冬凌草甲素對人鼻咽癌HONE-1 細胞增殖、遷移和凋亡的影響

［摘 要］ 目的：探討冬凌草甲素對人鼻咽癌HONE-1細胞增殖、遷移、上皮-間質轉化（EMT）和凋亡的影響，闡明其相關抗腫瘤機制。方法：鼻咽癌HONE-1細胞經不同濃度 （0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1） 冬凌草甲素處理48 h 后，采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖抑制率，確定后續實驗的用藥濃度。HONE-1 細胞分為對照組、3 mg·L-1 冬凌草甲素組和6 mg·L-1 冬凌草甲素組，培養24 和48 h 后，采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU） 法檢測各組細胞中EdU 陽性細胞率， 克隆形成實驗檢測各組細胞中克隆形成數， Transwell 小室實驗和細胞劃痕實驗檢測各組細胞中遷移細胞數和劃痕愈合率， 實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶1 （CDK1） 和細胞周期蛋白依賴性激酶4 （CDK4） mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組細胞中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）和多腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）蛋白表達水平。結果：CCK-8法確定冬凌草甲素48 h 半數抑制濃度（IC50） 為12. 18 mg·L-1，以1/4 IC50 和1/2 IC50 值為后續實驗用藥濃度。與對照組比較， 24 和48 h 時3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細胞增殖活性降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， EdU 陽性細胞率降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， 細胞中克隆形成數和遷移細胞數減少（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），劃痕愈合率降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），細胞中CDK1 和CDK4 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， E-cadherin、Caspase-3 和PARP1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），Vimentin蛋白表達水平降低 （Plt;0. 05）。結論：冬凌草甲素可通過抑制細胞周期相關蛋白的表達及EMT，進而抑制人鼻咽癌HONE-1 細胞增殖、克隆形成和遷移能力，促進細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。

［關鍵詞］ 冬凌草甲素； 鼻咽腫瘤； 細胞周期； 上皮-間質轉化； 細胞凋亡

［中圖分類號］ R285. 5； R739. 63 ［文獻標志碼］ A

我國是鼻咽癌高發國家之一［1］，且南方發病率高于北方。鼻咽癌是一種發生于鼻咽部上皮內黏膜的鱗狀細胞癌，以遠處轉移為特征［2］，因鼻咽位置隱蔽，同時鼻咽癌的早期癥狀比較復雜，缺乏特異性表現，易被忽視，故多數患者就診時常處于晚期階段［3］。鼻咽癌治療方式主要是以放療為主［4］、化療為輔的綜合治療，但有許多患者易產生放療抵抗和化療耐藥。冬凌草甲素是一種從唇形科香茶菜屬植物中分離出來的有生物活性的二萜類天然物質［5］。既往研究［6-9］ 表明：冬凌草甲素具有抗炎和抗氧化的功效，同時還具有誘導細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡和抑制血管生成等明顯的抗癌活性及肝腎和心臟保護活性。冬凌草甲素在肺癌、甲狀腺癌和肝癌等多種腫瘤中發揮一定的抗腫瘤作用， 但其在鼻咽癌中的作用鮮有報道。本研究探討冬凌草甲素對人鼻咽癌HONE-1 細胞增殖和凋亡的影響，闡明其相關抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器

人鼻咽癌HONE-1細胞由濱州醫學院附屬醫院醫學研究中心提供。冬凌草甲素購于上海麥克林生化科技股份有限公司，DMEM 培養基購于上海龍田生物科技有限公司，胎牛血清購于中國ExCell Bio 科技有限公司，CCK-8 試劑購于美國Genview 公司，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine EdU） 試劑盒購于蘇州優逸蘭迪生物科技有限公司，Transwell 小室購于武漢來博賽斯科技有限公司，預染蛋白marker 購于中國臺灣SMOBIO 科技有限公司， 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜和ECL 顯影液購于美國Millipore 公司，結晶紫染液和RIPA 裂解液購于北京索萊寶科技有限公司， TRIzol 試劑、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 和脫脂奶粉購于生工生物工程（上海） 股份有限公司，十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）購于上海雅酶生物科技有限公司， 5×loading buffer 購于上海碧云天生物科技有限公司，GAPDH 抗體、E- 鈣黏蛋白（E-cadherin） 抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cysteinylaspartate specific proteinase-3， Caspase-3） 抗體和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1 （poly ADP-ribosepolymerase 1，PARP1） 抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司，波形蛋白（Vimentin） 抗體購于天津博士德生物科技有限公司，SYBR qPCR SuperMixplus 購于中國Novoprotein 生物公司， 逆轉錄試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific 公司。CO2 細胞培養箱和多功能酶標儀購于美國Thermo FisherScientific 公司，普通光學顯微鏡購于中國Motic 公司， 熒光顯微鏡購于日本Olympus 公司， Countstar 全自動細胞計數儀購于上海睿鈺生物科技有限公司，渦旋混合儀購于寧波新芝生物科技股份有限公司， 實時熒光定量PCR （real-time fluorescencequantitative PCR， RT-qPCR） 儀、電泳槽和凝膠成像儀購于美國Bio-Rad 公司。

1. 2 細胞培養

HONE-1 細胞在 DMEM 培養基（含10% 胎牛血清和1% 鏈霉素-青霉素雙抗） 中，置于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，待細胞貼壁生長后取對數生長期HONE-1 細胞， 用0. 25% 胰蛋白酶消化， 在顯微鏡下觀察， 細胞變圓、間距變大并有細胞脫落時加入等體積的完全培養基終止消化， 用移液槍輕柔吹打直至貼壁細胞完全脫落。將吹打混勻的細胞懸液移至高壓滅菌的離心管中，1 000 r·min-1 離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養基重懸， 1∶ 3 比例接種至培養皿中繼續培養，用于后續實驗或制成單細胞懸液備用。

1. 3 CCK-8法檢測不同濃度冬凌草甲素組細胞增殖抑制率和各組細胞增殖活性

取對數生長期HONE-1 細胞制成單細胞重懸液，按照臺盼藍∶細胞重懸液=1∶ 1 比例混合均勻。調整細胞密度為3×104 mL-1，取100 μL 接種于96 孔細胞培養板中，每組設3 個復孔。待細胞貼壁后，用濃度為0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1冬凌草甲素培養48 h，每孔加5 μL CCK-8 試劑繼續培養3 h，采用酶標儀測定450 nm 波長處吸光度（A） 值， 實驗重復3 次， 取不同時間點的平均A 值， 并且以0 h 的平均A 值進行歸一化處理后，繪制隨藥物濃度變化的細胞增殖抑制率曲線，計算各組細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率= （對照組A 值－實驗組A 值） /對照組A 值×100%， 采用GraphPad Prism 8. 0. 1統計軟件計算冬凌草甲素半數抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration， IC50）。將單細胞懸液接種于培養皿中， 待細胞貼壁且鋪滿培養皿50%～60% 時，以不加藥組細胞為對照組，以加入不同濃度（1/4 IC50 和1/2 IC50， 即3 和6 mg·L-1）冬凌草甲素組為實驗組，繼續培養48 h 后，調整細胞密度為3×104 mL-1，取100 μL 接種于96 孔細胞培養板中，每組設3 個復孔。在細胞貼壁24 和48 h時每孔加入5 μL CCK-8 試劑，3 h 后檢測各組細胞A 值，以A 值代表各組細胞增殖活性。

1. 4 EdU法檢測各組HONE-1細胞中EdU陽性細胞率

細胞分組方法見“1. 3”。取各組細胞制成單細胞重懸液，細胞計數后調整細胞密度為2×104 mL-1，取100 μL 接種于96 孔細胞培養板中， 每組設3 個復孔， 培養48 h 后， 采用EdU 試劑盒進行染色，染色完成后采用熒光顯微鏡觀察拍照。在熒光顯微鏡下，EdU 標記的陽性細胞為紅色。隨機選取3 個視野計數陽性細胞數，計算EdU 陽性細胞率。EdU陽性細胞率=EdU 陽性細胞數/總細胞數×100%。

1. 5 克隆形成實驗檢測各組細胞中克隆形成數

取處于對數生長期且狀態良好的細胞，計數，調整細胞密度為300 mL-1， 接種于6 孔細胞培養板中，分組和處理方法見“1. 3”。在37 ℃、5% CO2細胞孵育箱中培養10 d，更換培養基2 次，待肉眼觀察到細胞集落后終止培養。棄上清， 用PBS 緩沖液清洗3 次，80% 無水乙醇固定30 min。棄掉固定液， 用PBS 緩沖液清洗3 次， 結晶紫溶液染色15 min。用流水沖洗， 干燥后拍照， 計數克隆形成數。

1. 6 Transwell小室實驗檢測各組細胞中遷移細胞數

細胞分組方法見“1. 3”。取各組HONE-1 細胞制成單細胞重懸液，細胞計數后用無血清培養基調整細胞密度為1. 5×104 mL-1， Transwell 小室下室加入含有20% FBS 的培養基800 μL，輕輕放入小室避免產生氣泡，小室上室加入200 μL 細胞懸液。輕輕震蕩后放入細胞培養箱孵育72 h。孵育完成后棄掉上室細胞懸液，用棉簽輕輕擦掉上室底層的細胞，結晶紫溶液染色10 min，用PBS 緩沖液浸泡數次，倒置顯微鏡下采集圖像。各組隨機選取6 個視野，計數各組細胞中遷移細胞數。

1. 7 細胞劃痕實驗檢測各組細胞劃痕愈合率

細胞分組方法見“1. 3”。取各組生長狀態良好的細胞制成單細胞重懸液，細胞計數后取5×105個細胞接種于6 孔細胞培養板中。待細胞貼壁且鋪滿孔板后，取一直尺使其平面橫穿于孔板上方，使用20 μL 滅菌槍頭，垂直并緊貼直尺進行劃痕，每孔橫縱各一條劃痕。劃痕結束后，采用PBS 緩沖液清洗3 次，去除滑落的細胞，加入無血清培養基，37 ℃、5%CO2 細胞孵育箱中培養，分別于0、24 和48 h 后取樣拍照。測量各組不同時間段的劃痕寬度，計算細胞劃痕愈合率。細胞劃痕愈合率= （0 h 劃痕寬度-24 或48 h 劃痕寬度） /0 h 劃痕寬度×100%。

1. 8 RT-qPCR法檢測各組細胞中CDK1和CDK4mRNA 表達水平

細 胞 分 組 方 法 見 “1. 3”。 收集各組細胞沉淀， 參照說明書采用TRIzol 法提取細胞總RNA， 逆轉錄合成cDNA， 使用Nanodrop測定逆轉錄產物濃度， 并 用 DEPC 水 稀 釋 至200 mg·L-1 ， 以GAPDH 為內參擴增CDK1 和CDK4 基因。引物序列： CDK1， F 5'-GTGCATCTACACCGACAACTCCA-3'，R 5'-TGAGCTTGTTCACCAGGAGCA-3'； CDK4， F 5'-CTCTGCGTCCAGCTGCTCCG-3'，R 5'- AGGGAGACCCTCACGCCAGC-3'； GAPDH， F 5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'， R 5'- CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。反應條件： 95 ℃ 、15 s，53 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共35 個循環。實驗重復3 次。采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA 水平。

1. 9 Western blotting 法 檢 測 各 組 細 胞 中E-cadheren、Vimentin、Caspase-3和 PARP1蛋白表達水平

細胞分組方法見“1. 3”。收集各組細胞，以預冷的PBS 緩沖液充分洗滌細胞2 次，加入適量RIPA 裂解液∶ PMSF=100∶ 1 比例配制的蛋白裂解液（現用現配） 后冰上裂解30 min，每10 min 震蕩混勻1 次使其充分裂解， 4 ℃、12 000 r·min-1 離心10 min， 取上清轉移至新的EP 管中， 加入1/4的5× 蛋白上樣緩沖液， 金屬浴100 ℃， 10 min 變性。采用SDS-PAGE 電泳。上樣體積為10 μL，中間上蛋白樣品，兩邊上maker 并用1×蛋白上樣緩沖液補齊上樣體積。半干法將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶常溫封閉1 h，分別加入一抗E-cadherin、Vimentin、Caspase-3、PARP1和GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜完成后加入HRP 標記的羊抗兔或羊抗鼠抗體（稀釋比例1∶1 000） 常溫孵育1 h， TBST 洗膜3 次， 每次10 min。配制ECL顯影液，采用化學發光法顯色曝光。采用Image J圖像分析系統對圖像掃描，計算各組細胞中目的蛋白的表達水平。目的蛋白的表達水平=目的蛋白條帶的灰度值/內參GAPDH 灰度值×100%。

1. 10 統計學分析

采用GraphPad Prism 8. 0. 1統計軟件進行統計學分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗對各組數據進行正態性檢驗， 各組細胞增殖活性、EdU 陽性細胞率、克隆形成數、遷移細胞數和劃痕愈合率，各組細胞中CDK1 和CDK4 mRNA 表達水平，各組細胞中E-cadheren、Vimentin、Caspase-3和PARP1 蛋白表達水平均符合正態分布，以-x± s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 冬凌草甲素的 IC50和各組細胞增殖活性

不同濃度（0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1） 冬凌草甲素（每組3 個復孔） 分別作用于HONE-1 細胞48 h 后，隨著冬凌草甲素濃度升高，各組細胞增殖抑制率明顯升高。根據以上結果計算出冬凌草甲素的 IC50 為12. 18 mg·L-1。 與對照組比較，24 和48 h 時3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細胞增殖活性降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖1。

2. 2 各組細胞中 EdU 陽性細胞率

與對照組（34. 35%±1. 01%） 比較，3 和6 mg·L-1冬凌草甲素組EdU 陽性細胞率（29. 83%±1. 33% 和19. 34%±0. 32%） 降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖2。

2. 3 各組細胞克隆形成數

與對照組（81. 00個±5. 66 個） 比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組克隆形成數（51. 00 個±2. 83 個和3. 50 個±0. 707 個） 減少（Plt;0. 05）。見圖 3。

2. 4 各組細胞中遷移細胞數

與對照組（52. 00個±3. 00 個） 比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細胞中遷移細胞數（42. 00個±3. 00個和22. 67個±1. 53個）減少（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖4。

2. 5 各組細胞劃痕愈合率

與對照組 （59. 80%±7. 02% 和86. 70%±2. 83%） 比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細胞24 h 劃痕愈合率（26. 42%±1. 21% 和6. 09%±4. 44%） 和48 h 劃痕愈合率（47. 25%±3. 75% 和9. 62%±4. 66%） 降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖5。

2. 6 各組細胞中 CDK1 和 CDK4 mRMA 表達水平

與對照組比較，3 和6 mg·L-1 冬凌草甲素組細胞中CDK1 和CDK4 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖6。

2. 7 各組細胞中 E-cadherin、Vimentin、Caspase-3和 PARP1 蛋白表達水平

與對照組比較， 3 和6 mg·L-1冬凌草甲素組細胞中E-cadherin、Caspase-3和PARP1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， Vimentin 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。見圖7。

3 討 論

近年來， 國內外多項研究［10-14］ 表明： 冬凌草甲素對腫瘤的發生發展具有一定的抑制作用。在肺癌中，冬凌草甲素能抑制肺癌細胞生長并促進細胞凋亡，與放療聯合使用時可通過增加細胞DNA 損傷和細胞凋亡來增強放療反應，同時也可有效抑制異種移植瘤的生長， 可通過下調B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 和上調Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax） 增強肺癌的放療敏感性；在甲狀腺癌中，冬凌草甲素可通過下調非受體型蛋白酪氨酸激酶家族信號通路抑制EMT 和血管生成；在肝癌中，其衍生物可通過線粒體途徑觸發肝癌細胞的凋亡；但其在鼻咽癌中的作用少見報道。

本研究結果顯示：采用冬凌草甲素處理后，與對照組比較，HONE-1 細胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和劃痕愈合能力均減弱，表明冬凌草甲素能夠抑制HONE-1 細胞的增殖和遷移。

細胞周期蛋白是一類與細胞周期功能狀態密切相關的蛋白質家族，可通過與特定蛋白激酶結合并激活其活性，從而在細胞周期的不同階段發揮調控作用［15］。CDK1 和CDK4 是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr） 蛋白激酶，在細胞周期循環中發揮重要作用［16-17］。本研究結果顯示：冬凌草甲素處理后人鼻咽癌HONE-1 細胞中CDK1 和CDK4mRNA 表達水平降低， 提示冬凌草甲素能抑制鼻咽癌HONE-1 細胞的分裂能力。

EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在癌癥的進展和轉移過程中發揮了重要作用［18］， 其主要的特征為細胞黏附分子表達水平降低［19-20］，細胞角蛋白細胞骨架轉化為Vimentin 為主的細胞骨架及形態上具有間充質細胞的特征［21］。通過EMT， 上皮細胞失去了細胞極性，失去了與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型。本研究結果顯示：冬凌草甲素作用后，HONE-1 細胞中E-cadherin 蛋白表達水平升高，Vimentin 蛋白表達水平降低，說明冬凌草甲素可控制HONE-1 細胞的EMT 過程，抑制其遷移和侵襲，促進細胞凋亡，抑制細胞外基質的降解。Caspase-3 是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中發揮著重要的作用［22］。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerases，PARPs） 是一個超大蛋白酶家族， 在DNA 修復、染色質組織、基因組完整性、炎癥過程和細胞凋亡過程中發揮重要作用［23］， 也是細胞凋亡核心成員含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteineaspastic acid-specific proteases， Caspases） 的切割底物。PARP1 作為PARPs 家族的重要成員之一，能快速標記細胞DNA 損傷的位置，通過相關系統來清除DNA 的損傷［24］。本研究結果顯示：冬凌草甲素處理后， 鼻咽癌HONE-1 細胞中Caspase-3 和PARP1 蛋白表達水平升高， 表明冬凌草甲素可以誘導鼻咽癌HONE-1 細胞凋亡，但其具體促凋亡機制仍有待深入研究。

綜上所述，冬凌草甲素可抑制鼻咽癌HONE-1細胞的增殖能力、克隆形成能力和遷移能力，并參與誘導細胞凋亡過程，進而抑制腫瘤的生長。本研究為尋找鼻咽癌新的治療方法奠定了基礎。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

梁超參與研究設計、實驗操作和論文撰寫，代娟娟參與實驗操作，周寧參與數據收集、整理和分析，王丹丹和趙杰參與細胞表型實驗和細胞處理， 安迪參與論文校對，武艷參與論文審校。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（81903102）；山東省科技廳自然科學基金項目（ZR2023MH126）；山東省衛健委醫藥衛生科技發展計劃項目（202202080906）；濱州醫學院科研計劃與科研啟動基金項目（BY2019KJ04）；濱州醫學院“臨床+X”項目（BY2021LCX23）