濃縮蘋果汁中嗜酸耐熱菌的分離鑒定及菌群特性研究

摘 要：為了解和控制濃縮蘋果汁中的嗜酸耐熱菌，從脹袋濃縮蘋果汁中篩選、分離、純化得到了1株嗜酸耐熱菌，并進行菌種鑒定及特性研究。通過菌落形態、顯微形態和16S rDNA基因測序以及建立系統發育樹分析，初步確定該分離菌與Aiyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025標準菌同源度gt;99.51%，確定該分離菌為酸土脂環酸芽孢桿菌（A. acidoterrestris）。通過熱和酸堿處理考察該菌株的熱穩定性和酸堿穩定性，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗。結果表明，在最優滅菌參數為pH 6.0，105 ℃熱處理20 min的條件下，平板生長菌落數為0，說明該提取條件具有較好的合理性和可靠性，為濃縮蘋果汁中嗜酸耐熱菌的控制提供了理論依據。

關鍵詞：濃縮蘋果汁;篩選分離;嗜酸耐熱菌;分離鑒定;菌群特性

中圖分類號：TS255.44 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）03-0028-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.03.005

Isolation， Identification and the Bacteria Colony Characteristic"of Thermo-acidophilic Bacteria in the Apple Juice Concentrate

MENG Xiuqin1，2， DING Jianzi1，3， ZHANG Hui1， WANG Kun1， WU Maoyu4，"SHEN Wenbin1， ZHAO Yan4， CHU Le4

（1. Yantai North Andre Juice Co.， Ltd.， Yantai 264100， China; 2. Key Laboratory of Apple Deep Processing Technology of Shandong Province， Yantai 264100， China; 3. Fruit and Vegetable Storage and Processing Technology Innovation Center of Shandong Province， Yantai 264100， China; 4. Jinan Fruit Research Institute，"All China Federation of Supply amp; Marketing Cooperatives， Jinan 250014， China）

Abstract： In order to understand and control thermo-acidophilic bacteria in apple juice concentrate， a strain of thermo-acidophilic bacteria was screened， isolated， and purified from the apple juice concentrate in expansion bags. The thermo-acidophilic bacteria were identified by cell morphology， colony morphology， 16S rDNA test with phylogenetic tree analysis. The result showed that the homology of isolated strain and standard bacteria ATCC 49025 reached to 99.51%. The isolated strain was identified as Aiyclobacillus acidoterrestris. The thermal stability and acid-base stability of the strain were examined by heat and acid-base treatment. Orthogonal experiment was carried out on the base of single factor experiments， and it was found that the optimal sterilization parameter was to heat treat at 105 ℃ for 20 min at pH 6.0. Under this parameter， the number of colonies growing on the plate was 0. The result indicated that the extraction conditions have good rationality and reliability. The conclusion provided a theoretical basis for the control of thermo-acidophilic bacteria in apple juice concentrate.

Keywords： Apple juice concentrate; screening and isolation; thermo-acidophilic bacteria; separation and identification; microbial characteristics

濃縮蘋果汁是以蘋果為原料，經物理方法去除一定比例的水分獲得的濃縮液，是果汁飲料和酸奶加工常用的原料[1-2]。濃縮蘋果汁是除橙汁以外世界需求量第二大的果汁，其營養豐富，含糖量高[2-3]。酸土脂環酸芽孢桿菌（Aliyclobacillus acidoterrestris）是一種嗜酸、耐熱的菌，生長pH范圍為2.0～6.0，生長溫度為20～60 ℃，因此俗稱嗜酸耐熱菌、耐熱菌[4-7]。嗜酸耐熱菌在果汁加工過程中繁殖，以芽孢的形式耐受果汁加工過程中的巴氏殺菌，一旦遇到合適的萌發環境即大量繁殖代謝產生愈創木酚和鹵酚，導致果汁的口感風味變差，濁度升高甚至在包裝物底部形成白色沉淀，是濃縮果汁生產控制中最重要的目標控制微生物[8]。截止目前并未報道過因該菌而致病的案例，說明其本身無毒性，對果汁和人體健康無影響[9-11]。但我國濃縮蘋果汁大部分出口國外，國際貿易中嚴格要求每10 mL果汁中耐熱菌含量小于1個，研究表明每10 mL中存在1個耐熱菌即可導致品質劣變，美國及歐洲大部分國家要求果汁中不允許檢出耐熱菌[12-13]。果汁生產過程包括原料清洗、破碎、壓榨、預濃縮、酶解、超濾、樹脂純化、濃縮、巴氏殺菌、灌裝等步驟，前期溫度低，微生物繁殖不明顯，后期步驟溫度升高，有利于微生物的生長[14-16]。不同的原料加工工藝、果汁的糖度和酸度等有所不同，因此嗜酸耐熱菌種類也不同，因此控制微生物污染一直是果汁加工面臨的難題[17]。

本試驗擬對脹袋濃縮蘋果汁中耐熱微生物進行分離及特性研究，以期更好地提高濃縮蘋果汁品質，把控產品質量標準，為蘋果濃縮汁加工、保藏和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮蘋果汁，pH值為3.5～4.5，可溶性固形物含量為70 Brix，-18 ℃保存，來自煙臺北方安德利果汁股份有限公司;蘋果酸，分析純，國藥化學試劑有限公司;酵母提取物、葡萄糖、可溶性淀粉、瓊脂，分析純，均購自默克化工技術（上海）有限公司;K氏瓊脂，分析純，海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PL2002電子分析天平，METTLER TOLED公司;WB-2010A恒溫水浴鍋，天津奧特賽恩斯儀器有限公司;877酸度計，Metrohm公司;D-1-70高壓滅菌鍋，北京發恩科貿有限公司;超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司;恒溫振蕩水浴鍋，Selecta公司;Smart-1折光儀，ATAGO公司。

1.3 培養基制備

1.3.1 YSG培養基

A液：酵母提取物2 g，葡萄糖1 g，可溶性淀粉2 g，蒸餾水500 mL;用1 mol/L的HCl溶液調pH至3.7，加熱至沸騰。B液：瓊脂15 g，蒸餾水500 mL，加熱至沸騰。將A液及B液分別在121 ℃高溫滅菌15 min，冷卻至50 ℃后將A液及B液混合后傾注平板。

1.3.2 K氏培養基

稱取12.3 g K氏瓊脂，加熱溶解于500 mL蒸餾水中，121 ℃高溫滅菌25 min。滅菌結束后加入10%過濾除菌的蘋果酸溶液10 mL，混勻，冷卻至50 ℃后傾注平板。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株分離純化

（1）菌株分離

抽取3份脹袋濃縮蘋果汁，分別用無菌水稀釋至11.5 Brix，取50 mL樣品在80 ℃水浴中加熱13 min[19]，然后放入冰水浴中迅速冷卻至45 ℃，150 r/min振蕩培養3 d。

將培養后的樣品進行梯度稀釋[6]，吸取濃度為10-7、10-8梯度，取樣液200 μL涂布于YSG培養基平板上，45 ℃倒置培養3～5 d，觀察菌落培養情況。YSG培養基支持所有已知的脂環芽孢桿菌的生長，從YSG培養基上選取單一菌落接種至K氏培養基上，45 ℃倒置培養3～5 d，觀察是否有菌落產生。K氏培養基主要培養酸土脂環芽孢桿菌和部分酸熱脂環酸芽孢桿菌。因此在K氏培養基生長的菌基本確定為嗜酸耐熱菌。

（2）菌株純化

將篩選出來的嗜酸耐熱菌在K氏培養基平板上連續多次平板劃線純化，45 ℃倒置培養3～5 d，直至出現單菌落。挑取平板上的單菌落培養，得到純菌株，即分離菌A-1。

1.4.2 菌種鑒定

（1）菌落形態

將分離純化的嗜酸耐熱菌劃線接種到K氏培養基平板上，45 ℃倒置培養3～5 d，觀察出現的單菌落形態特征。

（2）顯微形態

將分離純化的嗜酸耐熱菌進行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡下觀察細胞形態。

（3）16S rDNA分子鑒定

以提取菌株DNA為模板，以27F和1492R為引物，進行PCR擴增反應。反應條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃延伸2 min，最后在72 ℃下延伸10 min，凝膠回收目的片段后，4 ℃保存樣品。

本試驗采用Sanger法對PCR產物進行測序，測序結果采用DNA MAN軟件進行拼接處理。

1.4.3 熱穩定性單因素試驗

（1）熱穩定性處理溫度

菌株45 ℃液體培養即取0.1 mL純化好的嗜酸耐熱菌菌懸液（104 CFU/mL）接種到50 mL濃縮蘋果汁中。72 h后，80 ℃熱處理13 min。取適量稀釋液于85、90、95、100、105 ℃熱處理20 min。分別涂布于YSG培養基上，于45 ℃恒溫培養箱中倒置培養3 d，觀察耐熱菌的生長情況。

（2）熱處理時間

菌株45 ℃液體培養72 h后，80 ℃熱處理13 min。取適量稀釋液于100 ℃分別處理10、15、20、25、30 min。分別涂布于YSG培養基上，于45 ℃恒溫培養箱中倒置培養3 d，觀察耐熱菌的生長情況。

1.4.4 酸堿穩定性單因素試驗

菌株于45 ℃液體培養72 h后，80 ℃熱處理13 min，稀釋，分別接種于pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的YSG培養基（用蘋果酸調節）上，于45 ℃恒溫培養3 d，觀察耐熱菌生長情況。

1.4.5 正交試驗設計

以滅菌效果為評價指標，采用熱處理溫度、熱處理時間、pH值進行因素L9（34）正交試驗[19-20]，試驗方案如表1所示。

1.5 數據處理

采用SPSS 20.0進行正交試驗設計及數據處理。

2 結果與分析

2.1 嗜酸耐熱菌的確定

2.1.1 分離純化

通過從脹袋濃縮蘋果清汁中分離純化，得到1株嗜酸耐熱菌，如圖1所示。該菌株經80 ℃水浴13 min后在YSG培養基和K氏培養基上長勢良好，即經過熱處理和酸處理仍長勢良好，說明該菌株具有耐熱耐酸性。

2.1.2 菌落形態分析

圖1和圖2分別為嗜酸耐熱菌的菌落形態和革蘭氏染色顯微形態圖。由圖1中可以看出，菌落呈奶油狀，乳白色，表面反光，邊緣整齊，菌落平伏，不透明。圖2顯示菌體呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。圖3為芽孢染色圖，紅色為菌體，綠色為芽孢[21]，結果表明該菌株產芽孢，芽孢呈橢圓形。

2.1.3 分子生物學結果

測序結果采用DNA MAN軟件進行拼接處理。拼接結果在GENEBANK上進行BLAST比對，挑選同源性超過99%的基因序列構建系統發育樹（圖4）。

由系統發育樹可知，該菌株與ATCC 49025標準菌同源度gt;99.51%，結合形態學鑒定結果，最終確定該分離菌株為酸土脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）。

2.2 單因素試驗

由表2、3可知，隨著處理溫度的升高及處理時間的延長，菌株生長逐漸受到影響。嗜酸耐熱菌具有較強的耐熱性，其耐熱性主要體現在芽孢上，在蘋果汁加工過程中，巴氏殺菌或高溫瞬時滅菌并不能使芽孢完全失活，待條件適宜時芽孢會在蘋果汁中萌發并最終導致蘋果汁腐敗、脹袋等現象。因此選擇處理溫度95～105 ℃，處理時間15～25 min作為正交試驗范圍。

由表4可以看出，當pH為3.0～4.0時，菌種長勢最好，而當pHgt;4后，菌種長勢反而呈現下降趨勢。pH 4.0為該菌種的最適生長pH，由該最適pH可以看出該菌種表現對酸性條件的嗜好性，有較好的耐酸性，只有酸性條件才適宜其繁殖。因此選擇pH 4.0～6.0作為正交試驗范圍。

2.3 正交試驗優化

由表5、6可知，熱處理溫度對菌株生長有顯著影響、熱處理時間及pH值均對菌株生長影響不顯著，影響程度依次為Agt;Cgt;B，即處理溫度gt;pH值gt;處理時間。通過正交試驗得到的理論最優組合為A3B2C3，即熱處理溫度105 ℃、熱處理時間20 min、pH值為6.0時可以最大程度地減少蘋果汁中的菌落數。以最佳條件進行3次平行試驗，平板生長菌落數均為0，說明該提取條件具有較好的合理性和可靠性。

3 結論

從脹袋濃縮蘋果汁中分離純化獲得一株嗜酸耐熱菌，通過形態學和16S rDNA初步鑒定，該菌株與ATCC 49025標準菌同源度gt;99.51%，結合形態學鑒定結果，最終確定該分離菌株為酸土脂環酸芽孢桿菌。通過單因素試驗探究了熱處理溫度、處理時間、pH值對菌落生長的影響。在單因素試驗的基礎上，進行三因素三水平正交試驗。結果表明，熱處理溫度對其菌落生長影響顯著，熱處理時間及pH值均對其菌落生長影響不顯著。最終得到的耐熱菌最佳滅菌參數為pH值6.0時，105 ℃處理20 min。在此滅菌參數下，可使該菌株失活，具有省時、高效、節能等優點，以期為濃縮蘋果汁加工提供新的工藝方案。

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基金項目：山東省重點研發計劃（重大科技創新工程）（2022CXGC010601）

第一作者簡介：孟秀芹（1976—），女，高級工程師，本科，主要從事食品加工技術研究工作