不同作物與雪茄煙輪作對根際土壤真菌群落結構和功能的影響

摘 要 為明確雪茄煙與不同作物輪作對根際土壤真菌群落結構和功能的影響，利用Mi-Seq高通量測序技術分析雪茄煙-雪茄煙連作（C1）、雪茄煙-萬壽菊輪作（C2）、雪茄煙-玉米輪作（C3）和雪茄煙-水稻輪作（C4）處理的根際土壤真菌群落組成和功能特征。結果表明：1）不同輪作作物根際土壤真菌群落的物種數目不同，輪作水稻處理的真菌物種數目最多（603個），輪作玉米的真菌物種數目最少（509個）；2）不同作物輪作對根際土壤真菌分布有重要的影響，與連作相比，輪作萬壽菊或水稻增加了根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度，但輪作玉米降低了真菌群落的豐富度；3）在門水平上，不同輪作處理對根際土壤真菌優勢菌群的組成影響不大，但對優勢菌的相對豐度影響較大；4）屬水平上，輪作處理的鐮刀菌屬（Fusarium）、亡革菌屬（Thanatephorus）、枝孢屬（Cladosporium）、被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度較連作增加；5）輪作模式影響根際土壤真菌的組成、多樣性及功能。因此，在雪茄煙栽培中應結合當地實際情況選擇適宜的輪作模式，從而提高耕地資源利用率及雪茄煙的優質栽培技術水平。

關鍵詞 雪茄煙；輪作；根際土壤；真菌；群落結構

中圖分類號：S572 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.15.003

雪茄煙（Cigar）是一種晾制煙，具有香氣濃郁、吃味濃、勁頭大等煙質特性[1]。世界優質的雪茄煙葉主要產自巴西、古巴、多米尼加和印度尼西亞等國家[2]。數據顯示，中國式卷煙生產及銷量均略有下降，但中國雪茄煙的產量、銷量及銷售額均顯著增長，雪茄煙產業已成為我國煙草行業新的經濟增長點[3]。但目前我國生產優質雪茄煙葉的技術水平不高，中高端雪茄煙原料絕大部分以進口為主，嚴重影響中式雪茄產業經濟的快速增長[4]。雪茄煙葉的生產對土壤、氣候等環境因素的要求較高，微生物在土壤生態修復及可持續利用中發揮著不可代替的作用[5]。因此，研究不同輪作模式對土壤微生物群落的影響，對推動中式雪茄煙產業的發展具有重要意義。

植物的健康生長受植物與微生物相互作用的影響[6]。在土壤微生物群落中，真菌是主要成員之一，有益真菌可以促進植物生長、誘導植物產生抗性或抑制病原菌的生長，有害真菌則侵染植物，阻礙植物健康生長[7-9]。

作物輪作是指在同一塊地里輪流種植不同類型的作物。輪作可以增強土壤微生物活性，增加有益微生物，減少有害微生物，修復土壤生態環境[10]。例如，煙-蒜輪作改善了土壤微生態環境，富集了有益微生物，減少了病原微生物[11]。輪作增加了作物多樣性，對土壤微生物有積極的影響，也使微生物群落因作物殘留物的差異而不同。然而，種植方式對雪茄煙根際土壤微生態的影響尚未得到詳細研究，尤其是連作后雪茄煙根際土壤微生物動態變化，這種認識的缺乏影響雪茄煙種植業的發展。本研究利用高通量Illumina MiSeq測序分析不同種植方式下雪茄煙根際土壤中真菌群落結構，為克服雪茄煙連作障礙提供新的依據，促進雪茄煙種植業的發展。

1 "材料與方法

1.1 "試驗地點

采樣點位于云南保山潞江壩（北緯24.94°，東經98.87°）。地處云南怒江大峽谷、高黎貢山東側山腳，距離保山市區67 km。潞江壩地區氣候屬于亞熱帶熱帶干熱河谷氣候，海拔640～3 510 m，海拔高，日照時間長，晝夜溫差大，全年無霜凍。選擇連續種植了3年（每年種植2茬）雪茄煙的地塊，開展不同栽培方式的比較試驗。

1.2 "試驗設置及采樣

在連續3年種植雪茄煙（云雪39號）的地塊中，設置4個輪作處理（見表1）：連續種植雪茄煙-雪茄煙（C1）、雪茄煙-萬壽菊輪作（C2）、雪茄煙-玉米輪作（C3）和雪茄煙-水稻輪作（C4）。每個處理重復3次，共12個小區，小區面積20 m×5 m=100 m2，用深2 m的混凝土隔開四周。各作物種植密度：雪茄煙25 950株·hm-2、萬壽菊44 440株·hm-2、玉米25 950株·hm-2、水稻83 325株·hm-2。各小區的田間管理措施一致。

土樣采集于2022年9月2號上午進行，按照五點取樣法采樣。隨機選取長勢一致的植株，連同根系一起取出，除去較大的土塊，用無菌長毛刷采集植株根系的泥土，收集完畢后，將5個取樣點的泥土混勻，成為對應取樣點的一個土樣品副本（約1 kg），然后放入無菌敷料自封箱中，每個處理取3個重復，合計12個土壤混合樣品，并作為土壤待測標本。將所采集的土壤樣品置于-80 ℃冰箱保存，后續進行高通量測序分析。

1.3 "DNA提取、PCR擴增和Illumina MiSeq測序

使用Fast DNA SPIN KIT For Soil （MP Biomedicals， LLC）試劑盒進行基因組DNA提取，具體步驟按試劑盒說明書操作。DNA質量檢測采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，如果條帶清晰、完整，可以直接在后續測試中使用。

PCR反應體系50 μL：2 μL模板DNA、2 μL正向引物（10 μmol L-1）、2 μL反向引物（10 μmol L-1）、4 μL dNTPs （2.5 μmol L-1）、5 μL 10×Pyrobest緩沖液、0.3 μL Pyrobest DNA聚合酶（2.5 μL-1）和34.7 μL ddH2O。引物用ITS F：（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和R：（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[12]。

根據Illumina的基因組DNA文庫制備程序，將采集的DNA產物用于構建Illumina配對的末端文庫。然后按照標準方案在Illumina MiQ平臺（北京擎科生物有限公司）上對擴增子文庫進行配對末端測序。

1.4 "測序數據的處理和分析

對原始測序序列進行優化，獲得有效序列，并對有效序列進行聚類/去噪，劃分OTUs/ASVs（后面統一稱之為Feature），并按照Feature的序列組成得到它的物種分類；基于Feature特征的分類分析，并結合Alpha多樣性分析根際土壤真菌物種多樣性，Excel軟件統計Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數，利用SPSS軟件進行單因素方差分析[13]。

2 "結果與分析

2.1 "高通量測序數據分析

不同作物輪作的12個根基土壤樣品，共測得原始序列959 658條，經過濾和雙端拼接得到有效序列803 001條，平均有效序列66 916條。所有序列都在相似度97%的水平下進行OTU分類，獲得的OTU總數為6 513個，平均每個樣本的OTU數量為542個。

2.2 "Alpha多樣性分析

由表2可見，使用Mi-Seq平臺對收集的樣品進行高通量測序，所有樣品覆蓋率（Coverage）數值均為1，說明物種被檢測出來的概率為100%，能夠真實反映樣品情況。根際土壤真菌群落α多樣性分析結果顯示：與連作相比，輪作萬壽菊顯著增加了土壤真菌群落的豐富度和多樣性；輪作玉米增加了土壤真菌群落的多樣性，減少了真菌群落的豐富度，但差異不顯著；輪作水稻顯著增加了土壤真菌群落的多樣性，豐富度也增加但不顯著。說明，輪作萬壽菊或水稻能夠增加根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度，且輪作不同作物對根際土壤真菌群落的影響程度也不同。

2.3 "不同輪作模式的根際土壤真菌物種組成分析

由圖1可知，不同輪作處理下被鑒定出的真菌數目有差異。輪作水稻的包含603種，輪作玉米包含509種，輪作萬壽菊包含538種，雪茄煙連作包含521種種；4種輪作模式共有的有16種，分別占C1、C2、C3、C4處理的3.07%、2.97%、3.14%、2.65%；C1、C2、C3、C4處理各自特有的種分別為408、405、363、483種，占對應處理的78.31%、75.28%、71.32%、80.01%。與連作相比，輪作水稻和萬壽菊顯著增加了根際土壤的真菌數目，且輪作水稻處理特有的真菌數最多；輪作玉米則減少了根際土壤的真菌數目，且特有的真菌數最少。表明，輪作水稻或萬壽菊能夠增加根際土壤真菌群落的豐富度。

2.3.1 "門水平上優勢菌

在門水平上（圖2a，見封三），雪茄煙連作處理的優勢菌為子囊菌門（Ascomycota，31.76%），其次是壺菌門（Chytridiomycota，28.15%）和擔子菌門（Basidiomycota，9.18%）；輪作萬壽菊的優勢菌種有子囊菌門（Ascomycota，47.00%）、擔子菌門（Basidiomycota，23.08%）、壺菌門（Chytridiomycota，5.83%）；輪作玉米的優勢菌種有子囊菌門（Ascomycota，57.40%）、擔子菌門（Basidiomycota，13.16%）、球囊菌門（Glomeromycota，11.95%）；輪作水稻的優勢菌種有子囊菌門（Ascomycota，63.01%）和擔子菌門（Basidiomycota，14.12%）、霉菌門（Mortierellomycota，6.04%）。綜上，不同輪作模式對根際土壤真菌優勢菌群的組成影響不大，但對優勢菌群的相對豐度影響較大。

2.3.2 "屬水平上的優勢菌

在屬水平上（圖2b，見封三），雪茄煙連作處理的優勢屬為鐮刀菌屬（Fusarium，3.56%）；輪作萬壽菊處理的優勢屬為鐮刀菌屬（Fusarium，12.97%）、亡革菌屬（Thanatephorus，8.66%）；輪作玉米處理的優勢屬為枝孢屬（Cladosporium，23.3%）、鐮刀菌屬（Fusarium，6.12%）；輪作水稻處理的優勢屬為枝孢屬（Cladosporium，20.49%）。與連作相比，輪作處理增加了枝孢屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、亡革菌屬（Thanatephorus）、被孢霉屬（Mortierella）、Ramicandelaber的相對豐度，減少了unidentified、未定義真菌（unclassified_Fungi）和Others的相對豐度。

2.4 "物種組成差異分析

對4種輪作模式下土壤真菌群落結構相似性進行聚類分析，結果顯示，真菌群落聚為3組（圖3，見封三）。C1、C2單獨各成一個分支，C3與C4模式真菌群落聚集在同一個分支上。表明，輪作玉米或水稻對根際土壤真菌群落的影響效果相似，輪作萬壽菊、雪茄煙連作對根際土壤真菌群落的影響效果相似。

進一步分析輪作模式下根際土壤真菌在屬水平上的差異，對相對豐度排前11位的真菌屬進行單因素方差分析（圖4，見封三）。發現被孢霉屬（Mortierella）、亡革菌屬（Thanatephorus）、枝孢屬（Cladosporium）在不同種植模式下有顯著差異；C1處理的unclassified_Fungi與其他處理有顯著差異；C2處理的鐮刀菌屬（Fusarium）、Ramicandelaber與其他處理有顯著差異；C4處理的unclassified_Ascomycota、unclassified_Basidiomycota與其他處理有顯著差異。

2.5 "環境功能預測

借助FUNGuild進行功能預測分析（圖5，見封三），發現不同種植模式下根際土壤真菌具有多種功能。輪作處理的動物內生菌-動物病原體-未定義腐生真菌（Animal Endosyinions-Animal Pathogen-Undeincd Saproeruph）、動物內生菌-動物病原體-內生菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（Animal Endosyhiore-Animal pathages-Endophyte-Plant Pathogen-Undeincd Saproeruph）和內生菌-地衣菌寄生菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）的相對豐度較連作顯著降低，且輪作萬壽菊或水稻處理效果最明顯；輪作處理的叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhizal）相對豐度較連作顯著增加，且輪作玉米處理效果最明顯。

3 "結論與討論

根際土壤真菌群落結構受多種因素的影響，如作物種類、栽培管理措施和土壤環境因子[14]。本研究中，與雪茄煙連續單一種植相比，輪作萬壽菊或水稻能夠增加根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度，尤其是輪作水稻。研究表明，根際土壤真菌的多樣性和豐富度與生態系統結構穩定呈正相關[15]。本試驗中，水-旱輪作（雪茄煙-水稻）的根際土壤中真菌群落豐富度指數顯著高于旱-旱輪作（雪茄煙-雪茄煙、雪茄煙-萬壽菊、雪茄煙-玉米）模式，這與張新成等的研究結果相一致[16]。推測其可能是水-旱輪作和旱-旱輪作的C/N比例不同導致的結果，通常情況下C/N與真菌增長呈正相關。因此，雪茄煙-水稻輪作模式能夠顯著增加真菌群落的豐富度。

連作會改變土壤真菌平衡，減少有益真菌，增加致病真菌[17]。合理輪作在一定程度上能夠改善土壤生態環境，如增加真菌多樣性，抑制病原過度繁殖，產生拮抗菌等，從而減少作物病害的發生[18]。輪作增加土壤真菌種群的豐富度和多樣性，連作則突出優勢種群[19]。本研究結果顯示：門水平上，輪作處理的子囊菌門、擔子菌門、球囊菌門和梳霉門優勢菌相對豐度較連作增加，壺菌門變化則與之相反；屬水平上，輪作處理的枝孢屬、鐮刀菌屬、亡革菌屬、被孢霉屬、Ramicandelaber的相對豐度較連作增加，這與前人的研究結果不太一致。陽祥等研究發現，通過輪作方式能夠降低被孢霉屬的相對豐度，推測其原因可能是輪作所選的作物不同，導致作物根系分泌物質的差異，改變了土壤環境對真菌群落結構產生影響[20]。后期研究中我們將進一步關注不同作物根系分泌物質對土壤環境因子產生的影響，明確關鍵物質對根際土壤微生物群落的影響機制。

本研究利用FFUNGuild功能預測分析發現，不同作物輪作處理下，土壤中真菌的主要營養類型是腐生菌，與陳興瓊等人的研究結果相符[21]。推測其原因是本研究樣本中子囊菌門相對豐度較高（31.76%～63.01%），而子囊菌門多為腐生真菌。與雪茄煙單一連作相比，輪作處理顯著升高了叢枝菌根的相對豐度，其中輪作玉米效果最明顯。說明合理輪作能夠增加根際土壤中的有益微生物。此外，本研究仍有較大比例的土壤真菌功能未被鑒定，這說明在未來的研究中需對真菌群落功能的復雜性深入分析。

綜上所述，本研究利用高通量測序技術的分析結果表明，不同作物輪作根際土壤的真菌種群數不同，輪作水稻的真菌種群數最多，輪作玉米的真菌種群數最少。不同作物輪作對根際土壤真菌群落結構、優勢菌相對豐度有明顯影響，輪作能夠顯著增加子囊菌門和叢枝菌根等的相對豐度。

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（責任編輯：易 "婧）

收稿日期：2024-04-01

基金項目：云南省煙草公司重大科技專項項目（2022530000241005）。

作者簡介：沈俊儒（1974—），博士，助理研究員，主要研究方向為煙草標準化。E-mail： 121831391@qq.com。

*為通信作者，E-mail： kcs@yaas.org.cn。