二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝炎小鼠脂肪酸β氧化和炎癥的影響

摘要：為探究二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟組織脂肪酸β氧化和炎癥的影響。本試驗將24只健康雄性C57BL/6N小鼠，隨機分為正常組、模型組和二甲雙胍組，每組8只。正常組小鼠給予維持飼料，其余2組則給予高脂飼料。第10周時模型組和二甲雙胍組小鼠皮下注射CCl4（0.1 mL/kg，2次/周），持續6周。第10周時二甲雙胍組以二甲雙胍（250 mg/kg·d）灌胃，持續6周，第16周時安樂死各組小鼠并取樣。酶聯免疫吸附法檢測各組小鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）以及谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）水平。實時熒光PCR方法測定PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達。結果顯示，與模型組相比，二甲雙胍組小鼠空腹血糖、血清TG、TC、AST和ALT水平均有明顯降低（P<0.05），而肝組織中PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA的表達顯著提高（P<0.05），IL-6、TNF-α mRNA的表達顯著下降（P<0.05）。結果表明，二甲雙胍通過促進脂肪酸β氧化以及減輕炎癥反應，能有效改善由高脂飲食和CCl4誘導的非酒精性脂肪性肝炎小鼠癥狀。

關鍵詞：二甲雙胍；非酒精性脂肪性肝炎；脂肪酸β氧化；炎癥；小鼠

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種被廣泛關注的肝臟疾病，它與許多代謝綜合征如肥胖、高血壓、糖尿病和高膽固醇等有著密切的關聯。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等惡性疾病往往是NAFLD的延續，它們的發展會給患者帶來更重的生活壓力和健康危機[1]。當前，非酒精性脂肪性肝炎的治療仍然面臨著巨大的挑戰，尚未找到可以推薦作為特效藥物的治療方式。二甲雙胍是口服胰島素增敏藥，一直以來都是治療高血糖和2型糖尿病的常見藥物。有研究報道，二甲雙胍可有效降低肝臟脂質的積累[2]，但其具體機制不明。為此，本試驗擬通過高脂飲食聯合CCl4誘導建立非酒精性脂肪肝動物模型，從肝細胞脂肪酸β氧化以及炎癥相關因子角度，探討二甲雙胍對NASH的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6N小鼠，雄性，體重20～22 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證編號：SCXK（浙）2019-0001]飼養于蘇州系統醫學研究所SPF級動物實驗室內[實驗動物使用許可證編號：SYXK（蘇）2019-0029]，室溫24℃，12 h光照晝夜循環，適應性喂養7 d，實驗期間自由飲食飲水。試驗過程中遵循動物福利相關規定，經蘇州系統醫學研究所動物倫理委員會批準，批號為ISM-IACUC-0073-R。

1.1.2 藥物與試劑

鹽酸二甲雙胍、CCl4、橄欖油（阿拉丁生化科技股份有限公司）；高脂飼料、維持飼料（江蘇省協同醫藥生物工程有限公司）；AST、ALT、TG、TC ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；引物設計與合成（安升達生命科學技術公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green試劑（湖南艾科瑞生物工程有限公司）。

1.1.3 主要儀器

血糖儀（蘇州爾達醫療設備有限公司）；基因擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）；熒光定量PCR儀、紫外分光光度計、全波長酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；全自動核酸提取儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠分組及干預方法

將24只小鼠采用隨機數表法分為正常組、模型組、二甲雙胍組，每組8只。正常組喂食維持飼料，模型組和二甲雙胍組小鼠參照文獻采用高脂飲食聯合CCl4誘導建立非酒精性脂肪性肝炎模型[3]，喂食高脂飼料。所有小鼠均自由進食和飲水，持續16周，在第10周時模型組和二甲雙胍組小鼠開始皮下注射CCl4（0.1 mL/kg，每周2次），持續6周。當小鼠血清中的TG、TC、AST和ALT含量較正常組顯著升高表示NASH模型復制成功。在造模第10周開始，二甲雙胍組以二甲雙胍（250 mg/kg·d）灌胃，正常組和模型組灌胃等體積的滅菌水，持續6周。

1.2.2 樣本收集

試驗16周結束后，各組小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血測量血糖水平，剩余血液室溫靜置4 h后離心（4℃，3500 r/min，10 min）取上清，-80℃凍存備用。將小鼠CO2安樂處死后，打開腹腔摘取肝臟并使用PBS沖洗血跡后-80℃凍存備用。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測肝臟組織中PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1、IL-6、TNF-α mRNA表達水平

用總RNA提取試劑盒提取肝組織中總RNA，逆轉錄為cDNA。使用實時熒光定量PCR檢測目的基因。將樣本放入實時熒光定量PCR擴增儀中，設置反應條件：步驟一，95℃預變性30 s，步驟二，95℃變性5 s、60℃退火延伸30 s，共40個循環。使用PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1、IL-6、TNF-α基因引物和GAPDH內參基因引物進行擴增。同時在60～95℃進行溶解曲線分析利用PCR儀繪出擴增曲線，進行結果分析。

1.2.4 酶聯免疫吸附測定法檢測小鼠血清中TG、TC、AST和ALT水平

取適量血清，按照ELISA檢測試劑盒的操作指南進行操作。使用全波長酶標儀來測量每組小鼠血清樣品在450 nm波長處的吸光度。根據標準孔繪制標準曲線，并通過標準曲線公式計算各組小鼠血清中的TG、TC、AST和ALT水平。

1.2.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 8版軟件進行統計分析，計量資料以“平均數±標準差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對NASH小鼠血糖、血脂及肝功能指標的影響

與正常組相比，模型組血糖、TG、TC、AST、ALT均顯著上升（P<0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組血糖、TG、TC、AST、ALT均顯著下降（P<0.05）（表1）。

2.2 二甲雙胍對NASH小鼠肝臟中脂肪酸β相關基因PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA表達均顯著下降（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組小鼠PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA表達均顯著上升（P<0.05）（表2）。

2.3 二甲雙胍對NASH小鼠肝臟中炎癥相關基因IL-6、TNF-α mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平顯著上升（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平顯著下降（P<0.05）（表2）。

3 討論

非酒精性脂肪性肝炎的發病機制常被認為與“二次打擊”理論有關[4]。在這一理論中，線粒體和過氧化物酶體功能異常導致脂質過度氧化和損傷，引發肝細胞死亡和星狀細胞激化，最終誘發NAFLD。人體脂肪代謝是一個受多種生理因素和機制影響的復雜系統，包括脂肪生成、分解以及脂蛋白合成和分泌等關鍵過程。這些過程通過協同作用維持脂肪平衡，微小的變化都可能導致脂肪代謝失調，如肥胖或代謝綜合征。脂聯素調節通路在脂肪代謝中扮演重要角色，通過激活AMPK-ACC信號通路，增加PGC-1α表達，PGC-1α

是線粒體生物合成的關鍵因素，脂聯素對其表達程度的影響，實際上間接影響到了線粒體的生物合成，這種效應對恢復線粒體的正常功能有著重要意義。CPT-1α是由位于線粒體外膜的完全蛋白質組成的酶，它是使脂肪酸進入線粒體的重要調控酶。該酶的主要功能是參與線粒體中脂肪酸β氧化的限速反應，并促進長鏈脂肪酸由酰基輔酶A轉移到肉毒堿，從而促使它們從胞漿內移動到線粒體，并在線粒體的內膜上進行進一步的β氧化[5]。ACOX-1則是過氧化物酶體β氧化系統中引發第一反應的酶，并且是該反應的限速酶。ACOX-1的任務是將極長鏈脂肪酸降解為中鏈或長鏈脂肪酸，然后運輸至線粒體進行更進一步的氧化分解[6]。本研究結果發現二甲雙胍組PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1的表達較模型組有顯著升高，說明二甲雙胍能夠激活AMPKrzhiYHMUNW7woI9ys8RH4kABve9pGTm8ADRFyOP7lw0=-ACC信號通道，上調PCT-1α、CPT-1α、ACOX-1的生成，增強線粒體和過氧化物酶體進行的脂肪酸β氧化過程。非酒精性脂肪性肝病的主要病理特征在于肝細胞中游離脂肪酸積存量的大幅增加，超過了肝臟自身的氧化代謝能力。這種積累引發了線粒體脂肪酸β氧化的增加，從而導致活性氧化物（ROS）的大量生產。這一過量的ROS催生了強烈的氧化應激反應，該反應再進一步激發肝細胞或Kupffer細胞，導致炎癥因子如IL-6、TNF-α的產生，導致肝細胞的損傷。本研究顯示二甲雙胍可降低炎癥因子IL-6、TNF-α表達，改善炎癥反應。綜上所述，二甲雙胍可以通過降低血糖、調節脂肪代謝、改善氧化應激和炎癥反應，對NASH具有一定的治療作用，為未來臨床治療提供了新的思路。

參考文獻

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