循環腫瘤細胞在現代中醫腫瘤臨床研究中的應用分析

摘要：液體活檢（LB）為新一代檢測技術，能更準確地評價腫瘤患者疾病進展，從而為腫瘤防治提供臨床應用價值。目前，循環腫瘤細胞（CTC）是液體活檢最具潛力的研究方向之一。中醫治未病思想貫穿中醫藥治療疾病的始終，且中醫藥在腫瘤臨床診療中發揮越來越重要的作用。主要綜述現有CTC的富集策略以及CTC技術在中醫藥領域應用現狀，以期將現代腫瘤生物學應用在中醫藥防治腫瘤，建立中西醫結合模式的中醫理論指導與西醫技術模型，為中西醫腫瘤臨床診療提供新模式。

關鍵詞：循環腫瘤細胞；中醫藥；富集技術；精準醫學；液體活檢

19世紀30年代，Steven Paget[1]提出的“種子和土壤”假說形象地闡明了癌癥轉移過程。傳統的癌癥診斷金標準是組織活檢，但這種方法在大多數腫瘤的診斷和治療中存在局限性，比如創傷性和耗時性。近年來，液體活檢成為個體化“精準醫學”重要手段之一[2]。與組織活檢相比，液體活檢具有許多優點，包括樣本采集方便、操作可重復、信息全面等。因此，液體活檢已經成為可以用于癌癥篩查診斷、治療進展監測和預后評估的一個重要手段。在液體活檢中，與碎片化的ctDNA和外泌體相比，CTC具有完整的細胞形態，能提供關于腫瘤遺傳物質變化的大部分信息。同時，通過觀察CTC在形態上的變化、遷移能力以及藥物敏感性試驗等方面，可以對腫瘤的發生、轉移和耐藥機制進行研究[3]。但CTC檢測仍存在諸多挑戰，如CTC數量極少，尤其是混合在數量級相差巨大的血細胞中，如何實現識別并富集CTC而不吸附大量的血細胞，是CTC檢測最關鍵的難題；CTC與大多數腫瘤浸潤灶類似，存在很強的異質性[4]。

1CTC的富集策略

目前，主要的CTC識別方式主要有兩種：一種是根據細胞的生物物理特性，如尺寸大小、密度差異來物理識別CTC，通過物理特性識別CTC對細胞損傷小，分離出來的CTC在體外培養成活率高，有利于進行下一步單細胞組學分析，但識別效率較低，特異性較差；另一種則是通過確定CTC表面的蛋白標志物差異，通過將能與受體相結合的配體修飾在芯片或帶有磁性的磁珠表面，基于配體與受體高親和力的結合富集CTC，稱為免疫富集。

1.1 免疫磁珠富集

免疫磁珠富集中包括CellSearch?為代表的多種磁分離方法，也是最經典的CTC富集方法。其中，CellSearch?是唯一通過FDA認證的CTC富集策略，也是目前CTC檢測的金標準。該系統采用包被上皮細胞黏附分子（EpCAM）的鐵納米流體粒子來富集EpCAM陽性的CTC，EpCAM也是免疫磁珠富集中最常用的靶標分子。該方法的優勢是可以穩定高效富集CTC，但局限性明顯，只能富集EpCAM高表達的CTC。在實際樣本檢驗中會發現，許多CTC處于上皮-間質化（EMT）的動態轉化過程，在此期間，CTC會根據定植或轉移的需要動態調整上皮型與間質型的蛋白表達量，如部分或完全下調EpCAM、鈣黏蛋白E（E-cadherin）和細胞角蛋白（CK）等上皮標志物，對間質特異性標志物，如波形蛋白和鈣黏蛋白N（N-cadherin進行上調，這與 EMT 相關轉錄因子 Slug、Snail和 Twist的表達增加有關[5]。據報道，與上皮細胞相比，這些間充質CTC具有更高的轉移性，是更具侵襲性的轉移亞群[6]。因此，僅根據 EpCAM 表達來分離 CTC， 可能會導致 CTC 計數不準確，且磁分離的方法會對細胞產生損傷，從而限制CTC下游分析。

1.2 免疫微流控富集

免疫微流控富集技術是近年來發展極為迅速的CTC富集技術，該技術是通過將血液以一定的速度流經設計有微通道的芯片內部，在芯片內部通道中基于免疫標記物或根據細胞尺寸大小來分離血細胞與CTC，不僅可以提高CTC與微通道內部有抗體或其他配體修飾表面的接觸表面積，還可以提高回收細胞的存活率。但微流控富集的方法也存在局限性，由于微流體芯片需要控制樣本流入速度，大大增加了樣品處理以及分析的時間，且微流體芯片通量較小，一次只能處理較少的血液樣品。

1.3 生物物理特性富集

生物物理特性富集主要是根據細胞尺寸大小、介電性以及密度等差異來分離CTC與血細胞，主要代表方法有以下幾種。

（1）經膜過濾法 ：CTC直徑一般在8～30 μm，而血細胞直徑為12～15 μm，遠小于CTC，利用這種方法可將尺寸較小的血細胞攔截在膜表面。富集CTC保留了CTC的異質性，且廉價、操作簡便，但膜過濾系統通常容易堵塞，且富集到的CTC純度較低。

（2）微流體過濾法：根據細胞不同尺寸設計的階梯式過濾法以及螺旋上升式微流控系統，能夠根據CTC不同尺寸優化分離，并且可以捕獲到CTC簇[7]。由于生物物理特性富集法不依賴于免疫靶標，這種方法可以同時捕獲間充質型和上皮型CTC，保留了CTC群體的異質性，并擴大了臨床實用性，使其能夠從所有癌癥類型中捕獲CTC，而不僅限于上皮癌。由于沒有抗體等配體標記，生產成本通常較低。但它們的通量通常相當低，處理時間較慢，且大多數設備一次只能處理一個樣品。由于血細胞在尺寸上與CTC的重疊區域，降低了富集到的CTC純度。但是，生物物理特性富集仍然是CTC分離領域的重要組成部分。

2CTC在臨床實際應用現狀

盡管在CTC富集策略中已經有了許多前沿性研究，CTC臨床研究積累了大量循證醫學研究證據，但仍沒有臨床指南將CTC檢測納入臨床應用，說明這些富集策略仍然需要大規模的臨床驗證。目前只有CellSearch?系統可用于臨床檢驗，其他富集策略雖然展現了諸多優勢，但將CTC檢測轉化為常見的臨床檢驗仍然缺乏說服力，主要原因仍是目前CTC檢測的方法尚未標準化以及對CTC所攜帶的關鍵信息分析，這些信息中可能揭示了癌癥轉移機制，包括CTC從原發腫瘤外滲的機制、CTC如何與血細胞相互作用以在循環微環境中生存，以及 CTC如何內滲到遠處的轉移部位以引發新的病變。

CTC的重要分子特征可大大有助于確定抗轉移療法的靶點。只有一小部分 CTCs 能最終產生轉移，針對這些強轉移性CTC的研究有望成為癌癥治療的新靶點。尤其是將生物物理特性與免疫分離相結合的分離方法，會是未來主要的發展方向。盡管在臨床上，CTCs作為癌癥篩查、治療監測和預后預測的替代生物標志物的應用仍然有限，但其在癌癥診斷臨床應用中的巨大潛力已經顯現。一旦發生轉移，通常難以獲得轉移病灶的重復活檢，即使在同一患者身上，不同的轉移灶也存在異質性。使用外周血樣本檢測 CTCs 不僅方便，而且可能更具代表性。

3CTC在中醫辨證腫瘤應用研究

大多數腫瘤早期無明顯癥狀，這大大增加了臨床診治難度。CTC作為現代腫瘤生物學與分子生物學最熱門的領域之一，可以為中西醫在研究腫瘤的發病機制中提供客觀依據。尤其是如今中醫在臨床防治腫瘤發揮越來越重要作用，將前沿腫瘤研究融進中醫學理論研究與實際臨床辨證應用，促對進中西醫結合發展具有重要意義。

3.1 CTC與腫瘤病因病機

“癌毒”學說在20世紀末由國醫大師周仲瑛首先提出，認為其屬于中醫學“毒邪”范疇。20世紀70年代，國醫大師劉嘉湘先生通過將對中醫學理論研究與現代腫瘤生物學研究相結合，提出了“扶正致癌”的防治腫瘤理念，認為腫瘤的發生主要是由于人體正氣不足，外邪乘人體之虛，與內伏之邪毒共同引起人體的陰陽失調、氣血運行障礙，導致寒凝、痰瘀、氣滯血瘀等一系列病理因素。現代腫瘤臨床中，早期注重腫瘤組織與細胞減滅，如放、化療等技術。這與中醫中的攻伐法較為類似，但此種方法對人體正氣損傷較大，正氣損傷必定進一步導致邪毒進入機體，而正氣已虛，無力抵御，因而經過放化療的腫瘤患者免疫系統功能低下。在臨床腫瘤診治中，注重免疫功能維護有助于預防腫瘤復發轉移，改善患者預后，這也與中醫理論中扶正的內涵相似，和毒邪具有流竄性、隱匿性的特點相符合。“伏邪”理論源于《內經》。田建輝教授等研究發現，CTC在肺癌復發與轉移中的作用與“邪氣伏藏，待時而動”蘊含的病因病機有重合之處，并在此基礎上提出了“正虛伏毒”致癌的觀點。

3.2 CTC與中醫辨證分型的關系

腫瘤患者由于腫瘤的發展狀態不同，中醫辨證分型也處于動態變化的過程中。中醫理論中，同病異治與異病同治體現了辨證分型的重要性。不同腫瘤的病因都由邪毒引起，但因個人體質與機體所處的環境不同，需通過整體觀念與個體辨證相結合治療腫瘤。但腫瘤的中醫辨證分型各家尚未統一，CTC的表征可能為中醫證型建立統一標準提供參考數據。吳嬌發現，舌質紫紅有瘀斑的患者CTC數量更多。這些研究表明，CTC數量可能與中醫辨證腫瘤中一些證型存在一定的相關性。

3.3 CTC對中醫藥的療效評價

中醫治未病思想貫穿疾病治療的始終，強調“未病先防，已病防傳”。因CTC在腫瘤早期可能已經開始了血行轉移過程，因此CTC檢測能夠在腫瘤早期影像學檢查未出現可疑病灶前提供篩查技術手段。而在腫瘤治療后，CTC檢測能夠通過治療前后的數量變化判斷藥物或治療手段的療效。胡燕勤等通過對比經大柴胡湯聯合化療前后的患者CTC數量發現，大柴胡湯能有效減輕化療后副作用，延長患者生存期。李長洋發現，健脾化積方可以抑制腫瘤細胞增殖與侵襲，從而抑制肺癌轉移。顧寄樹等發現，康萊特中藥注射劑聯合化療后的患者CTC數量更低。陸恩昊研究發現，中藥金復康口服液可以顯著循環腫瘤細胞的成簇能力。毛竹君等發現，四藤方應用于胃癌術后中西醫結合治療后，可顯著下調CTC數量。對CTC的研究，可能為中藥防治腫瘤復發轉移提供細胞生物學基礎。

4討論與展望

循環腫瘤細胞在中醫主要研究方法有前瞻性與回顧性隊列研究，隨機對照試驗仍然缺乏多中心大樣本的數據，CTC富集策略的靈敏性與特異性仍然需要進一步提高。CTC檢測未形成自動化、標準化檢測，還無法作為臨床檢驗手段。在液體活檢中，CTC檢測具有巨大優勢，分離后的CTC可以進行培養或下游分析。另外，在CTC周圍的血液及其他微環境研究中，也存在著腫瘤存活與轉移侵襲的奧秘。中醫在腫瘤中的證候分析尚未建立一致的診療規范，導致CTC研究多以中藥作用機理與臨床療效觀察居多，對于辨證分型的研究較少。今后應對腫瘤的證型展開規范化、一致化分析，推動中醫藥在現代腫瘤學中的發展。

參考文獻

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