灰霉菌脅迫下番茄葉片cDNA文庫構建及SlbZIP1互作蛋白篩選鑒定

摘要：為篩選番茄在灰霉菌侵染下與bZIP轉錄因子SlbZIP1（Solyc01g008730.2.1）互作的蛋白，以感病番茄Moneymaker為材料，提取接種灰霉菌脅迫處理后0、24、48、72、96 h的番茄葉片的總RNA，通過三框法構建cDNA酵母文庫，計算文庫庫容量、重組效率。同時，以SlbZIP1為誘餌，利用構建的文庫探索其在灰霉菌侵染過程中的互作蛋白，并對其中可能參與病原菌防御反應的潛在蛋白在酵母中進行互作驗證。結果表明，酵母文庫庫容達到1.5×10⁶ CFU，重組效率為98%。酵母雙雜交共計篩選到14個與SlbZIP1互作的潛在蛋白。進一步互作驗證表明，SlbZIP1與谷氧還蛋白SlGRXC9、SlGRXC6、bZIP轉錄因子SlTGA2.2及鈣調蛋白SlCaM1均存在互作。上述結果可為進一步闡明SlbZIP1對腐生型真菌病害的抗病分子機制奠定基礎。

關鍵詞：番茄；灰霉菌；cDNA文庫；bZIP轉錄因子；互作蛋白

中圖分類號：S436.412.1⁺3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）18-0035-06

收稿日期：2023-09-06

基金項目：寧夏自然科學基金（編號：2023AAC03069）；中央引導地方項目（編號：2022FRD05040）；寧夏回族自治區重點研發計劃（編號：2023BCF01042）；寧夏大學人才引進科研啟動基金。

作者簡介：馬 燕（1997—），女，寧夏彭陽人，碩士研究生，從事番茄分子育種相關研究。E-mail：15709510297@163.com。

通信作者：楊玉婷，博士，講師，從事蔬菜生物技術與遺傳育種方向的教學與科研工作。E-mail：yanyt@nxu.edu.cn。

番茄（Solanum lycopersicum）是我國重要的果菜之一，含有豐富的維生素和抗氧化成分，具有很高的食用性和商品性^［1］。灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一種廣泛存在的植物病原真菌，典型的腐生型生活模式，能夠感染生長受損或衰老的植物組織，引起組織腐爛，最終導致植物組織死亡。番茄灰霉病是由灰葡萄孢侵染引起的一種真菌病害，其傳播速度快且危害重，是番茄上發生較為頻繁且嚴重的病害之一。該病主要危害番茄的葉片、果實等組織部位，也可危害莖和花，極大影響了番茄產量，通常造成番茄減產20%～30%，嚴重者高達50%，甚至絕產，給農戶帶來巨大的經濟損失^［2-3］。

植物遭受病原菌侵染時，植物體內病原菌應答基因、次級代謝物、信號分子等迅速反應以調控該過程。在植物病原菌侵染應答響應中，許多轉錄因子結合自身轉錄因子或者其他的轉錄因子及功能基因共同促使植物適應脅迫過程^［4］。目前，對于脅迫條件下，與調控轉錄因子共同參與防御反應的基因查找更多的是采用酵母雙雜交技術。尤其是對于已知轉錄因子相互作用的未知組分的挖掘，需建立高質量的酵母雙雜交cDNA文庫，以便于未知蛋白的篩選。郭振華等構建了核桃的酵母cDNA文庫并通過文庫篩選了生長素響應因子4的互作蛋白^［5］。賽靜憶等構建了梨幼果FWL1膜系統酵母cDNA文庫并進行了互作蛋白的篩選^［6］。馬登輝等構建了山葡萄葉片低溫脅迫下的酵母cDNA文庫^［7］?，F在番茄上，就番茄不同組織、番茄花柄脫落過程、番茄分裂泛素、Cf-19介導的抗番茄葉霉病免疫應答、干旱脅迫、干旱脅迫與病毒復合侵染處理、晚疫病誘導等多個組織及非生物和生物脅迫進行了酵母cDNA文庫構建^［8-15］，然而就腐生型真菌灰霉菌侵染下的酵母文庫的構建相對較少。

因此，本研究首先構建灰霉菌侵染感病番茄葉片全長cDNA文庫。以響應灰霉菌侵染的番茄轉錄因子SlbZIP1為誘餌，利用酵母雙雜交技術，對灰霉菌侵染番茄過程中與SlbZIP1互作的蛋白進行篩選，分析篩選結果，確定SlbZIP1的潛在互作蛋白，并通過酵母一對一驗證試驗進一步確定SlbZIP1的互作組分，為進一步研究SlbZIP1參與番茄灰霉病防御反應分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄材料Moneymaker（MM）由寧夏大學葡萄酒與園藝學院分子遺傳育種實驗室提供，為實驗室保留的高度純合自交系，對病原菌侵染表現為感病性。挑選籽粒飽滿的番茄種子催芽后播種于填充有草炭土和蛭石（體積比為3 ∶1）基質的營養缽中。播種后置于光照培養箱（GDN-400G-3，陜西華屹儀器有限公司，陜西楊凌）內生長。光照培養箱溫度為22～28 ℃，光—暗周期為16 h—8 h，光照條件2 000 lx，相對濕度80％～90％。當幼苗長至3葉1心時進行灰霉菌接種處理。

1.2 方法

1.2.1 灰霉菌的獲得及灰霉孢子懸浮液的制備

供試灰霉菌采自于寧夏自治區銀川市周邊設施發病初期的番茄。參考董友磊的方法從病原體上分離灰霉菌置于PDA培養基上^［16］。參考Nielsen等的方法將分離到的病原菌進行鑒定^［17］。挑取鑒定后的灰霉菌菌絲于無菌水，參考Yang等的方法添加2%蔗糖、0.8%KH₂PO₄制備孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數板記錄孢子懸浮液濃度，將孢子懸浮液濃度調整為1.0×10⁵ CFU/mL待用^［18］。

1.2.2 番茄灰霉菌接種處理

參照Yang等的方法在寧夏大學科技樓分子遺傳育種實驗室于2023年3月1日至8月20日對番茄葉片進行灰霉菌接種處理^［18］。用噴壺將含有灰霉孢子的懸浮液均勻噴灑至3葉1心番茄充分展開葉片的正面，直至有水滴滴落。接種后，將幼苗培養于光照培養箱中，透明罩保濕，溫度為（26±2） ℃，光—暗周期為16 h—8 h，保持相對濕度在90％以上。分別在接種后0、24、48、72、96 h統一采集地上部，快速用液氮速凍并保存在-80 ℃冰箱備用。每個處理5株幼苗，3次重復。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA合成

將采集的植物樣品等量混合，使用植物RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取植物總RNA。使用cDNA合成試劑盒（寶生物工程有限公司，大連）進行cDNA合成反應。使用cDNA均一化TRIMMER DIRECT cDNA Normalization Kit和純化試劑盒TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit獲得均一化后純化的cDNA。

1.2.4 cDNA三框表達文庫構建

純化的cDNA使用限制性內切酶SfiI進行酶切處理，去除短片段的cDNA，使用DNA ligation Kit將其連接至pGADT7三框載體，得到初級cDNA文庫。取少量初級文庫連接液轉化感受態細胞 HST08，液涂布Amp+抗性LB平板，37 ℃過夜培養。通過平板上生長的菌落個數，計算初級文庫庫容。使用NucleoBond Xtra Midi EF試劑盒進行文庫質粒提取。

1.2.5 酵母表達載體構建

利用一步克隆法構建酵母表達載體。根據SlbZIP1、SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1的編碼區序列，設計帶接頭的特異性擴增引物（表1）。用高保真HS聚合酶（寶生物工程有限公司，大連）擴增SlbZIP1、SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1的編碼區序列，回收PCR產物，參考許銅碩等的方法^［19］進行連接。挑取單克隆進行檢測并送奧科測序部（北京鼎盛生物科技有限公司）進行測序。測序正確的質粒保存留用。

1.2.6 誘餌酵母自激活檢測

參照Clontech的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual說明書將誘餌載體轉入酵母細胞，采用PEG/LiAc轉化法轉入酵母細胞Y2H中。涂布于SDO、SDO/X及SDO/X/A缺陷選擇培養基上，30 ℃倒置培養3～5 d，觀察培養基上單克隆的生長情況以檢測誘餌質粒的自激活活性。

1.2.7 酵母雙雜交篩選

挑取誘餌菌落制作含有誘餌質粒的感受態細胞，將20 μg文庫質粒轉化到感受態細胞。取少量懸浮液進行1/100、1/1 000稀釋，涂布于DDO培養基，檢測篩選覆蓋效果。剩余的懸浮液全部涂布到DDO/X/A（200 μg/mL）培養基上進行初篩。初篩到的菌落于QDO/X/A培養基上進一步篩選。

1.2.8 陽性克隆測序及BLAST分析

對篩選到的菌落，使用T7和3′Ad引物進行PCR檢測，產生特異條帶的菌落送奧科測序部（北京鼎盛生物科技有限公司）進行測序。分析測序所得序列，選擇匹配度高的序列，查rStQMIVIC+xXIAySVEIddlSYz3ZSacnz1fWACebvipk=看基因序列及功能。

1.2.9 酵母雙雜交驗證篩選結果

將構建正確的酵母表達載體pGBKT7-SlbZIP1和pGADT7-SlGRXC9、pGADT7-SlGRXC6、pGADT7-SlTGA 2.2、pGADT7-SlCaM1參照俞沁含等的方法共轉化酵母Y2H菌株^［20］，以pGBKT7-53 +pGADT7-T為陽性對照，以pGBKT7-Lam+pGADT7-T為陰性對照，定量于DDO、DDO/X/A（200 ng/mL）、QDO、QDO/X/A（200 ng/mL）酵母培養基上，觀察單菌落生長狀況。

2 結果與分析

2.1 番茄葉片灰霉菌脅迫下酵母雙雜交核三框cDNA文庫構建及鑒定

選取處理后的番茄葉片均一混合后提取總RNA，檢測D_{260 nm}/D_280nm為2.08，電泳檢測結果如圖1-A所示，有清晰的條帶出現，分別為28S和18S的RNA條帶，表明提取到正確且完整的RNA。利用SMART法合成cDNA，對其在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測其合成效果，結果如圖1-B所示，條帶沉陷彌散狀態，分布在500～4 000 bp之間。經過均一化處理后，無特異性明亮條帶產生，條帶彌散范圍縮?。▓D1-C）。進一步使用限制性內切酶SfiI對cDNA進行酶切處理，去除短片段，獲得可用于后續建庫的cDNA（圖1-D）。

將純化后的cDNA連接至pGADT7三框載體轉化感受態細胞HST08，涂布于Amp+抗性LB培養基平板上，獲得初級文庫（圖2-A）。檢測培養基平板上生長的菌落個數，計算初級文庫庫容，得到讀碼框1、2、3文庫庫容均大于1.5×10⁶ CFU/mL。進一步對文庫中插入片段進行檢測，結果如圖2-B所示，3個讀碼框內插入片段長度分布范圍為500～2 000 bp，平均長度約為1 kbp，重組率約98%，表明初級的cDNA文庫構建完成。

進一步將3個讀碼框內的450萬單克隆混合轉化感受態細胞HST08中，涂布于LB培養基平板進行擴增并提取質粒。提取的質粒在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結果如圖3所示，在5 000 bp左右有清晰且明亮的條帶出現，符合預期大小。

2.2 pGBKT7-SlbZIP1誘餌載體構建及自激活檢測

構建誘餌質粒載體，如圖4-A所示，獲得清晰且大小為1 000 bp的條帶，符合預期大小，表明誘餌質粒構建正確。將構建正確的誘餌質粒pGBKT7-SlbZIP1轉入酵母細胞檢測自激活活性。由圖4-B可知，酵母缺陷型培養基SDO平板上有白色單克隆產生，而酵母缺陷型培養基SDO/X/A平板上無單克隆出現，這表明誘餌質粒pGBKT7-SlbZIP1不存在自激活活性。

2.3 文庫篩選

對沒有自激活活性的誘餌質粒進行文庫篩選，在添加有DDO/X/A的平板上共計篩選到藍色單克隆108個。將其進一步在QDO/X/A的培養基上進行篩選，共計篩選到藍色克隆98個（圖5-A）。陽性克隆PCR擴增后在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，結果如圖5-B所示，擴增得到500～2 000 bp大小不等的條帶，表明獲得陽性克隆。

將陽性克隆PCR產物進行測序分析，測序結果如表2所示，獲得14個候選互作蛋白，包括1個bZIP轉錄因子SlTGA2.2（NM_001309871.1）、2個谷氧還蛋白SlGRXC9（XM_010325453.3）和SlGRXC6（XM_004245039.4）、1個鈣調蛋白（XM_004230236.4）、1個羧酸脂酶（XM_004250202.4）、1個應激蛋白（XM_004237396.4）和其他蛋白。其中，bZIP轉錄因子、谷氧還蛋白被報道積極參與灰霉菌防御反應，鈣調蛋白積極參與白粉病抗性防御反應。

2.4 pGBKT7-SlbZIP1與互作蛋白酵母雙雜交驗證

為驗證SlbZIP1潛在的互作組分，從14個候選互作蛋白中選取與病原菌侵染相關的轉錄因子SlTGA2.2（NM_001309871.1）、谷氧還蛋白SlGRXC9（XM_010325453.3）和SlGRXC6（XM_004245039.4）及鈣調蛋白（XM_004230236.4）在番茄中進行同源克隆，將其連接至pGADT7載體，分別獲得pGADT7-SlTGA2.2、pGADT7-SlGRXC9、pGADT7-SlGRXC6、pGADT7-SlCaM1。與誘餌載體共同轉化于酵母菌株Y2H中，以組合pGBKT7-53和pGADT7-T為陽性對照，以組合pGBKT7-Lam和pGADT7-T為陰性對照，結果如圖6所示，SlbZIP1與SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1共轉化的酵母菌株以及陽性對照可以正常生長，菌落飽滿，且在含有X-α-gal和Aba的缺陷型培養基上變藍，表明SlbZIP1與SlGRXC9、SlGRXC6、SlTGA2.2、SlCaM1均存在互作。

3 討論

利用酵母雙雜交系統從cDNA文庫篩選與已知蛋白互作的新蛋白，從而構建蛋白互作網絡，對研究基因功能及分子機制具有重要意義^［21］。番茄灰霉侵染過程是由多因子調控的抗性反應，構建酵母文庫，通過篩選，有利于獲得與灰霉菌侵染相關的目標蛋白。因此，構建的酵母文庫的質量直接影響篩選的結果。目前，對于酵母文庫質量的評價指標主要是文庫的庫容和重組率^［22］。本研究通過對番茄葉片進行灰霉菌侵染，對侵染后的葉片采用三框法構建cDNA文庫，文庫庫容為1.5×10⁶ CFU，文庫插入片段大小在500～2 000 bp，重組率為98%。上述指標表明本研究構建的文庫符合酵母雙雜交cDNA文庫的要求^［22］，且文庫構建完整，可用于后續篩庫。

bZIP轉錄因子是真核生物中分布最廣的轉錄因子，已有研究表明該轉錄因子參與病原菌防御響應，尤其是腐生型真菌灰霉菌。其中，擬南芥中的轉錄因子TGA2、TGA5、TGA6不僅調節活體型病原菌引起的系統性獲得性抗性，而且對于腐生型病原菌的激活至關重要。tga256的缺失突變體表現灰霉感病性^［23］。bZIP轉錄因子vip1突變體及SRDX抑制株均表現為灰霉感病性^［24］。番茄中的bZIP轉錄因子在細菌和病毒侵染脅迫條件下表現出不同程度的被誘導表達，表明該類轉錄因子可能參與了調控番茄逆境脅迫條件下的防御應答反應^［25］。此外，番茄bZIP轉錄因子SlbZIP1在灰霉菌脅迫下表達上調，并且筆者在前期感病番茄Moneymaker灰霉菌侵染轉錄組測序結果中發現該基因轉錄水平的確在灰霉菌侵后升高。因此，本研究以受灰霉菌誘導表達的SlbZIP1為誘餌，篩選到了與之互作的bZIP轉錄因子、氧化還原蛋白、鈣調蛋白、膜脂蛋白等。

由誘餌SlbZIP1篩選到的小分子的氧化還原蛋白谷氧還蛋白GRX普遍參與灰霉菌防御反應，眾多研究報道了bZIP轉錄因子與谷氧還蛋白間的互作。Ruan等研究發現，木薯中的bZIP轉錄因子MeTGA074與MeGRXC15相互作用^［26］。艾蒿中分離出的bZIP轉錄因子MpTGA與谷氧還蛋白MpROXY1/2相互作用^［27］。擬南芥中的TGA2是GRX480的互作伴侶^［28］。以上眾多的證據均是通過在酵母或者植物體內直接驗證了bZIP轉錄因子與谷氧還蛋白的互作，而本研究是在番茄灰霉菌侵染下通過篩庫篩選到谷氧還蛋白，并且在酵母體內再次驗證了兩者之間的互作，表明SlbZIP1轉錄因子的確與谷氧還蛋白互作參與灰霉菌防御反應。此外，還篩選到bZIP的轉錄因子。轉錄因子極易與自身或者其他的轉錄因子形成同源或者異源二聚體共同參與防御過程^［29］。鈣調蛋白作為潛在的互作蛋白，更多的是參與活體型真菌白粉菌的防御反應^［30］，但是在酵母驗證試驗中，bZIP與鈣調蛋白也是存在較弱的互作，但這種互作并未在植物體中進行驗證，有待于后續研究。

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