肉羊體外胚胎生產技術規模化應用中品種的影響

摘 要：旨在分析品種因素對OPU-IVEP商業化快繁效率的影響。本研究以經品種鑒定的健康8月齡至3周歲黑頭薩福克、黑頭杜泊、德克賽爾肉用種母羊為試驗供體，在內蒙古賽諾種羊科技有限公司，采用OPU技術獲取卵母細胞并進行體外胚胎工廠化生產或經腹腔鏡輸精和手術沖胚獲得體內胚胎，進行胚胎移植，記錄卵母細胞回收、胚胎發育以及移植妊娠的相關數據，進行統計分析。比較不同品種在體外胚胎規模化生產中卵母細胞回收效率、卵母細胞體外受精和胚胎發育能力、胚胎移植妊娠和產羔效率等方面的差異；同時，還比較了不同品種體內、外胚胎生產技術的應用效果。結果表明：1）3個品種間卵母細胞回收率差異極顯著（Plt;0.01），黑頭杜泊回收效率最高；2）3個品種的體外受精卵裂率無顯著差異（Pgt;0.05），但德克賽爾羊的囊胚發育率極顯著高于其他兩個品種（Plt;0.01）；3）無論體內胚胎還是體外胚胎生產移植，各品種間胚胎移植受胎率和平均產羔數均無顯著差異（Pgt;0.05），且各品種內，體內胚胎和體外胚胎移植的平均受胎率和產羔率均無顯著差異（Pgt;0.05）。綜上所述，在工廠化、規模化應用綿羊體外胚胎生產技術過程中，不同品種間卵泡發育、回收卵母細胞數、囊胚發育率等存在差異，平均卵泡數和平均回收卵母細胞最少的德克塞爾羊的囊胚發育率最高；移植后受胎和產羔情況在不同品種間無顯著差異，體內胚胎和體外胚胎單次生產獲得的后代數也無顯著差異，但OPU-IVEP的供體利用率遠大于MOET。

關鍵詞：品種；肉羊；體外胚胎生產；胚胎移植；規模化；應用

中圖分類號：S826.92; S826.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2451-09

收稿日期：2023-10-10

基金項目：新疆維吾爾自治區科技支疆項目（2022E02017）；“科技創新2030”項目子課題（2022ZD040130305）；自治區重大專項（2023A02011）

作者簡介：陳 瑩（1990-），女，湖北鐘祥人，博士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：88370828@qq.com；陳大勇（1981-），男，內蒙古扎賚特旗人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：Chendayong81@126.com。陳瑩和陳大勇為同等貢獻作者

*通信作者：汪立芹，主要從事動物繁殖與胚胎生物技術研究，E-mail：wlq6304@126.com；安 磊，主要從事動物繁殖與胚胎工程研究，E-mail：anleim@cau.edu.cn

Influence of Meat Sheep Varieties on the Scale Application of

in vitro Embryo Production Technology

CHENYing¹，CHENDayong³，WURiga³，QIUChunjuan³，FANLihong³，BAOMeirong³，

YUEYuan²，LIANGHongyan¹，ZHANGJiaxin⁴，TIANJianhui²，ANLei^2*，WANGLiqin^1*

（1.Key Laboratory of Genetics Breeding and Reproduction of Grass Feeding Livestock of

Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Urumqi830011，China; 2.China

Agricultural University，Beijing100193，China; 3.Inner Mongolia Sino Sheep

Technology Co.Ltd.，Ulanqab011800，China; 4.Inner Mongolia Agricultural

University，Hohhot010018，China）

Abstract：The aim of this study was to explore the impact of breed factors on the efficiency of commercial rapid propagation of OPU-IVEP.This study used healthy8-month-old to3-year-old black headed Suffolk，black headed Dorper，and Texel meat breeding ewes identified by breed identification as donors.OPU technology was used to obtain oocytes at Inner Mongolia Saino Sheep Technology Co.，Ltd.for in vitro embryo factory production or in vivo embryos obtained through laparoscopic insemination and surgical flushing.Embryo transfer was performed，and relevant data of oocyte recovery，embryo development，and transfer pregnancy were recorded for statistical analysis.Compare tThe differences in oocyte recovery efficiency，oocyte in vitro fertilization and embryo development ability，embryo transfer pregnancy and lambing efficiency among different breeds in large-scale in vitro embryo production was compared; At the same time，the application effects of in vivo and in vitro embryo production technologies of different breeds were also compared.The results showed that：1）there was asignificant difference in oocyte recovery rates among the3breeds（Plt;0.01），with the highest recovery efficiency observed in the black headed Dorper; 2）There was no significant difference in the in vitro fertilization and cleavage rates among the3breeds（Pgt;0.05），but the blastocyst development rate of Texel sheep was significantly higher than the other2breeds（Plt;0.01）; 3）There was no significant difference（Pgt;0.05）in the conception rate and average number of lambs produced by embryo transfer between different breeds，whether in vivo or in vitro，and there was no significant difference（Pgt;0.05）in the average conception rate and lambing rate of in vivo and in vitro embryo transfer amongindifferent breeds.In summary，in the process of OPU-IVEP industrial and large-scale application in sheep in vitro embryo production，there are differences in the efficiency among different breeds，such as follicle development，number of retrieved oocytes，and blastocyst development rate.Texel sheep，which has the lowest average number of follicles and average number of retrieved oocytes，has the highest blastocyst development rate; The conception and lambing situation after transplantation，which directly affects the efficiency of rapid reproduction，did not show significant differences among different varieties，and there was no significant difference in the number of offspring obtained from single production of in vivo and in vitro embryos.However，the donor utilization rate of OPU-IVEP is higher than that of MOET.

Key words：breed; meat sheep; in vitro embryo production; embryo transfer; scaling; application

*Corresponding authors：WANG Liqin，E-mail：wlq6304@126.com; AN Lei，E-mail：anleim@cau.edu.cn

體外胚胎生產技術（in vitro embryo production，IVEP）是卵母細胞回收、卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）、體外受精（in vitro fertilization，IVF）、體外胚胎培養（in vitro culture，IVC）、胚胎移植（embryo transfer，ET）、胚胎冷凍保存等技術的集成^[1-2]。其中任何環節都可能直接或間接地影響最終生產效率，比如供受體的品種^[3]及體況^[4]、激素誘導卵泡發育的處理方案^[5-7]、卵母細胞獲取方式^[8]、體外成熟和培養體系^[9-10]、移植胚胎等級和數量^[11]、生產季節^[12]等等。以品種因素為例，Denicolo等^[13]就在其研究中指出，東弗里升（East Friesian，EF）母羊在夏季妊娠率（60%）極顯著高于羅姆尼（Romney）母羊；另外，IVEP技術研究的深入和普及程度也與畜種的經濟價值密切相關。因此，目前能實現IVEP技術規模化應用的畜種還比較少。國際上，除了牛上規模化應用的報道較多以外^[14]，鮮少見到關于綿羊、山羊等小反芻動物體外胚胎規模化應用的報道。近年來，隨著國人生活水平的提高，羊肉的人均消費量逐年提升，消費者也更加注重羊肉的品質，因而對優質肉用種羊的需求隨之增加。為了更好地滿足多元化的市場消費需求，縮小我國與肉羊產業發達國家之間的差距，著力提升企業育種規劃能力和育種技術水平，是國家打好種業翻身仗的關鍵舉措^[15]。

制約綿羊、山羊等小反芻動物體外胚胎規模化生產的關鍵因素是卵母細胞資源的獲取方式和利用率^[16]。活體采卵（ovum pick-up，OPU）可以有效解決該問題，將其與IVEP技術結合，可大大提高具有高遺傳價值優秀母畜的利用率和繁殖效率，批量生產系譜齊全、遺傳背景清楚的胚胎及其后代，緩解胚胎來源匱乏的問題，促進胚胎移植的商業化進程^[17-18]，同時也有助于增加選擇強度和縮短世代間隔^[19-20]，有利于優質種質資源繁殖潛力的深度挖掘^[21]。健全的體外胚胎生產體系還能為大量科學研究提供所需的胚胎，如為細胞核移植、基因編輯、胚胎干細胞等試驗研究提供材料^[22]，以及用于拯救瀕危保護動物物種^[23-24]。

為了優化綿羊體外胚胎規模化應用技術體系，加快肉用種羊的繁殖速度和遺傳改良進程，本研究系統分析了品種因素對體外胚胎生產效率和規模化應用的影響。為OPU-IVEP技術在黑頭杜泊、黑頭薩福克、德克賽爾種羊上的進一步應用奠定基礎，為該技術在其他肉用綿羊品種上的應用提供借鑒。同時，如此大規模的完整且高效的綿羊體外胚胎生產技術應用體系，也將為相關研究和生產工作起到良好的示范作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供、受體的選擇

本研究所用的黑頭薩福克母羊、黑頭杜泊母羊、德克賽爾母羊等供體來源于內蒙古賽諾種羊科技有限公司，均為經種畜鑒定符合各品種特征、體格健壯、膘情適中、無繁殖疾病的8月齡至3周歲良種母羊。受體母羊為健康無繁殖疾病的蒙古羊，由與賽諾公司有長期合作關系的養殖戶提供，飼養管理方式按照公司統一要求進行。在同期發情處理前半個月，將受體母羊從合作社運送至公司做適應性訓練。

1.1.2 精液的選擇

根據品種選育規劃，本研究所用凍精全部為進口定制凍精，由公司聘請專人前往生產國進行供精種公羊的篩選，購買后由凍精生產公司代為生產。黑頭杜泊羊細管凍精由ALLSTOCK（WA）公司（澳大利亞）生產；黑頭薩福克和德克賽爾羊細管凍精由ANIMAL BREEDING SERVICE公司（新西蘭）生產。

1.1.3 激素及試劑耗材

供受體同期發情用孕酮海綿栓購自Zoetis（澳大利亞）公司；卵泡刺激素（FSH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）、黃體酮等購自寧波三生藥業有限公司（寧波）；體外胚胎生產所使用的抽卵液、IVM液、IVF液、IVC液、移植液等均為博瑞鼎^?體外胚胎培養系列產品（新疆畜牧科學院生物技術研究所，烏魯木齊）。其它生化試劑除特別注明外均為Sigma公司（中國）生產。

1.2 體外胚胎生產及移植

1.2.1 供體激素處理及卵母細胞回收

誘導供體羊卵泡發育的方法參考本研究室相關文獻^[25]。即在供體母羊發情周期的任意1d放置孕酮海綿栓，放栓當天記為第0天，放栓的第10～12天，早晚2次肌肉注射FSH，每兩次注射間隔時間約12h，FSH總劑量為480IU。注射第6針FSH12h后，應用微創活體采卵技術（OPU）采集卵母細胞，采集完成后取出海綿栓，每只供體的平均采卵間隔周期為1個月。供體羊只術前36h禁食、12h禁飲。采集卵母細胞時，使用穿刺器分別在距離乳房腹中線的左側、中間和右側各穿刺一小孔，左側孔插入腹腔鏡光源，中間孔插入采卵針，右側孔插入抓鉗；利用抓鉗固定卵巢，打開負壓泵開始抽吸卵泡液，體式鏡下撿取回收的卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complexes，COCs），記錄數量并統計卵母細胞回收率。

1.2.2 卵母細胞的體外成熟、體外受精、體外培養

卵母細胞的體外成熟、體外受精、體外培養方法參考本研究室相關文獻^[25]。即回收的卵丘-卵母細胞復合體用抽卵液洗滌3遍，IVM液洗滌3遍后，將每只供體回收的卵母細胞單獨放入平衡好的IVM孔內培養。

經IVM培養22～26h后的COCs取出置于0.1%的透明質酸酶中輕吹，去除卵母細胞周圍大塊卵丘細胞，用IVF液洗滌3遍，放入對應的IVF4孔板內。解凍后的進口凍精置于IVF液中上游獲能30min，按照1×10⁶個·mL^-1的密度將精子沉淀加入已放置卵母細胞的IVF孔內，與卵母細胞共孵育。

精卵共孵育22～24h，取出假定受精卵置于平衡好的IVC液中輕輕吹吸，洗去周圍的卵丘細胞和殘留精子，放入對應的IVC4孔板內繼續培養（5%CO₂，5%O₂，90%N₂），受精48h統計卵裂胚胎數。

1.2.3 體外胚胎移植

分別于受精第6和第7天統計囊胚發育率，并應用腹腔鏡進行子宮角胚胎移植。根據胚胎質量與受體數量情況，每只受體移植1或2枚胚胎。剩余的胚胎用玻璃化冷凍方法進行冷凍保存。

受體的同期發情處理：與供體同時放栓，在放栓后的第12天撤栓，同時注射333IU的PMSG。先查看兩側卵巢上的黃體情況，將胚胎移植至有黃體或者黃體較好一側的子宮角內。移植后35～40d進行B超妊娠檢查，統計受胎率。

1.3 體內胚胎生產及移植

1.3.1 供體激素處理及腹腔鏡深部輸精

供體激素處理方案同體外胚胎。注射第5次FSH時，撤出海綿栓，同時肌肉注射PG（0.1mg·只^-1），注射第6次FSH后試情，發情母羊肌肉注射LH（200IU·只^-1）。發情14～18h應用腹腔鏡進行子宮角輸精，每側輸入有效精子數不少于1×10⁷個。

1.3.2 手術沖胚及胚胎移植

在超排發情后6～7天，應用手術方式從子宮角采集發育到桑葚胚或囊胚階段的胚胎。胚胎移植和體外胚胎相同，每只受體依據胚胎質量移植1或2枚。

1.4 數據統計與分析

本研究所得數據采用SPSS22.0統計學軟件進行ANOVA方差分析，以“平均數±標準誤（Mean±SE）”和百分率（%）表示，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 品種對激素誘導卵泡發育及卵母細胞回收的影響

去除非熟練掌握活體采卵技術人員的采卵數據，要求詳細記錄采集供體的卵泡數和回收的卵母細胞數。結果如表1所示：經外源激素處理后，德克賽爾羊的卵泡發育效果極顯著低于黑頭杜泊羊（Plt;0.01），顯著低于黑頭薩福克羊（Plt;0.05），而黑頭杜泊羊和黑頭薩福克羊之間無顯著差異（Pgt;0.05）。黑頭杜泊羊的卵母細胞回收效率回收效果最好，平均達到21.19枚·次^-1；德克賽爾羊效果最差，僅為13.2枚·次^-1；黑頭薩福克介于二者之間，為17.44枚·次^-1；3個品種間卵母細胞回收率差異極顯著（Plt;0.01）。

2.2 品種對卵母細胞體外受精及胚胎發育效果的影響

通過對2020年1月至2021年6月間獲得的40103枚3個肉羊品種的卵母細胞體外受精及移植早期胚胎后剩余胚胎繼續培養的發育數據分析發現（表2）：3個品種的體外受精卵裂率間無顯著差異（Pgt;0.05），平均為73.11%。但德克賽爾羊的囊胚發育率極顯著高于黑頭薩福克和黑頭杜泊（69.09%vs53.54%和57.06%，Plt;0.01），后兩者間囊胚率無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3 不同品種體外和體內胚胎生產技術應用效果比較

應用OPU-IVEP技術，將獲得的不同品種體外胚胎進行移植。經統計，各品種間胚胎移植受胎率和平均產羔數沒有差異，平均每只供體單次可得到3.28只后代（表3）。而每只供體終身可進行15次以上OPU-IVEP^[16]，即終身可得到約49.2只后代。

對比體內胚胎生產技術，對5479只次供體應用MOET技術的生產數據進行分析，每只供體單次平均可得到5.20枚可用胚胎，移植后懷孕率為71.49%，平均每只供體可得到3.12只后代，各品種間回收可用胚胎數、移植受胎率和平均產羔數皆無顯著差異（Pgt;0.05，表4）。按照每只供體平均能夠進行3次MOET計算，終身獲得后代數為9.36只。

3 討 論

體外胚胎生產技術獲得的后代在人類醫學中被稱為試管嬰兒，自1978年首例試管嬰兒在英國誕生以來^[26]，該技術已經在各類動物的相關研究中得到廣泛應用。其優點在于：能充分利用母畜的卵母細胞資源，快速擴繁優質種群數量^[27]；能縮短世代間隔，對新品種培育意義重大^[28]；結合現代分子育種技術，在胚胎階段即能實現品種改造^[29]。本研究關注品種因素對體外胚胎生產過程中卵母細胞回收效率、體外發育卵裂率和囊胚率、胚胎移植受胎率和妊娠產羔率等數據的影響。

卵母細胞的回收效率可以通過平均回收卵母細胞數（回收卵母細胞數/供體采卵次數）和卵母細胞回收率（回收卵母細胞數/卵泡數）體現。較高的回收效率首先要通過保證供體母羊有較好的激素反應來實現，即卵泡數量多且飽滿健康^[30-31]。本研究中3個肉羊品種的激素誘導卵泡發育效果均較好，單個每對卵巢達到13～18個發育卵泡，且卵母細胞回收率都接近甚至超過100%，使得平均供體回收的可用卵母細胞數達到13～21枚·只^-1，略高于當前該應用研究領域的平均水平：綿羊10枚·只^-1，山羊14枚·只^-1可用卵母細胞^[32]。卵母細胞回收率反映了采卵人員技術水平，越趨近于100%說明采卵人員技術越熟練、經驗越豐富，卵母細胞回收過程中的人為損失越少。出現超過100%的情況，可能是由于腹腔鏡采卵時，針對卵巢上緊密排列的小卵泡會一次進針串聯吸取，存在將串連起來的小卵泡記數小于實際數量的情況，使得回收到的卵母細胞數高于卵泡數^[33]。因此我們推斷，本研究中不同品種間OPU回收效率的不同，并非采卵人員的技術水平差異，而是3個品種對激素的反應水平不同。有研究人員比較了5個優質肉用綿羊品種的超數排卵效果，發現杜泊羊平均黃體數為16.00個·只^-1，其次為德克塞爾13.80個·只^-1，均顯著高于白頭薩福克、黑頭薩福克以及美利奴羊（Plt;0.05），說明杜泊羊對激素的反應效果最好^[34]，這與本研究3個品種中黑頭杜泊羊平均卵泡數最高的結果一致。然而該研究中杜泊羊回收的可用胚胎數卻并非最高，僅有6.25枚·只^-1，比理論排卵數（16.00）減少了一半以上。巧合的是，本研究中卵母細胞回收效果最好的黑頭杜泊羊體外受精后胚胎繼續發育至囊胚比例也是最低的。可見品種間的胚胎發育能力確實存在差異。值得一提的是，岳媛等^[35]在賽諾種羊科技有限公司2019-2021年間不同品種對OPU-IVEP效率影響的分析研究中，黑頭薩福克、黑頭杜泊、德克塞爾羊的卵裂率分別為74.77%、66.88%、66.47%，囊胚率分別為58.30%、51.62%、61.08%，與本研究中卵裂率（76.77%、72.94%、71.98%）和囊胚率（57.06%、53.54%、69.09%）數據的規律基本一致，更加說明了數據分析的準確性，數值上稍有偏差是由于統計的整體數據量不同導致，本研究僅統計了2020年1月至2021年6月的數據。此外，有研究表明，荷斯坦奶牛OPU試驗中，卵泡直徑小于或等于4mm的卵母細胞回收率高于卵泡直徑大于4mm的回收率（Plt;0.01）^[36]。由此推斷，本研究中黑頭杜泊羊卵泡直徑相對較小。有研究指出，從不同直徑綿羊卵泡中回收的卵母細胞體外受精后囊胚發育能力不同，直徑大于等于3mm卵泡內卵母細胞的囊胚發育率（（11.1±0.9）%）高于直徑小于3mm卵泡內的卵母細胞（（6.5±0.7）%）。小卵泡液中的雌二醇（E₂）、孕激素（P）含量以及二者的比值（E₂：P）均比較低，可能是導致卵母細胞質量及后續體外胚胎發育能力低下的原因^[37]。

本研究中，3個品種供體單次實施OPU獲得的平均產羔數為3.12只，各品種間移植受胎率和平均產羔數沒有顯著差異（Pgt;0.05），同一肉羊品種在體內和體外胚胎移植的受胎率和平均產羔數之間也沒有顯著差異。說明供體品種的影響主要體現在卵母細胞回收和早期胚胎發育階段，隨機選定胚胎移植后的受胎率以及產羔率不受供體品種的影響，但可能與受體的營養狀況、子宮容受性等因素相關^[38]。對比OPU-IVEP與MOET技術，OPU-IVEP過程具有侵入性小、短時間可重復操作次數多、不易造成供體動物腹腔生殖系統粘連的優點^[13]。在綿羊、山羊等小反芻動物中，按每只供體一生可以開展15次OPU計算，獲得后代數量是其開展3次MOET技術的近5倍（49.2vs.9.36），OPU-IVEP的胚胎生產效率遠高于體內胚胎^[39]。OPU-IVEP的應用使得雌性動物可繁殖出更多后代，是優良種質資源價值最大化的有力途徑。

項目組自2011年開始將綿羊卵母細胞體外受精技術向生產中推廣應用。在應用過程中逐漸研發新的配套技術，完善建成了完善的體外胚胎生產技術體系。自2014年該技術在內蒙古賽諾種羊科技有限公司和新疆部分養殖企業應用以來，已在6個綿羊品種、3個山羊品種上展開應用，包括黑頭杜泊、白頭杜泊、黑頭薩福克、白頭薩福克、德克賽爾、東弗里升等綿羊品種，薩能、阿爾卑斯、吐根堡等山羊品種。生產的體外胚胎部分移植后，僅綿羊上已獲得了3萬多只試管種羊。部分胚胎培養至囊胚，應用玻璃化冷凍技術進行冷凍保存。

當前，項目組開展了對綿羊OPU-IVEP技術的應用與推廣工作，其規模在全國乃至全世界皆備受矚目。后期進一步推廣和大規模應用需要OPU-IVEP技術的精進，應該從兩個方面著手：一方面是進一步提高腹腔鏡采卵效率，既要增加卵母細胞回收數量，還需保證卵母細胞質量，在調整激素誘導卵泡發育方案^[40]、優化抽吸條件、確保優質卵母細胞占比等方面^[41]均有提升空間；另一方面是提高體外胚胎發育效率，有針對性地提高小卵泡卵母細胞的發育率，進而提高卵母細胞總利用率。OPU-IVEP技術應用前景廣闊，無論從動物福利角度，還是從胚胎生產、運輸、移植的時效性考慮，都是當前最為高效的兼具工廠化、個性化、規模化特性的生產技術。

4 結 論

本研究表明，不同肉羊品種間激素誘導卵泡發育情況和實施OPU卵母細胞回收率均存在差異，獲得的卵母細胞體外受精能力沒有顯著差異但囊胚發育率存在差異；平均卵泡數和回收卵母細胞最少的德克塞爾羊的囊胚發育率卻最高；移植后受胎和產羔情況在不同品種間無顯著差異，體內胚胎和體外胚胎單次生產獲得的后代數無顯著差異，但OPU-IVEP的供體利用率遠大于MOET，且手術間隔短、術后粘連少，企業開展體外胚胎商業化生產更為高效。

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（編輯 郭云雁）