基于代謝組學探究蝦青素調節對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷的機制

摘要：為了探究蝦青素調節對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷，本研究采用非靶向代謝組學方法，從代謝層面揭示蝦青素在調節對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷中的途徑和機制。通過多種統計分析方法，發現154種代謝物發生了顯著的回調現象，鑒定出其中的35種物質在代謝過程中扮演了關鍵角色。通過對這些代謝物的分析，谷胱甘肽代謝、三羧酸循環、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝、嘌呤代謝以及甘油磷脂代謝可能是蝦青素調節對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷的主要代謝通路。本研究將有助于解讀蝦青素調節對小鼠肝損傷的影響機制，后續也為蝦青素的深度研究和開發利用提供了一定的理

論基礎。

關鍵詞：蝦青素；營養強化劑；代謝組學；生物標志物；代謝輪廓分析

蝦青素（ASTA）是一種天然存在的類胡蘿卜素，主要出現在海洋微生物和動物中[1]。蝦青素具有使活性氧化劑失效、消除單線態氧分子、清除活性氧以及阻斷氧化連鎖反應的重要功能[2]。有研究表明蝦青素在減少脂質過氧化、平衡凋亡蛋白表達、抑制促炎細胞因子以及維護肝臟組織學結構方面有著顯著效果[3]。藥物性肝損傷（DILI）是一種由藥物本身或其代謝產物引發的嚴重肝部損害[4]。在現有的3萬多種針對各類疾病的藥物中，高達1100種藥物都有可能對肝臟造成損傷[5]。盡管乙酰氨基酚（APAP）在治療劑量下使用是安全的，但在西方國家過量使用APAP導致的急性肝衰竭病例仍然非常普遍[6]。

代謝組學作為一種全面而系統的研究手段，專注于探究生物體內代謝物的動態變化[7]。通過對代謝物開展詳盡的定性和定量分析，能夠深入揭示代謝網絡的結構、代謝通路的走向以及代謝調控的機制，從而進一步理解生物體的生理功能和可能出現的病理狀態[8]。為了更深入地理解DILI的發生、發展及其后續的調節機制，需要尋找那些合適的生物標志物[9]。本研究將采用非靶向代謝組學的策略，揭示蝦青素在調節對乙酰氨基酚導致的小鼠肝損傷中的具體途徑和機制。

1 試驗材料

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3000 UHPLC Plus（美國Thermo Fisher公司）；LTQ Orbitrap XL質譜儀（美國Thermo Fisher公司）；ACQUITYTM超高效液相色譜（美國waters 公司）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TGL-16臺式高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；NV-15G氮吹濃縮儀（天津津騰實驗設備有限公司）；FSH-2高速勻漿機（上海達洛科學儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

對乙酰氨基酚（純度99.0%，北京華邁科生物科技有限公司）；ASTA對照品（純度98.0%，Sigma-Aldrich）；ASTA原料藥（純度96.0%，北京華邁科生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；甲基叔丁基醚（分析純，天津津東天正）；乙酸乙酯（分析純，天津津東天正）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 試驗動物

4周齡Kunming種（KM）小鼠300只，雌性和雄性各150只，體重為（21±1）g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2023-0002。

2 試驗方法

2.1 LC-MS參數

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），流動相乙腈-水，流動相梯度（0～3 min，5%～30%；3～8 min，30%～85%；8～10 min，85%～95%），流速0.2 mL/min，柱溫30℃。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式、負離子模式，干燥氣流11 L/min，氣體溫度350℃，毛細管電壓35 V，高分辨（30000）全掃描模式。

2.2 動物試驗及生物樣品采集

將KM小鼠隨機分為4組（n=75），即空白對照組（control，G0）、空白+給予ASTA組（ASTA組，G1）、模型組（APAP組，G2）以及模型+給予ASTA組（APAP + ASTA組，G3），每組中雌、雄個體數相等。G2組及G3組每天通過腹腔注射的方式給予小鼠150 mg/kg·d的APAP溶液，并持續至試驗最終階段。G1組及G3組小鼠分別按100 mg/kg·d灌胃給予ASTA混懸液。G0組腹腔注射、灌胃和G2組灌胃使用等體積生理鹽水替代。

分別取第0、1、2、3、4周給藥后2 h各組小鼠肝組織勻漿離心液進行分析。取小鼠組織勻漿液250 μL，加入0.25 mL ZnSO4—乙腈混合溶液750 μL（40∶60，v/v），

渦旋混合1 min，離心（16 000 r/min）10 min，轉移上清液置另一離心管中，35℃氮氣流下揮干，殘渣加乙腈200 μL復溶，超聲2 min，渦旋振蕩30 s，轉移至另一離心管中，離心（16 000 r/min）10 min，取上清液進樣分析。

2.3 數據處理

利用Analyst TF 1.6軟件收集原始數據后，通過python scikit-learn機器學習庫對數據進行峰對齊和去噪處理，導出數據矩陣。對數據進行列歸一化，不同組別的樣本，運用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）進行差異分析。篩選化合物，通過比對在線數據庫METLIN和HMDB中的質譜信息來鑒定潛在的生物標志物。使用MetaboAnalyst 4.0在線數據庫對檢測到的潛在生物標志物進行代謝途徑分析以探究相關的生物學機制。

3 結果與分析

3.1 代謝輪廓分析

選取第2周的數據進行非靶向代謝組學實驗。對4種實驗數據進行PCA分析，在圖1中顯示各組樣本在PC1和PC2維度上表現出較好的分離趨勢。值得注意的是，G0組與G1組小鼠得分也出現明顯的分離，這可能是因為更換環境飼養、給藥及實驗環境干擾，使小鼠在一定程度上產生應激，造成一定程度的肝損傷，而因為ASTA的存在使G1組小鼠肝損傷程度較低。

為了使不同組別間的數據實現進一步分離，本試驗采用Permutation test和5-fold交叉驗證得到模型評價參數R2Y和Q2，結果如圖2顯示：2條擬合直線的斜率為正，R2Y和Q2的終值分別為0.9989和0.9430，截距分別為-0.58和0.97，說明模型的可解釋性和可預測性均良好，模型不存在過擬合現象，可以對未知樣品進行預測。

3.2 差異代謝物篩選

通過t檢驗和VIP火山圖分析2種單變量分析方法對G0與G2，G2與G3組間差異進行分析。P＜0.05和VIP＞1的代謝物被認為是對分類有顯著貢獻的成分，其交集在本實驗中被認為是有顯著性差異的代謝物，見圖3。

結果顯示，與G0組相比，在G2組中共發現354個符合上述標準的代謝物，將其整理為數據集D1，其中201種物質上調，153種下調。同樣方法分析G2與G3組樣品，共發現符合標準的代謝物有326種，將其整理為數據集D2，其中上調的物質有202種，下調的物質有124種。將D1與D2取交集，共得到154種差異代謝物，其中95種上調，59種下調。這說明經過ASTA干預后，其中的154種代謝物發生了回調，表明這些物質與ASTA調節APAP肝損傷作用有關。通過匹配數據庫，鑒定出其中的35種物質。通過層次聚類算法對篩選得到的潛在生物標志物進行分析，如圖4所示，G0與G2組，G2與G3組能夠明顯分為2組，說明篩選的顯著性差異物質是正確的。

利用MetaboAnalyst 4.0在線網站的pathway analysis模塊，基于拓撲分析（x）和富集分析（y）的評分，對篩選出的顯著性差異物質進行通路分析。每個圓的顏色和大小分別表示P值和通路影響因子，結果表明，ASTA調節肝損傷作用的主要途徑包括谷胱甘肽代謝、三羧酸循環、谷氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝、嘌呤代謝和甘油磷脂代謝。

4 討論與結論

蝦青素作為功能性營養強化劑在調節健康方面具有巨大的潛力，但其活性的作用機制尚不明確，阻礙了蝦青素相關產品的進一步開發應用。近年來，研究人員證實蝦青素在預防急性肝損傷和肝纖維化方面發揮著重要作用。有研究表明蝦青素可以通過激活主要影響氧化應激、自噬和鐵死亡過程的Nrf2/HO-1途徑預防肝損傷，用ASTA治療后，細胞自噬增強，并抑制了鐵死亡，對藥物誘導的肝損傷起到緩解和改善的作用[10]。

通過開展小鼠肝組織勻漿液的代謝組學研究，運用多種統計分析方法，發現154種代謝物發生了顯著的回調現象。成功鑒定了其中的35種物質，通過對這些代謝物的分析，發現它們主要涉及以下幾個主要的代謝通路：谷胱甘肽代謝、三羧酸循環、谷氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝、嘌呤代謝以及甘油磷脂代謝。這些代謝通路在維持肝臟正常功能和應對損傷過程中起著至關重要的作用。

參考文獻

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