穿心蓮內(nèi)酯對(duì)胃癌細(xì)胞鐵死亡的影響

摘要：目的 探討穿心蓮內(nèi)酯對(duì)胃癌細(xì)胞鐵死亡的影響及作用機(jī)制。方法 將胃癌細(xì)胞株AGS分為陰性對(duì)照兩組（NC兩組）和穿心蓮內(nèi)酯處理兩組（AG兩組），分別用含0 μm、20 μm AG的DMSO處理細(xì)胞24 h。通過(guò)CCK-8檢測(cè)分析藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響，通過(guò)Fe2+檢測(cè)法、丙二醛測(cè)定、還原型谷胱甘肽和活性氧檢測(cè)評(píng)估胃癌細(xì)胞鐵死亡水平。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)評(píng)估胃癌細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、SLC7A11表達(dá)水平。 結(jié)果 經(jīng)過(guò)AG處理后，胃癌細(xì)胞活力明顯下降，F(xiàn)e2+、MDA和ROS水平明顯升高，GSH含量明顯降低，GPX4和SCL7A11表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論 穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)影響鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4和SLC7A11表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：穿心蓮內(nèi)酯；胃癌；鐵死亡；GPX4；SLC7A11

胃癌（gastric cancer）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但普遍認(rèn)為幽門(mén)螺旋桿菌感染、吸煙、高鹽飲食、飲酒等是主要的危險(xiǎn)因素。目前手術(shù)是胃癌主要的治療手段，聯(lián)合應(yīng)用放療、化療及靶向治療效果更佳。因此，研究分子機(jī)制途徑，gFJgGKjslonwD44g5N3T7g==開(kāi)發(fā)新的胃癌治療用藥對(duì)提高胃癌生存獲益至關(guān)重要。鐵死亡（ferroptosis）是一種新的非凋亡細(xì)胞死亡模式，是多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡的結(jié)果[2]。鐵死亡的基本特征包括：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性喪失，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化修復(fù)機(jī)制缺陷，引起脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積。越來(lái)越多的研究報(bào)道了鐵死亡與胃癌之間的相關(guān)性，如胃癌細(xì)胞鐵死亡水平降低導(dǎo)致的腫瘤耐藥性[3]。穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AG）是從天然植物穿心蓮中萃取的二萜類內(nèi)酯活性化合物。研究表明，AG具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等功能，而AG的抗腫瘤功能更是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[4]。本研究通過(guò)觀察AG在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)胃癌細(xì)胞鐵死亡的影響，進(jìn)一步探討AG作為抗癌藥物與聯(lián)合藥物的潛能，為尋找新的抗腫瘤活性藥提供理論參考。

1材料與方法

1.1 主要材料和試劑

胃癌細(xì)胞株AGS購(gòu)自普諾賽生物有限公司。穿心蓮內(nèi)酯購(gòu)自默克科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青-鏈霉素混合液、PBS緩沖液購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司。胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。CCK-8試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物有限公司。鐵離子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊科技有限公司。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。C11 BODIPY581/591脂質(zhì)過(guò)氧化探針購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。GPX4抗體、SLC7A11抗體購(gòu)自上海艾博抗有限公司。TBST緩沖液、30%丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨（ammonium persulphate，APS）等購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將胃癌細(xì)胞株AGS在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素混合液）37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代均在生物安全柜中進(jìn)行，細(xì)胞凍存于-80℃冰箱。胃癌AGS細(xì)胞分為陰性對(duì)照兩組（NC兩組）和穿心蓮內(nèi)酯藥物處理兩組（AG兩組）。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)

細(xì)胞種板、加藥處理后，棄掉含有藥物的舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL新培養(yǎng)基，每孔再加入10 μL的CCK-8檢測(cè)液，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.2.3 鐵離子檢測(cè)

向樣本中加入500 μL裂解液，搖床裂解2 h。每份樣品中添加30 μL鐵離子檢測(cè)試劑，37 ℃孵育30 min。酶標(biāo)儀選用550 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。根據(jù)繪制的鐵離子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白濃度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平。

1.2.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)

細(xì)胞種板、加藥處理后，根據(jù)MDA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，裂解液充分裂解細(xì)胞后，離心10 min后取上清液，加入TBA溶液混勻，95 ℃孵育60 min。取200 μL樣品加入96孔板中，酶標(biāo)儀選用532 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。依據(jù)繪制的MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白濃度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)MDA水平。

1.2.5 GSH測(cè)定

細(xì)胞種板、加藥處理后，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，加入5 mL的PBS緩沖液，離心10 min收集細(xì)胞，按照每106個(gè)細(xì)胞加入300 μL勻漿介質(zhì)，進(jìn)行超聲破壁，離心后取上清置于冰上待測(cè)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)添加相關(guān)試劑，酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。依據(jù)繪制的GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)GSH水平。

1.2.6 ROS檢測(cè)

細(xì)胞種板、加藥處理后，應(yīng)用脂質(zhì)過(guò)氧化熒光探針C11 BODIPY581/591、流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。向待測(cè)細(xì)胞添加脂質(zhì)過(guò)氧化熒光探針，在37 ℃、避光環(huán)境轉(zhuǎn)給你孵育1 h。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）實(shí)驗(yàn)

使用RIPA裂解細(xì)胞20 min后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL樣品管中。4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min后取上清并提取蛋白。測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度后，按照1：4體積添加蛋白上樣緩沖液，充分混勻后在95 ℃金屬浴中孵育5 min，在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ?5 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜后，脫脂牛奶封閉2 h。將蛋白條帶用TBST緩沖液清洗，一抗孵育過(guò)夜。二抗室溫下孵育1 h。加入顯影液，在暗室中使用顯影儀顯影。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，使用未配對(duì)t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，使用單因素方差（ANOVA）分析多組間的差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入穿心蓮內(nèi)酯后，胃癌細(xì)胞的活力明顯下降（P＜0.05）。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)胃癌細(xì)胞鐵死亡的影響

鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：加入穿心蓮內(nèi)酯后，細(xì)胞Fe2+濃度、MDA水平明顯升高，GSH水平明顯下降（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AGS細(xì)胞發(fā)生鐵死亡而累積的ROS水平明顯升高（P＜0.05）。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

通過(guò)提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：加入穿心蓮內(nèi)酯后，鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、SLC7A11表達(dá)水平明顯下降，鐵死亡激活。見(jiàn)圖6。

3討論

胃癌早期癥狀不明顯，且缺乏特異性診斷標(biāo)志物，臨床上大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期或晚期階段。鐵死亡是一種以脂質(zhì)過(guò)氧化物、鐵離子累積為主要特征的程序性死亡。研究顯示，miR-375在體內(nèi)外均可降低胃癌細(xì)胞的干性，直接靶向SLC7A11，并且觸發(fā)SLC7A11依賴的鐵死亡來(lái)減弱胃癌細(xì)胞的干性[5]。因此，鐵死亡作為一個(gè)潛在的腫瘤治療機(jī)制，在解決腫瘤耐藥、抑制腫瘤生長(zhǎng)方面有廣泛的應(yīng)用前景。

現(xiàn)代腫瘤治療中，天然中草藥單體因其產(chǎn)量大而穩(wěn)定、副作用少等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為抗癌藥及聯(lián)合用藥的最佳來(lái)源之一。以穿心蓮內(nèi)酯為代表yGeJPiSOPdLnTS3QNEyfr6Cw1AUHrZKug5aYNyG8QFo=的二萜類化合物，因其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤等藥理作用，為穿心蓮的藥理活性提供了廣泛的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，穿心蓮內(nèi)酯在胃癌[10]、肝癌等多種體內(nèi)外腫瘤模型中具有不同的治療功效。

本研究應(yīng)用胃癌細(xì)胞AGS加入穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行藥物處理細(xì)胞后開(kāi)展研究。通過(guò)細(xì)胞活力和鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)AGS細(xì)胞活力具有明顯的抑制作用，能夠明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。既往研究表明，鐵死亡激活劑（如索拉非尼，埃拉斯汀等）通過(guò)直接或間接途徑靶向核心分子GPX4，從而阻斷其對(duì)復(fù)雜脂質(zhì)氫過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用，進(jìn)而誘發(fā)鐵死亡[6]。本研究通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加入穿心蓮內(nèi)酯處理后，胃癌細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、SLC7A11出現(xiàn)了明顯降低，鐵死亡激活。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)影響GPX4和SLC7A11蛋白的表達(dá)水平誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。但是對(duì)于穿心蓮內(nèi)酯影響胃癌細(xì)胞鐵死亡具體靶向的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期為胃癌綜合治療提供更加充分的用藥方案和治療靶點(diǎn)參考。

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