a-硫辛酸在微囊藻毒素-LR誘導草魚卵巢細胞損傷中的作用

關鍵詞：草魚卵巢細胞；a-硫辛酸；微囊藻毒素-LR；氧化應激；炎癥反應

微囊藻毒素（MicrocVstins，MCs）是淡水水體有毒藍藻產生的一類藻毒素，目前已有超過279種微囊藻毒素異構體，其中微囊藻毒素-LR（MicrocVstin-LR，MC-LR）是毒性最大、研究最廣泛的一種異構體。研究表明MC-LR具有顯著的肝毒性，它通過抑制絲氨酸一蘇氨酸磷酸酶1和2A而引起蛋白質磷酸化增加，導致細胞骨架結構的改變。此外，研究表明，氧化應激在MCs誘導毒性作用中也起著重要作用，它們可以誘導細胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的形成，氧化和破壞細胞大分子，導致組織和器官的損傷。目前，MCs的氧化毒性機制已引起廣泛的關注，一些學者嘗試使用天然或化學抗氧化劑來減少MCs誘導的組織或器官的損傷，例如，Gehringer等研究發現維生素E對MC-LR誘導的小鼠肝臟有保護作用，其他學者還發現姜黃素、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸、水飛薊素、巖藻多糖和大蒜等可顯著降低MC-LR誘導的肝臟氧化損傷。

MC-LR除了誘導肝毒性之外，還可在生殖系統中蓄積并產生生殖毒性。研究發現，MC-LR可破壞哺乳動物睪丸、卵巢、前列腺和胎盤等器官的結構和功能，從而降低哺乳動物的生殖能力；同時，MC-LR的毒性還可以通過胎盤傳給后代，造成后代死亡、畸形、生長遲緩以及器官功能障礙等。在魚類中，MC-LR能影響斑馬魚的內分泌和卵子發生，并干擾卵母細胞減數分裂，從而對斑馬魚的生殖造成不利影響，同時其還能在魚類的卵巢和精巢中積累并傳遞給后代。卵巢由于富含不飽和脂質而很容易受到氧化損傷。Hou等研究發現卵巢的抗氧化防御系統可能是斑馬魚對抗MC-LR毒性作用的重要機制。因此，有學者對抗氧化劑降低MC-LR誘導的生殖毒性做了一些探索性的工作。例如，N-乙酰半胱氨酸可以降低MC-LR誘導的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）和C57BL/6小鼠卵巢的氧化損傷，但這方面的研究還比較少。

a-硫辛酸（Alpha lipoic acid， a-LA）是一種含有1個二硫鍵的天然有機硫化物（圖1），屬于B族維生素，兼具水溶性和脂溶性的性質，極易被多種組織器官吸收利用。此外，a-LA對內源性的抗氧化劑如維生素C、維生素E以及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等具有再生作用，從而可提高機體的抗氧化能力。同時，a-LA還可通過提高抗氧化酶的活性從而發揮抗氧化功能，如飼料中添加a-LA可顯著提高皺紋盤鮑體內的超氧化物歧化酶（Superoxide dis-mutase．SOD）活性以及GSH含量。a-LA作為一種強大的抗氧化劑，可有效提高機體的抗氧化能力，從而降低MC-LR的毒性。也有一些研究表明，a-LA能有效降低MC-LR對魚類肝臟、大腦和肌肉的毒性，并通過激活核因子相關因子2（Nuclear factorervthroid 2-related factor 2，Nrf2）再生GSH來保護MC-LR誘導的肝毒性。但目前還沒有報道a-LA在MC-LR誘導的生殖毒性方面的保護作用。草魚（Ctenopharyngodon idella）作為我國四大家魚之一，是我國重要的淡水養殖魚類，但目前關于MC-LR對草魚生殖的影響還未見報道，更沒有相關研究報道a-LA在MC-LR誘導的草魚卵巢（Grass carp ovary，GCO）細胞毒性中的作用。結合相關文獻報道，我們推測a-LA可通過抑制MC-LR誘導GCO細胞氧化應激從而保護細胞。因此，本研究以GCO細胞為研究對象，探討a-LA在MC-LR致GCO細胞毒性中的保護作用，并為MC-LR生殖毒性的防治提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1試驗細胞

試驗所用GCO細胞是中國科學院水生生物研究所在20世紀70年代開展草魚m血病研究時建立的一株細胞系，由江西師范大學付建平老師保存惠贈。

1.2主要儀器與試劑

細胞培養所用的C02培養箱為Hengzi公司產品。冷凍離心機和NANODROP2000超微量分光光度計為Thermo公司產品。MULTISKANFC全波段掃描酶標儀和CFX96／384 Touch實時熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產品。MC-LR（純度gt;98%）與a-LA分別購自Expreess Technology與Sigma公司。胎牛血清、M199培養基、0.25%胰蛋白酶購自Biological Indus-tries公司。青鏈霉素混合液、二甲基亞砜（DMSO）、1×PBS、噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bro-mide，MTT）檢測試劑盒為Solarbio公司的產品。提取RNA的TRIzol Reagent試劑盒購自Invitrogen公司。合成cDNA的PrimeScript RT reagent Kit With gDNAEraser試劑盒與用于qRT-PCR的SYBR Premix ExTaprMⅡ試劑盒均購自Takara公司。乳酸脫氫酶（Lac-tic dehydrogenase， LDH）、GSH、丙二醛（Malondialde-hvde，MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司，二喹啉甲酸法（Bicinchoninic Acid Assay，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自Bevotime公司。

1.3 GCO細胞復蘇及培養

從-80℃冰箱中取出凍存的GCO細胞，置于26℃水浴鍋中水浴溶解，將溶解的GCO細胞懸液用基礎培養基重復清洗兩次，隨后加入完全培養基重懸細胞，并將細胞轉移到培養皿或培養瓶中，在條件為26℃、5% C02的培養箱中進行培養，并取對數生長期的細胞用于后續試驗。

1.4 MTT法測定細胞活力

取對數生長期的GCO細胞，以1.2×105 ind·mL-1的濃度接種到96孔細胞培養板中，設置不同MC-LR濃度（0、5、10、20、40、60umol·L-1）和a-LA濃度（0、62.5、125、250、500、1000、2000umol`L-1）的完全培養基處理GCO細胞。每個濃度設5個平行，處理24h后，采用MTT法分別分析MC-LR和a-LA對GCO細胞活力的影響。MTT法簡單操作步驟如下：在避光條件下每孔加入20uL MTT溶液，于培養箱內孵育4h，小心吸出上清液，避免吸到藍紫色結晶，隨后每孔加入150uL DMSO溶液，搖勻后，孵育10min，充分溶解結晶，最后采用酶標儀測定各孔在570nm處的吸光度值（OD），計算細胞活力。根據吸光度值采用SPSS 22.0軟件計算得到MC-LR 24h的半數增殖抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）約為48umol·L-1，隨后選擇12umol·L-1（IC50/4）和24umol·L-1 （IC50/2） MC-LR作用于GCO細胞并進行形態觀察，發現24umol·L-1 MC-LR組細胞內出現自噬體、細胞質內出現較多的空泡、線粒體發生腫脹、內質網擴張等，因此，選擇1/2 IC50即24umol-L-1MC-LR為后續試驗的染毒濃度，相關信息參考本實驗室前期發表的文章。

1.5試驗分組及處理

取對數生長期的GCO細胞，以1.2x105ind·mL-1的濃度接種到100mm培養皿中，待細胞貼壁生長至80%左右后，根據1.4活力測定的MC-LR和a-LA對GCO細胞活力影響的結果，設置空白對照組（不添加MC-LR和a-LA）、a-LA組（125umol·L-1a-LA）、MC-LR組（24umol·L-1MC-LR）以及a-LA+MC-LR組（125umol·L-1 a-LA+24umol·L-1 MC-LR），每個處理設置3個重復。細胞培養24h后取樣分析。

1.6 LDH活性和抗氧化指標的測定

由1.5分組處理結束后，采用PBS溶液洗兩遍，離心收集細胞，加入200uL PBS重懸細胞，利用超聲儀超聲破碎細胞使細胞內成分釋放，離心10min（12000r·min-1），收集上清。LDH活性以及組織中MDA和GSH含量均按照試劑盒說明書嚴格操作測定，測定GSH及MDA含量時，采用BCA法測定蛋白含量。

1.7引物設計

根據NCBI基因庫已有的草魚基因全長序列，使用Primer Premier 5軟件設計實時熒光定量（qRT-PCR）的引物，其中內參基因GAPDH的選用參考本實驗室前期已發表的文章。引物由上海生物工程有限公司合成，試驗所用引物如表1所示。

1.8RNA提取及qRT-PCR

根據1.5中的分組方案將GCO細胞處理24 h后，PBS溶液清洗細胞兩次，收集細胞于無RNA酶的離心管。使用Trizol法提取細胞總RNA，再利用微量分光光度計測定RNA的純度和濃度。然后嚴格按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒使用說明合成cDNA。將合成的cDNA稀釋5倍，再根據SYBR Premix Ex TapⅡ試劑盒使用說明配制10uL qRT-PCR反應體系，每個樣品設置3個重復孔，采用Bio-Rad CFX熒光定量PCR儀進行反應，以GAPDH為內參基因，采用2法計算各基因在GCO細胞中的相對表達量。

1.9統計學處理

本試驗的所有結果均以平均數±標準差（Mean±SD）表示。使用SPSS 22.0軟件對數據進行單因素方差分析（One-ANOVA），運用Tukey檢驗進行組間多重比較，其中Plt;0.05表示組間差異顯著，具有統計學意義。

2結果與分析

2.1a-LA對GCO細胞活力的影響

a-LA作用24 h對GCO細胞活力的影響結果如圖2所示，與不添加a-LA組相比，隨著a-LA濃度的升高，細胞活力呈現先上升后下降的趨勢。62.5pmol·L-1a-LA可顯著提高細胞活力（Plt;0.05），而當a-LA濃度為125-1000umol·L-1時，細胞活力無顯著變化（Pgt;0.05），當a-LA的濃度上升至2000umol·L-1時，細胞活力顯著下降（Plt;0.05）。

2.2a-LA對MC-LR誘導GCO細胞活力的影響

如圖3所示，與對照組相比，MC-LR單獨處理和MC-LR聯合不同濃度a-LA處理均能夠顯著降低細胞活力（Plt;0.05）．而與MC-LR組相比，125umol·L-1a-LA+MC-LR組細胞活力顯著上升（Plt;0.05），說明該濃度的a-LA對MC-LR致GCO細胞毒性具有較好的保護效果。因此，后續選用125umol·L-1的a-LA進行試驗。

2.3 a-LA對MC-LR誘導GCO細胞培養基上清LDH活性的影響

GCO細胞培養基上清中LDH的活性結果如圖4所示，與對照組相比，a-LA組LDH活性無顯著變化（Pgt;0.05），MC-LR組LDH活性顯著上升（Plt;0.05）。而與MC-LR組相比，a-LA+MC-LR組LDH活性顯著下降（Plt;0.05）。

2.4 a-LA對MC-LR誘導GCO細胞抗氧化指標的影響

如圖SA所示，與對照組相比，GCO細胞內GSH相對含量在MC-LR組顯著下降（Plt;0.05），而在a-LA+MC-LR組中其含量顯著上升（Plt;0.05）。與MC-LR組相比，a-LA+MC -LR組GCO細胞內GSH相對含量顯著上升（Plt;0.05）。由圖SB可知，MC-LR組GCO細胞內MDA相對含量與各組相比均顯著上升（Plt;0.05），且在對照組、a-LA組、a-LA+MC-LR組間無顯著變化。

如圖5C、圖5D、圖5E所示，GCO細胞內SOD1、CAT、GST基因相對表達量在對照組與a-LA組間均無顯著變化（Pgt;0.05）；相對于對照組與a-LA組，MC-LR組、a-LA+MC-LR組的SOD1、CAT、GST基因相對表達量均顯著下降（Plt;0.05）；相對于MC-LR組，a-LA+MC-LR組的.SOD1、CAT基因相對表達量無顯著變化（Pgt;0.05），GST基因相對表達量顯著上升（Plt;0.05）。

2.5a-LA對MC-LR誘導GCO細胞炎癥相關基因表達的影響

a-LA對MC-LR誘導GCO細胞炎癥相關基因表達的影響結果如圖6所示，與對照組相比，a-LA組中TNFa基因的相對表達量無顯著變化（Pgt;0.05），與MC-LR組相比，a-LA+MC -LR組中TNFa基因的相對表達量顯著下降（Plt;0.05，圖6A）。與對照組相比，a-LA組中基因的相對表達量無顯著變化（Pgt;0.05），與MC-LR組相比，a-LA+MC-LR組中基因的相對表達量顯著下降（Plt;0.05，圖6B）。

3討論

卵巢是雌性動物的重要生殖器官，可以產生卵子和類固醇性激素。急性暴露于MC-LR已被證明會導致斑馬魚卵巢的病理損傷，并引發氧化應激。本實驗室前期研究也發現MC-LR可誘導GCO細胞產生氧化應激。本研究旨在確定a-LA是否對MC-LR誘導的GCO細胞氧化損傷具有緩解作用。

a-LA作為一種天然的抗氧化劑，含有1個二硫鍵，其一旦進入細胞，二硫鍵就被還原為二氫硫辛酸（DHIA），并與蛋白質氨基酸殘基的氨基結合形成酰胺鍵，酰胺鍵可經脂酰胺酶作用裂解釋放具有生理功能的a-LA。研究表明a-LA在保護機體免受氧化損傷方面具有巨大的潛力，因此其在臨床研究以及生產實踐中得到廣泛應用。有研究表明，a-LA可以顯著提高缺氧狀態下大鼠皮層神經元細胞的活力，并且a-LA可顯著提高鎘脅迫下大鼠肝細胞活力。本研究發現a-LA可顯著提高MC-LR作用后的細胞活力（Plt;0.05）。此外，LDH是無氧酵解和糖異生的重要酶系之一，在體內能量代謝過程中發揮重要作用，幾乎存在于所有組織中，細胞損傷均可導致LDH濃度增加。進行離體細胞培養時，如果培養的細胞受損，LDH也會由細胞漏m至培養液中。本試驗結果表明，a-LA+MC-LR組LDH活性較MC-LR組顯著下降（Plt;0.05），這與其他人的研究結果類似．如Zhang等研究發現，a-LA能降低缺氧誘導的臍靜脈內皮細胞中LDH的釋放。因此，本研究結果表明a-LA能夠緩解MC-LR導致的GCO細胞損傷。

MDA被認為是評價機體氧化應激最重要的標志物之一，是來源于機體內不飽和脂肪酸被氧自由基攻擊而形成的過氧化產物，而GSH是機體內重要的抗氧化物，可被GST催化并與機體內有害的親電基團結合，從而清除體內的脂質過氧化物。有研究顯示，MCs能消耗GSH造成的細胞氧化應激和脂質過氧化（Lipid peroxidation，LPO），產生過氧化產物如MDA等，從而損傷細胞器，繼而引起內質網應激。也有研究發現小鼠經腹腔注射MC-LR后，其肝臟GSH水平發生時間依賴性變化，且谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽還原酶（Glu-tathione reductase．GR）等的活性發生改變。Amado等的研究表明，a-LA可提高鯉魚腦和肝臟中GST的活性從而抵抗MC-LR誘導的機體損傷。Gu等的研究表明，a-LA可提高HepG2和Be17402細胞內GSH的生成以及SOD的活性，同時降低ROS的生成和MDA的含量，從而減弱MC-LR對細胞的損傷。還有研究發現在飼料中添加a-LA可提高鯽魚肝臟GPx和CAT活性，并提高機體的總抗氧化能力，降低MDA含量，從而減輕MC-LR對魚體的氧化損傷。在本研究中，相對于對照組，MC-LR可以顯著升高GCO細胞內MDA含量，并顯著降低GSH含量，這說明MC-LR可以誘導GCO細胞發生氧化應激。與MC-LR組相比，a-LA+MC-LR組GCO細胞內GSH含量顯著上升，且MDA含量顯著下降，說明a-LA可能通過升高機體內GSH含量而增強機體抗氧化能力，以此降低MC-LR造成GCO細胞氧化應激而升高MDA含量。但在本研究中，a-LA+MC-LR組的CAT和SOD1基因表達水平相對于MC-LR組并沒有顯著差異，僅上調了CST基因的相對表達水平。因此推測本試驗中a-LA主要通過增加GCO細胞內GSH的含量，并促進GST的表達，從而促進GSH清除MC-LR誘導的自由基，最終降低細胞內MDA的生成，以此來緩解MC-LR引起的GCO細胞氧化損傷，這與Pflugmacher等的研究結果類似。

ILII是一種與炎癥及免疫疾病相關的多功能細胞因子，也具有抗炎作用。有研究表明，炎癥是刺激ILII表達的因素之一，當機體受到感染、損傷和炎癥反應時，ILII基因表達會增加。TNFa也是一種炎性細胞因子，可與受體TNFR2結合介導細胞激活NF-KB信號通路，進而抑制細胞凋亡或促進細胞炎癥的發生，所以當機體發生炎癥時，通常會促進TNFa的表達。有研究表明MC-LR能通過誘導血管內皮細胞氧化應激，致使TNFa的表達升高，從而誘導炎癥反應。在本研究中MC-LR同樣可導致ILII和TNFa基因表達水平的升高，表明MC-LR誘導了GCO細胞反應的發生。有趣的是，有研究發現a-LA同樣具有緩解機體內炎癥損傷的作用。如Costa等研究發現，a-LA可降低IL6和TNFa水平，抑制藥物誘導小鼠炎癥的發生，從而提高小鼠的存活率。此外，a-LA還可作為抗炎劑抑制小鼠IL-1和TNFa蛋白的表達【46]。本試驗結果與上述研究結果相似，表明a-LA能通過下調GCO細胞中TNFa和ILII基因的表達來抑制炎癥的發生，從而減弱MC-LR對GCO細胞的損傷。

到目前為止，人們盡管嘗試了維生素E、姜黃素、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸、水飛薊素、巖藻多糖和大蒜等天然或化學抗氧化劑來降低MC-LR誘導的肝臟、腎臟、心臟等組織或器官毒性，但仍然處于實驗室研究階段。與其他抗氧化劑相比，a-LA最獨特的特點是它可以同時與脂質和水溶性化合物反應。研究表明a-LA在體內外實驗中均展示了其可緩解MC-LR誘導的肝毒性，也有文獻表明a-LA可作為抗MC-LR誘導的肝臟氧化損傷的潛在藥物。本研究所有結果也表明a-LA可緩解MC-LR誘導的生殖細胞毒性，然而，本研究缺乏體內生殖毒性實驗的數據，對a-LA誘導的生殖毒性的具體調控機制也未開展研究，在今后的研究中，將重點對該方面進行深入探討。

4結論

a-硫辛酸作為抗氧化劑具有很大的潛力，可以提高草魚卵巢細胞經微囊藻毒素-LR誘導后的抗氧化能力，并通過緩解氧化應激反應的發生，抑制炎癥反應，從而減弱微囊藻毒素-LR對草魚卵巢細胞的損傷。因此，a-硫辛酸對預防微囊藻毒素-LR誘導的生殖毒性有一定的作用。