成纖維細(xì)胞生長因子21在肝臟脂質(zhì)沉積中的作用研究

[摘要]目的探討成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）21在肝臟脂質(zhì)沉積中的作用機(jī)制。方法將HepG2細(xì)胞分為對照組和誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組采用油酸和棕櫚酸構(gòu)建脂肪肝細(xì)胞模型，通過油紅O染色觀察兩組細(xì)胞鏡下的脂質(zhì)沉積，檢測兩組細(xì)胞中FGF21和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）的蛋白表達(dá)情況；以FGF21慢病毒感染脂肪肝細(xì)胞作為干擾組，以scramble慢病毒感染脂肪肝細(xì)胞作為非干擾組，比較兩組細(xì)胞的FGF21mRNA表達(dá)水平、脂質(zhì)沉積及GPX4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組相比，誘導(dǎo)組細(xì)胞的脂質(zhì)沉積明顯，F(xiàn)GF21蛋白表達(dá)水平顯著升高，而GPX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。FGF21慢病毒干擾后，干擾組細(xì)胞的FGF21mRNA表達(dá)水平顯著下降，脂滴減少，脂質(zhì)沉積明顯改善，GPX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論FGF21可能通過抑制脂質(zhì)過氧化促進(jìn)肝臟脂質(zhì)形成。

[關(guān)鍵詞]成纖維細(xì)胞生長因子21；脂質(zhì)沉積；谷胱甘肽過氧化物酶4

[中圖分類號(hào)]R575.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.25.005

Studyontheroleoffibroblastgrowthfactor21inliverlipiddeposition

PEIPei1，F(xiàn)ANYijia1，LUGuoqin2，TENGYiqun1，ZHUFeng1

1.Children’sMedicalCenter，theSecondAffiliatedHospitalofJiaxingUniversity，Jiaxing314000，Zhejiang，China;2.DepartmentofNeonatology，JiaxingMaternityandChildHealthHospital，Jiaxing314009，Zhejiang，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethemechanismoffibroblastgrowthfactor（FGF）21inliverlipiddeposition.MethodsHepG2cellsweredividedintocontrolgroupandinductiongroup.Fattylivercellmodelwasconstructedusingoleicacidandpalmiticacidininductiongroup.LipiddepositionunderthemicroscopewasobservedbetweentwogroupsbyoilredOstaining，andtheproteinexpression&nbsp;ofFGF21andglutathioneperoxidase4（GPX4）intwogroupsweredetected.FGF21lentivirus-infectedfattylivercellswereusedasinterferencegroup，andscramblelentivirus-infectedfattylivercellswereusedasnon-interferencegroup.TheexpressionlevelofFGF21mRNA，lipiddepositionandexpressionlevelofGPX4proteinwerecomparedbetweentwogroups.ResultsComparedwithcontrolgroup，inductiongrouphadsignificantlipiddeposition，significantlyincreasedexpressionlevelofFGF21protein，andsignificantlydecreasedexpressionlevelofGPX4protein（P<0.05）.AftertheinterferenceofFGF21lentivirus，expressionlevelofFGF21mRNAwassignificantlydecreased，lipiddropletsweredecreased，lipiddepositionwassignificantlyimproved，andGPX4proteinexpressionlevelwassignificantlyincreasedininterferencegroup（P<0.05）.ConclusionFGF21maypromoteliverlipidformationbyinhibitinglipidperoxidation.

[Keywords]Fibroblastgrowthfactor21;Lipiddeposition;Glutathioneperoxidase4

隨著生活水平的改善，肥胖已成為中國重大的公共衛(wèi)生問題，肥胖所伴隨的代謝疾病如糖尿病、高血壓和非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）等日益突出。其中以脂質(zhì)異常沉積為主要特征的NAFLD正演變?yōu)槿蜃畛Ｒ姷穆愿尾≈唬湓趤喼奕巳旱陌l(fā)病率達(dá)30%[1-2]。NAFLD不僅可誘發(fā)肝炎、肝硬化、肝癌等疾患，還會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、糖尿病等肝外疾病[3]。成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）家族共有23個(gè)成員，其中FGF21在維持能量穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要。FGF21是一種肽激素，可在組織間自由擴(kuò)散和循環(huán)，并直接改善細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn)多種疾病如糖尿病、心臟疾病、代謝異常等均與FGF21的異常表達(dá)相關(guān)[5-7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者的血清FGF21表達(dá)水平顯著升高，并猜測FGF21可作為預(yù)測肝脂肪變性的生物標(biāo)記物，但現(xiàn)有證據(jù)未能直接驗(yàn)證肝臟脂質(zhì)沉積與FGF21基因關(guān)聯(lián)[8-9]。近年來，大量研究指出鐵死亡可能在肝臟疾病的病理進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。硫醚能抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）活化介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而改善高脂小鼠胰島素抵抗，減輕小鼠肝臟代謝異常[10]。研究表明FGF21參與NAFLD形成，GPX4途徑可在改善小鼠肝臟代謝中發(fā)揮重要作用，但FGF21是否可通過調(diào)控GPX4影響肝臟疾病的發(fā)生尚不清楚。本研究檢測FGF21和GPX4在脂肪肝細(xì)胞模型中的表達(dá)水平，觀察慢病毒干擾FGF21表達(dá)后是否對脂肪肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積及GPX4表達(dá)水平產(chǎn)生影響，旨在探究FGF21在肝臟脂質(zhì)沉積中的作用機(jī)制，為防治肝臟代謝異常提供新思路。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞來自嘉興大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室。HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2試劑和儀器

FGF21慢病毒購自上海和元生物科技有限公司，F(xiàn)GF21蛋白抗體、GPX4蛋白抗體均購自中國ABclonal公司；微管蛋白購自天津SungeneBiotech公司；多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；Bio-Rad凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3細(xì)胞分組與脂肪肝細(xì)胞模型的建立

復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，隔天更換一次新鮮的培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，確保細(xì)胞狀態(tài)良好。待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度均保持30%左右，最后向各孔中補(bǔ)充DMEM培養(yǎng)基1ml，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)組添加245μmol/L油酸和122.5μmol/L棕櫚酸誘導(dǎo)建立脂肪肝細(xì)胞模型，對照組添加等體積的磷酸鹽緩沖液，24h后收集細(xì)胞及上清液。

1.4FGF21慢病毒干擾細(xì)胞模型的建立

按照上述細(xì)胞傳代方法將脂肪肝細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，非干擾組按照說明書要求，結(jié)合細(xì)胞密度加入scramble慢病毒，待細(xì)胞穩(wěn)定24h后，添加油酸和棕櫚酸進(jìn)行誘導(dǎo)；干擾組按照說明書要求，根據(jù)細(xì)胞密度加入相應(yīng)FGF21慢病毒，待細(xì)胞穩(wěn)定24h后，再加入油酸和棕櫚酸進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)48h后，收集細(xì)胞及上清液。

1.5油紅O染色

每組細(xì)胞各取3個(gè)孔，收集培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，4%多聚甲醛固定10min，采用油紅O染色法進(jìn)行染色：首先稀釋油紅儲(chǔ)存液，染色10min，75%酒精脫色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況。最后用100%異丙醇提取溶解在脂滴中的油紅O，并通過測量510nm處的吸光度測定其相對濃度。

1.6FGF21mRNA表達(dá)水平檢測

采用Trizol法從細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，并在普通聚合酶鏈反應(yīng)儀上反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)DNA。在ThermoFisher-QS3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)儀上檢測FGF21mRNA表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行方案為：變性程序（95℃10min），擴(kuò)增定量程序重復(fù)40次（95℃15s，60℃10s，72℃15s，單次熒光測量），熔解曲線程序（60～95℃，升溫速率0.1℃/s，連續(xù)熒光測量）。使用2-△△Ct計(jì)算目的mRNA的相對表達(dá)量并進(jìn)行比較。本研究所用引物序列見表1。

1.7FGF21和GPX4蛋白濃度測定

提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測總蛋白濃度。將各樣本的蛋白濃度調(diào)整一致，再與1/4體積的蛋白上樣緩沖液混合后煮沸，變性；通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜；室溫下5%脫脂奶粉封閉2h，按照1∶1000稀釋FGF21抗體原液，根據(jù)分子量大小分別以微管蛋白作為內(nèi)參，4℃過夜孵育；第2天洗膜，5%脫脂奶粉稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000）于搖床上孵育90min，洗膜，加發(fā)光液，Bio-Rad成像系統(tǒng)曝光，采用ImageJ軟件測定灰度值，目標(biāo)蛋白分別與內(nèi)參灰度值相比為各自相對表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采取t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1脂肪肝細(xì)胞模型

與對照組相比，油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)脂滴形成積累更為明顯，脂質(zhì)沉積更為顯著，說明脂肪肝細(xì)胞模型構(gòu)建成功，見圖1。

2.2FGF21和GPX4蛋白表達(dá)水平

誘導(dǎo)組的FGF21蛋白表達(dá)顯著高于對照組（P<0.05），GPX4蛋白表達(dá)顯著低于對照組（P<0.05），見圖2。

2.3FGF21慢病毒干擾情況

熒光顯微鏡下觀察脂肪肝細(xì)胞的慢病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)脂肪肝細(xì)胞內(nèi)慢病毒感染情況良好，同時(shí)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測FGF21mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FGF21mRNA表達(dá)水平顯著降低，表明FGF21敲減效率顯著，見圖3。

2.4敲減FGF21后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化

敲減FGF21后，與非干擾組相比，干擾組脂質(zhì)沉積明顯減少；干擾組吸光度值顯著低于非干擾組（P<0.05），見圖4。

2.5敲減FGF21后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)GPX4表達(dá)情況

干擾組的GPX4蛋白水平顯著高于非干擾組（P<0.05），見圖5。

3討論

生活方式和飲食習(xí)慣的改變使得肥胖人群迅速

增加。研究發(fā)現(xiàn)NAFLD已成為最常見的慢性肝病之一[11]。由于臨床上大多數(shù)NAFLD患者并無明顯癥狀，因此早期難以發(fā)現(xiàn)肝臟脂質(zhì)代謝異常。對懷疑NAFLD的患者多采用肝臟超聲檢查，但超聲檢查缺乏足夠的敏感度和特異性，易耽誤該病的早期診斷和干預(yù)。肝臟穿刺雖然是診斷NAFLD的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其有創(chuàng)性在臨床上難以廣泛實(shí)施[12]。因此，尋找敏感且準(zhǔn)確性高的生物標(biāo)志物來辨別肝臟脂質(zhì)累積顯得尤為重要。

本研究采用油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的方式構(gòu)建脂肪肝細(xì)胞模型。研究人員采用油紅O染色，鏡下發(fā)現(xiàn)油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞脂質(zhì)沉積明顯，可見大片紅色脂滴沉積。肝臟是FGF21的主要合成器官，同時(shí)FGF21也可直接改善肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，誘導(dǎo)組的FGF21蛋白表達(dá)顯著增加，為進(jìn)一步驗(yàn)證二者的關(guān)系，構(gòu)建FGF21慢病毒干擾模型，發(fā)現(xiàn)干擾組鏡下脂質(zhì)沉積較前減少，與既往采用三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)觀察脂質(zhì)含量不同[13-14]。本研究采用吸光度作為觀察脂滴含量定量指標(biāo)，結(jié)果顯示干擾組的吸光度值顯著低于非干擾組，提示FGF21慢病毒干擾后脂肪肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積減少，說明二者間存在密切關(guān)聯(lián)。脂質(zhì)過氧化可能是FGF21與脂質(zhì)異常累積的作用機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者肝臟中丙二醛和4-羥基壬烯醛顯著增高[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)花生四烯酸可促進(jìn)蛋氨酸膽堿缺乏誘導(dǎo)的小鼠肝臟發(fā)生鐵死亡、脂質(zhì)活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）積累，ROS通過促進(jìn)脂滴形成產(chǎn)生肝臟脂質(zhì)變性。GPX4是一種利用自身的催化活性、削弱脂質(zhì)過氧化物毒性、維持膜脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，基于此，GPX4也被認(rèn)為是清除膜脂過氧化氫產(chǎn)物的核心。研究表明抑制GPX4表達(dá)將增加細(xì)胞中的脂滴和脂質(zhì)過氧化作用，激活GPX4表達(dá)將抑制細(xì)胞內(nèi)脂滴形成[17]。本研究發(fā)現(xiàn)FGF21表達(dá)增高的同時(shí)，GPX4表達(dá)明顯降低，表明GPX4對細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的作用在減弱，進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)形成，最終導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)病變；而敲減FGF21后，GPX4表達(dá)增高，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積呈現(xiàn)降低趨勢。

綜上，F(xiàn)GF21參與肝臟脂質(zhì)沉積的形成，且脂質(zhì)過氧化在肝臟代謝異常中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)GF21可能通過改變GPX4途徑而影響脂質(zhì)變化。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–06–10）

（修回日期：2024–07–29）