不含三聚氰胺的結石樣品得分分布在相對獨立的空間，反映出結石中三聚氰胺有無的差異性。

將驗證集樣品加入后進行PCA分析，由圖4可見，第一主成分得分為57%，是結石樣品紅外光譜的最重要信息，第二、第三主成分得分分別為29%和8%，前3個主成分累積貢獻率為94%，僅6%信息丟失。從圖4中可以看出驗證集結石樣品可以按其是否含有三聚氰胺聚集在不同區域，離訓練集含三聚氰胺樣品越接近，驗證集中樣品含三聚氰胺的可能性就越大。圖中紅色的是含三聚氰胺的結石，與紅色部分相互聚集的即是驗證集中含三聚氰胺患者結石，共有19個。該驗證集樣品中共有20個樣品含有三聚氰胺，說明驗證集中大多數含三聚氰胺患者結石樣品被識別出。這表明PCA能較為有效地區分患者結石中是否含有三聚氰胺。

3 討論

從結石分型角度來看，CaOx結石是人體尿路結石的主體，故本實驗制備了含三聚氰胺的模擬CaOx結石，采集其一維及導數紅外光譜信息后，分析其中三聚氰胺的特征峰?？紤]到模擬結石的代表性，實驗共制備了不同尿液pH值、不同濃度CaC2O4亞穩溶液及不同三聚氰胺含量的18個模擬結石樣品。

在光譜分析中，導數紅外光譜（derivative infrared spectrum，DIR）是對原始紅外光譜數據進行微分處理得到的光密度對波長（或波數）的變化率曲線，可以消除基線漂移或平緩背景干擾的影響，提供更高分辨率［12］。本實驗利用DIR來篩選用于化學計量學分析的特定相應波段，在制備了含有三聚氰胺的體外模擬CaOx結石后，篩選出1 535～1 548 cm-1、983～997 cm-1和704～716 cm-1作為結石中三聚氰胺聚類分析及PCA的3個特征響應波段。

聚類分析一般計算樣品間的聚類統計量，將相關性最大的聚在一起，以此判別樣品相似性。實驗中針對前述訓練集結石樣品，以FTIR自帶的OPUS分析軟件，對結石的紅外光譜譜圖進行基線校正、平滑、矢量歸一化、二階求導等預處理后，采用離差平方和法計算結石樣品間的歐氏距離，進行聚類分析，比較不同預處理致聚類結果的差異性；同時運用Unscrambler軟件，對結石光譜進行平滑、基線校正、矢量歸一化、二階求導、標準正態變量變換法等預處理后進行PCA，建立結石中三聚氰胺預測分析模型，并以此模型結果顯示訓練集中含三聚氰胺結石中有90.9%能通過聚類分析被識別，有91.8%可以通過PCA被識別。驗證集60個人體腎結石標本中，聚類分析和PCA均從20個含三聚氰胺結石中識別出19個，說明傅里葉紅外光譜結合化學計量學方法用于結石中三聚氰胺的定性鑒別有一定的可行性。

本文結果提示FTIR結合聚類分析和PCA對患者腎結石標本進行鑒別，不僅可以確定結石分型，也可以有效鑒定結石中是否含有三聚氰胺，這將有助于闡明三聚氰胺在腎結石中的作用，為腎結石的預防和治療帶來幫助。

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［收稿日期］ 2023-12-22" ［編輯］ 何承志