基于顯微共聚焦拉曼光譜與多靶標適配體微流控技術鑒定鼻咽癌循環腫瘤細胞的方法

摘要：目的 "建立一種基于顯微共聚焦拉曼光譜技術的鼻咽癌循環腫瘤細胞鑒定方法，實現對鼻咽癌循環腫瘤細胞的無接觸、無標記檢測。方法 "體外培養人T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat和鼻咽癌細胞株Sune1，利用EpCAM、CD44、EGFR和波形蛋白適配體組裝的納米微流控芯片技術識別和親和捕獲單細胞，并使用顯微共聚焦拉曼光譜技術對單細胞進行鑒定，得到單細胞拉曼光譜。以兩種機器學習算法：支持向量機和線性判別分析構建分類器，對單細胞拉曼光譜進行建模分析。結果 "共采集得到474個Jurkat細胞與Sune1細胞的單細胞拉曼光譜，其峰位分析結果顯示：與Jurkat細胞相比，Sune1細胞中的腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤含量顯著下降（Plt;0.0001）；羥脯氨酸、蛋白質和脂類的含量顯著上升（Plt;0.0001），差異有統計學意義。線性判別分析的預測準確率較高，能夠有效區分兩種細胞，預測準確率高達98.31%。結論 "本研究基于顯微共聚焦拉曼光譜技術和機器學習算法，建立了一種可能適用于鑒定鼻咽癌循環腫瘤細胞的方法，可對鼻咽癌的臨床微創診斷產生積極作用。

關鍵詞：鼻咽癌；循環腫瘤細胞；顯微共聚焦拉曼光譜技術；微流控芯片；機器學習；分離鑒定

Identification of circulating tumour cells in nasopharyngeal carcinoma based on microconfocal Raman spectroscopy with multi-target aptamer microfluidics

WU Ziman1， 2， GUO Feifan2， WU Wei2， DOU Xiaowen2， LI Jian3， ZHANG Xiuming1， 2， XIONG Dan1， 2

1School of Medical Technology， Xinxiang Medical University， Xinxiang 453000， China; 2Department of Clinical Laboratory Medicine， the Third Affiliated Hospital of Shenzhen University， Shenzhen 518001， China; 3Department of Otolaryngology， the First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510000， China

Abstract： Objective To establish a method for the identification of nasopharyngeal carcinoma circulating tumor cells based on microconfocal Raman spectroscopy， in order to realize the non-contact and marker-free detection of nasopharyngeal carcinoma circulating tumor cells. Methods Human T lymphocytic leukemia cell line Jurkat and nasopharyngeal carcinoma cell line Sune1 were cultured in vitro， and single cells were identified and affinity captured by nanomicronic chip technology assembled by EpCAM， CD44， EGFR and vimentin aptamer. The single cells were identified by microconfocal Raman spectroscopy to obtain single cell Raman spectroscopy. Two machine learning algorithms， support vector machine and linear discriminant analysis， were used to construct a classifier to model and analyze single-cell Raman spectra. Results Single-cell Raman spectra of 474 Jurkat cells and Sune1 cells were collected. Peak location analysis results showed that the contents of adenine， thymine and guanine in Sune1 cells decreased significantly compared with Jurkat cells. The contents of hydroxyproline， protein and lipids increased significantly， and the differences were statistically significant. Linear discriminant analysis had a high prediction accuracy， which could effectively distinguish the two types of cells， and the prediction accuracy was as high as 98.31%. Conclusion Based on microconfocal Raman spectroscopy and machine learning algorithms， this study established a method that may be suitable for the identification of nasopharyngeal carcinoma circulating tumor cells， which has a positive effect on the clinical minimally invasive diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.

Keywords： nasopharyngeal carcinoma; circulating tumor cells; microconfocal raman spectroscopy; microfluidic chip; machine learning; separation and identification

鼻咽癌作為一種具有高度侵襲性和轉移性的頭頸部癌，其早期診斷對于改善患者預后至關重要［1］。鼻咽癌的發病是一個復雜的過程，EB病毒感染是其最重要的誘因。EB病毒可通過其編碼的蛋白，如LMP1等，干擾人鼻咽黏膜上皮細胞的正常功能，導致細胞無限制增殖和凋亡抑制［2］。此外，遺傳因素、環境因素、表觀遺傳學改變以及免疫微環境的失調等也共同參與了鼻咽癌的發生發展［3］。鼻咽癌的早期診斷一直是臨床難題。目前常用的診斷方法包括以鼻咽鏡為主的內鏡檢查，以CT、MRI為主的影像學檢查以及病理學檢查。然而，這些方法在早期鼻咽癌的診斷上存在一定的局限性。鼻咽鏡檢查雖然能直接觀察鼻咽部病變，但具有一定的侵入性，且對隱匿性病變的檢出能力有限。影像學檢查雖無侵入性，但對早期微小病變的敏感性不足。病理學檢查是確診的金標準，但穿刺活檢等操作具有一定侵入性［4， 5］。其他的輔助檢查如EB病毒相關抗體檢測又存在特異性不足的問題［6］。因此，開發新的、更靈敏和更具特異性的鼻咽癌早期診斷技術具有很高的臨床價值。循環腫瘤細胞（CTCs）作為一種新型的液體活檢標志物，目前已廣泛應用于肺癌、乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的早期診斷、治療監測、預后評估和耐藥性監測，在鼻咽癌早期診斷中也具有廣闊前景。相較于傳統組織活檢，CTCs檢測具有敏感度高、特異度強、可重復性好等優勢，其攜帶腫瘤的遺傳信息，可以通過無創的方式實現腫瘤的早期檢測和動態監測，有望成為鼻咽癌個體化治療的重要輔助手段［7］。顯微共聚焦拉曼光譜技術（MCRS）作為一種新型分析技術，具有非破壞性、非侵入性、空間分辨率高和準確率高等優點，能夠在無接觸、無標記的情況下對細胞進行近乎實時的檢測［7， 8］。MCRS技術已被成功應用于各種腫瘤的診斷和監測，包括乳腺癌、肺癌、結直腸癌等［9-11］。然而，目前關于MCRS技術在鼻咽癌CTCs鑒定中的應用研究尚不充分。本研究旨在解決鼻咽癌早期診斷的難題，建立一種結合顯微共聚焦拉曼光譜和多靶標適配體微流控技術的循環腫瘤細胞鑒定新方法。利用顯微共聚焦拉曼光譜，初步探索了鼻咽癌細胞系與人T淋巴細胞白血病細胞系在分子振動水平的差異，結果表明兩類細胞的拉曼光譜存在顯著差異，提示拉曼光譜技術在腫瘤細胞的非侵入性、無標記檢測方面具有潛在應用價值，現報道如下。

1 "材料與方法

1.1 "材料與試劑

生物材料：生物素修飾的核酸適配體序列如下：

EPCAM（5? to 3?， Biotin-C6 spacer

CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCA

TGGGGGGTTGGCCTG）

Vimentin （5' to 3'， Biotin?C6 spacer

CACGCATAGCCTTTGCTCCTCGTCTGGAACGTCGCAGCTTTAGTTCTGGGCCTATGCGT）

EGFR （5' to 3'， Biotin-C6 spacer

TACCAGTGCGATGCTCAGTGCCGTTTCTTCTCTTTCGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATGCTGACGCATT

CGGTTGAC）

CD44 （5? to 3?， Biotin-C6 spacer

GGGATGGATCCAAGCTTACTGGCATCTGGATTTGCGCGTGCCAGAATAAAGAGTATAACGTGTGAA

TGGGAAGCTTCGATAGGAATTCGG）。

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經HPLC純化。

1.2 " 實驗方法

1.2.1 "樣本制備 " 人類T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat在含有10% FBS（GIBCO）的RPMI1640（GIBCO）培養基中培養。鼻咽癌細胞系Sune1培養于含有5% FBS（GIBCO）的RPMI1640（GIBCO）培養基。所有細胞均在37 ℃，5%（vol/vol）CO2培養箱中生長。

3例鼻咽癌患者外周血樣本來自中山大學附屬第一醫院，獲得知情同意后，取2 mL外周血入BD真空容器EDTA-2K中。然后采用Ficoll密度梯度離心法獲得外周血的PBMC。樣品在6 h內進行處理。患者的采血點均于診斷后通過抽吸活檢采集。本研究經中山大學醫院附屬第一醫院臨床科研和實驗動物倫理委員會批準（審批號：倫審[2020]483號）。

1.2.2 "微流控技術分離與免疫熒光技術鑒定 " 用PBS將鏈霉親和素配置成1 mg/mL的溶液儲備。使用時將儲備液用PBS稀釋成10 μg/mL，滴加100 μL至五通道微流控芯片基底，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次， 37 ℃干燥。將Sune1細胞與Jurkat細胞按一定比例混合制備成模擬外周血樣本。向模擬樣本與臨床患者的PBMC細胞懸液中分別加入4 μL含10 μmol/L生物素修飾的 EPCAM、CD44、Vimentin、EGFR 溶液；37 ℃緩慢振蕩孵育1 h，800 r/min離心5 min；PBS清洗3次，加入RPMI 1640或DMEM培養基重懸至200 μL，上機檢測。基于既往研究［12］的方法，本實驗前期使用壓印技術制備了一種微通道和微室集成的可用于細胞捕獲和分選的功能化納米基底微流控芯片裝置。該芯片裝置以渦流區域結合納米結構基底，利用梯度剪切力對CTCs選擇性富集。使用鏈霉親和素修飾芯片表面，將懸浮PBMC溶液以0.5 mL/h的流速注入組裝芯片的微流控系統中；使用RPMI 1640清洗芯片，90%的甲醇固定細胞；分選后，用PBS清洗芯片，進行免疫熒光染色。熒光抗體CD45（555 nm）、EpCAM（651 nm）、PCK（488 nm）、Vimentin（647 nm）染色標記，DAPI染色鑒定細胞核。CD45（-）EpCAM（+）DAPI（+）可以鑒定為 CTCs陽性。

1.2.3 "顯微共聚焦拉曼光譜技術檢測 " 經過多靶標適配體納米芯片微流控技術分選后，對Jurkat和Sune1細胞系進行了單細胞拉曼光譜分析。將Jurkat和Sune1細胞系消化成單細胞，PBS洗滌1次，4%（vol/vol）多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次。采用顯微共聚焦拉曼光譜儀（WitecA300）獲得樣品的單細胞拉曼光譜（100×物鏡，激光功率：20～21 mW）。測量前，用硅片對光譜儀進行校準，使其拉曼峰位于520.73 cm-1處。將Jurkat細胞株和Sune1細胞株置于60倍水鏡進行檢測。光譜范圍280～2187 cm-1，用1200個凹槽/mm的衍射光柵在10 s積分時間內記錄光譜。利用顯微共聚焦拉曼光譜儀，從每個細胞的頂部、底部、左側、右側和中間等5個位置采集了至少5個光譜點。Jurkat細胞采集71個細胞，采集285個光譜；Sune1采集48個細胞，采集189個光譜，共采集474個光譜。差異波數及對應的生物分子結構類型（表1），實驗流程（圖1）。

1.3 "統計學分析

本研究使用labspec-6軟件對Jurkat細胞系和Sune1細胞系的單細胞拉曼光譜進行去背景和矢量歸一化處理。根據拉曼光譜分離不同的組別，采用線性判別分析（LDA），對三維或二維拉曼光譜進行可視化處理。通過計算相應的拉曼帶的強度，對細胞內的生物分子進行半定量，兩組間差異的比較采用t檢驗。為了建立能夠區分Jurkat細胞和Sune1細胞的預測模型，首先對兩種細胞的單細胞拉曼光譜數據進行分類。隨后，分別隨機抽取75%的數據作為訓練集，剩余的25%作為測試集?；谟柧毤?，構建預測模型，并利用測試集對模型的性能進行評估。首先，采用主成分分析（PCA）對高維數據進行降維。通過PCA，將每個單細胞的拉曼光譜特征轉化為不相關的、能夠最大程度解釋數據方差的前100個主成分。隨后，分別利用LDA和支持向量機（SVM）兩種分類算法，對降維后的數據進行分類。為找到最適合區分Jurkat細胞和Sune1細胞的分類器，比較兩種模型在測試集上的分類性能。采用二進制分類的混淆矩陣，計算敏感度、特異度和總體準確性，計算公式：敏感度=真陽性數量/（真陽性數量+假陰性數量），特異度=真陰性數量/（真陰性數量+假陽性數量），總體準確性=（真陰性數量+真陽性數量）/（假陰性數量+真陽性數量+真陰性數量+假陽性數量）。

2 "結果

2.1 "微流控技術與免疫熒光技術分離鑒定

Jurkat細胞和Sunel細胞混合樣本經多靶標適配體納米芯片微流控技術分離后，免疫熒光染色（采用CD45和PCK抗體）結果顯示：分離后的Jurkat細胞核周出現CD45強陽性熒光，而Sune1細胞胞漿出現PCK強陽性熒光，該裝置能高效、準確地分離兩種細胞（圖2）。

使用上述裝置對3例鼻咽癌患者的外周血樣本進行了處理，成功分離并富集到了鼻咽癌CTCs。免疫熒光染色結果顯示：NPC-001樣本中檢測到5個上皮型CTCs；NPC-002樣本中檢測到3個上皮型和1個間質型CTCs；NPC-003樣本中檢測到1個混合型CTCs（圖3）。

2.2 "機器學習對兩種細胞系的光譜數據結構分析

對474個單細胞拉曼光譜數據進行PCA降維分析的結果表明，Jurkat組和Sune1組在降維后的特征空間中呈現出明顯的聚類趨勢，兩種細胞類型在拉曼光譜特征上存在顯著差異，具有較好的區分度（圖4）。利用SVM和LDA機器學習算法構建的分類模型結果顯示，LDA模型在分類Jurkat細胞和Sune1細胞時表現卓越，預測準確率達到98.31%?；煜仃囷@示，僅有1個Jurkat細胞被誤分類為Sune1細胞，而所有Sune1細胞均被正確分類（表2）。SVM模型雖然也取得了較高的準確率，但LDA模型在對兩類細胞的分類上表現更為出色，基于拉曼光譜的LDA模型能夠對Jurkat細胞和Sune1細胞進行高度準確、特異性的分類。

2.3 "Jurkat細胞系和Sune1細胞系的拉曼光譜及潛在光譜生物標志物差異分析

對Jurkat細胞和Sune1細胞的單細胞拉曼光譜采集的光譜信號進行去背景及歸一化處理后，對兩種細胞系進行分析，兩種細胞系其生物振動分布于300～1800 cm-1（圖5A）。與Jurkat細胞相比，差異顯著的波數為730、752、784、830、853、876、957、1003、1030、1094、1126、1340、1375、1446、1487、1576、1655 cm-1。通過半定量的方式來評估Sune1細胞的差異，與Jurkat細胞相比，Sune1細胞在730、752、784、830、1094、1340、1375、1487和1576 cm-1的光譜強度相對降低，其最顯著差異在于730、1375和784 cm-1光譜峰（圖5B～D）。同樣，與Jurkat細胞相比，Sune1細胞在853、876、957、1003、1030、1126、1446、1655 cm-1光譜峰強度相對增高，其中最顯著差異在1446、876和1655 cm-1 光譜峰（圖5E～G）。Jurkat細胞和Sune1細胞差異有統計學意義的拉曼光譜特征峰所對應的生物分子結構及其生物學意義（表3）。

3 "討論

鼻咽癌是一種好發于鼻咽部上皮組織的惡性腫瘤，早期癥狀不典型，多數患者確診時已處于中晚期。CTCs作為腫瘤早期診斷和預后評估的重要生物標物，在多種腫瘤中受到廣泛關注［13-14］。相較于傳統的影像學檢查，CTCs檢測具有更早診斷的潛力。鼻咽癌患者的循環腫瘤細胞中通常表達EpCAM和CD44等標志物，其中，EpCAM是目前臨床鼻咽癌CTCs捕獲常用的靶標之一［15-16］。本研究初步建立了一種基于多靶標適配體微流控芯片和顯微共聚焦拉曼光譜的鼻咽癌CTCs檢測方法。利用EpCAM和CD44以及EGFR和波形蛋白4種核酸適配體構建的微流控芯片，實現了對鼻咽癌CTCs的高效捕獲。隨后，通過共聚焦拉曼光譜技術結合LDA，對捕獲的鼻咽癌CTCs進行高特異性鑒定。本研究的無損檢測技術，為后續的細胞培養、基因組學、蛋白質組學等下游分析提供了高質量的樣本，有助于深入研究腫瘤的發生發展機制，為腫瘤的精準治療提供新的思路。

本研究通過單細胞拉曼光譜強度半定量地顯示細胞內蛋白質、核酸、脂質等的差異來區分模擬外周血中的鼻咽癌細胞和人T淋巴細胞白血病細胞。單細胞拉曼光譜不僅可以區分癌細胞和人T淋巴細胞白血病細胞，還可以用于識別不同的癌細胞系［17］。核酸、蛋白質和脂質是真核細胞的重要組成物，真核細胞含有共同光譜特征，例如大約1256 cm-1和1600 cm-1的峰表示酰胺 I 波段。芳香族氨基酸出現在1002 cm-1（苯丙氨酸）和656 cm-1（酪氨酸）附近。核酸的振動模式存在于789 cm-1和1090 cm-1［18］。與此同時，各組分條帶的相對強度也可以分類出兩類細胞的不同。本研究結果顯示，Jurkat細胞系在730、1375、784 cm-1處的拉曼光譜峰值高于Sune1細胞系，這三處峰值分別來自細胞的腺嘌呤的對稱呼吸模式、脂質中的 CH2 彎曲振動和鳥嘌呤的呼吸模式［19-21］。據報道，Jurkat細胞是一種常用于癌癥研究的人T淋巴細胞，730 cm-1、1375 cm-1和784 cm-1 處的拉曼峰是 Jurkat 細胞拉曼光譜中的突出特征［22］。當Jurkat細胞經歷活化和凋亡時這些峰值的強度能夠反映其生化組成和代謝狀態的改變。本研究發現，Sune1細胞系在1446 cm-1、876 cm-1和1655 cm-1處的拉曼光譜峰值高于Jurkat細胞系。與Jurkat細胞相比鼻咽癌的脂質成分可能發生變化，例如飽和脂肪酸水平升高，多不飽和脂肪酸水平降低，因此1446 cm-1峰的強度增加，通常與細胞膜中的脂質 CH2 彎曲振動有關［23］。癌細胞通常表現出與正常細胞不同的糖基化模式，碳水化合物骨架振動或特定氨基酸的環振動，可能會導致Sune1 細胞中876 cm-1峰的強度增加［24］。據報道，鼻咽癌細胞可能具有與正常細胞不同的蛋白質表達譜，導致α螺旋蛋白含量增加［25］。由于1655 cm-1峰值與蛋白質肽骨架中的 C=O 伸展振動有關，特別是α螺旋結構，這就可能導致Sune1細胞在該峰的強度增加。因此，顯微共聚焦拉曼光譜技術在鼻咽癌細胞鑒定方面展現出廣闊的應用前景。通過建立更完善的譜庫和分析模型，并結合其他組學數據，有望實現對鼻咽癌細胞的精準分類和早期診斷。本研究發現，鼻咽癌細胞與人T淋巴細胞白血病細胞在核酸、蛋白質和脂質等生物分子組成上存在顯著差異，這些差異反映了腫瘤細胞獨特的生物學特征，如DNA損傷修復機制異常、蛋白質折疊異常和細胞代謝改變。通過分析拉曼光譜特征峰，可以深入了解鼻咽癌細胞的代謝通路，為鼻咽癌的早期診斷、腫瘤分型、藥物篩選和耐藥機制研究提供新的思路［26］。

本研究測試了SVM和LDA兩種常用的機器學習的方法構建分類器。實驗結果表明，在我們的數據集上，LDA算法的分類準確率達到了98.31%，顯著優于SVM算法。由于本研究的數據呈現出較強的線性可分性，LDA能夠有效地找到數據的最佳投影方向，從而實現準確分類。LDA算法的計算效率高，適用于大規模數據集的分析。相比之下，SVM算法在處理非線性數據方面具有優勢，但在我們的線性可分數據集上，其性能受到了限制。 此外，SVM算法對參數的敏感性較高，需要進行細致的調優。綜上所述，在本實驗中，LDA算法展現出了更好的性能。

本研究初步驗證了顯微共聚焦拉曼光譜技術能夠根據鼻咽癌CTCs獨特的拉曼光譜特征，高靈敏性和特異性地將鼻咽癌細胞株Sune1與Jurkat細胞。顯微共聚焦拉曼光譜技術結合多靶標適配體微流控芯片，為CTCs的檢測提供了一種高效、特異且無損的新方法。本研究通過比較鼻咽癌CTCs與Jurkat細胞的拉曼光譜，發現兩者在核酸、蛋白質和脂質等生物分子組成上存在顯著差異。揭示其獨特的分子特征和代謝狀態等信息，從而實現對鼻咽癌CTCs的高靈敏度和高特異度檢測。與傳統的CTCs檢測方法相比，本方法具有無標記、無損、高通量、多參數分析等優勢［27］。此外，結合機器學習算法，如LDA，可以進一步提高檢測的準確性。本研究不僅為鼻咽癌的早期診斷提供了新的技術手段。本研究分別捕獲了Jurkat細胞和Sune1細胞的單個光譜峰，下一步將模擬人體血細胞的形式進行比例混合檢測，尋找上皮細胞和淋巴細胞的拉曼差異光譜峰，實現CTCs的鑒定；進一步收集臨床患者的標本，結合顯微共聚焦拉曼光譜技術和算法實現單細胞拉曼光譜鑒定循環腫瘤細胞的目的，以期建立基于多靶標適配體微流控技術與顯微共聚焦拉曼光譜技術一體化的分離及鑒定CTCs的平臺，從而實現對臨床患者CTCs的檢測，為患者的早期診斷、伴隨診斷等提供平臺支撐。非破壞性、非侵入性的CTCs識別鑒定技術則能夠使CTCs保持較高的細胞活力、真實樣本的檢出率以及捕獲的CTCs的數量等，有利于對CTCs進行下游的實驗。CTCs的下游分析有助于識別與治療相關的特定分子靶點，擴展對侵襲、遷移和免疫監視相關基本分子通路的理解，識別更具侵襲性的腫瘤細胞，促進個體化治療的發展。

參考文獻：

［1］ " "薛 "飛， 張 "婷， 王 "銳， 等. 鼻咽癌的臨床特征及診斷治療進展［J］. "醫學研究生學報， 2022， 35（11）： 1213-8.

［2］ " Bruce JP， To KF， Lui VWY， et al. Whole?genome profiling of nasopharyngeal carcinoma reveals viral?host co?operation in inflammatory NF?κB activation and immune escape［J］. "Nat Commun， 2021， 12（1）： 4193.

［3］ " Chen YP， Chan ATC， Le QT， et al. Nasopharyngeal carcinoma［J］. "Lancet， 2019， 394（10192）： 64-80.

［4］ " Juarez?Vignon Whaley JJ， Afkhami M， Onyshchenko M， et al. Recurrent/metastatic nasopharyngeal carcinoma treatment from present to future： where are we and where are we heading？［J］. "Curr Treat Options Oncol， 2023， 24（9）： 1138-66.

［5］ " Zhang YM， Gong GZ， Qiu QT， et al. Radiomics for diagnosis and radiotherapy of nasopharyngeal carcinoma［J］. "Front Oncol， 2021， 11： 767134.

［6］ " Liu WX， Chen G， Gong X， et al. The diagnostic value of EBV-DNA and EBV?related antibodies detection for nasopharyngeal carcinoma： a meta-analysis［J］. "Cancer Cell Int， 2021， 21（1）： 164.

［7］ "Wang HP， Ma HZ， Fang PP， et al. Dynamic confocal Raman spectroscopy of flowing blood in bionic blood vessel［J］. "Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc， 2021， 259： 119890.

［8］ "Gomes da Costa S， Richter A， Schmidt U， et al. Confocal Raman microscopy in life sciences［J］. "Morphologie， 2019， 103（341）： 11-6.

［9］ "Hanna K， Krzoska E， Shaaban AM， et al. Raman spectroscopy： current applications in breast cancer diagnosis， challenges and future prospects［J］. "Br J Cancer， 2022， 126： 1125-39.

［10］Kanmalar M， Abdul Sani SF， Kamri NINB， et al. Raman spectroscopy biochemical characterisation of bladder cancer cisplatin resistance regulated by FDFT1： a review［J］. "Cell Mol Biol Lett， 2022， 27（1）： 9.

［11］ Auner GW， Koya SK， Huang CH， et al. Applications of Raman spectroscopy in cancer diagnosis［J］. "Cancer Metastasis Rev， 2018， 37（4）： 691-717.

［12］ Li M， Liu D， Zhang J， et al. Aptamer-cocktail functionalized nano-microfluidic chip for enhancing isolation and characterization of circulating cancer cells［J］. "Anticancer Res， 2022， 42（9）： 4345-58.

［13］ Alix-Panabières C， Pantel K. Challenges in circulating tumour cell research［J］. "Nat Rev Cancer， 2014， 14（9）： 623-31.

［14］ Lin DF， Shen LS， Luo M， et al. Circulating tumor cells： biology and clinical significance［J］. "Signal Transduct Target Ther， 2021， 6（1）： 404.

［15］ Fagotto F， Aslemarz A. EpCAM cellular functions in adhesion and migration， and potential impact on invasion： a critical review［J］. "Biochim Biophys Acta Rev Cancer， 2020， 1874（2）： 188436.

［16］ Chen C， Zhao SJ， Karnad A， et al. The biology and role of CD44 in cancer progression： therapeutic implications［J］. "J Hematol Oncol， 2018， 11（1）： 64.

［17］ Lin J， Zheng JP， Wu AG. An efficient strategy for circulating tumor cell detection： surface-enhanced Raman spectroscopy［J］. "J Mater Chem B， 2020， 8（16）： 3316-26.

［18］Noorani L， Stenzel M， Liang R， et al. Albumin nanoparticles increase the anticancer efficacy of albendazole in ovarian cancer xenograft model［J］. "J Nanobiotechnology， 2015， 13： 25.

［19］ Huang HM， Li SS， Tang QL， et al. Metabolic reprogramming and immune evasion in nasopharyngeal carcinoma［J］. "Front Immunol， 2021， 12： 680955.

［20］ Sobanski T， Rose M， Suraweera A， et al. Cell metabolism and DNA repair pathways： implications for cancer therapy［J］. "Front Cell Dev Biol， 2021， 9： 633305.

［21］ Lieu EL， Nguyen T， Rhyne S， et al. Amino acids in cancer［J］. "Exp Mol Med， 2020， 52： 15-30.

［22］Tang P， Cheng WD， He XM， et al. Raman spectrum spectral imaging revealing the molecular mechanism of Berberine-induced Jurkat cell apoptosis and the receptor-mediated Berberine delivery system［J］. "Biomed Opt Express， 2019， 10（4）： 1581-600.

［23］ Zheng SX， Matskova L， Zhou XY， et al. Downregulation of adipose triglyceride lipase by EB viral?encoded LMP2A links lipid accumulation to increased migration in nasopharyngeal carcinoma［J］. "Mol Oncol， 2020， 14（12）： 3234-52.

［24］Kopec M， Imiela A， Abramczyk H. Monitoring glycosylation metabolism in brain and breast cancer by Raman imaging［J］. "Sci Rep， 2019， 9（1）： 166.

［25］ Li SX， Chen QY， Zhang YJ， et al. Detection of nasopharyngeal cancer using confocal Raman spectroscopy and genetic algorithm technique［J］. "J Biomed Opt， 2012， 17（12）： 125003.

［26］Xu JB， Chen DY， Wu W， et al. A metabolic map and artificial intelligence-aided identification of nasopharyngeal carcinoma via a single-cell Raman platform［J］. "Br J Cancer， 2024， 130（10）： 1635-46.

［27］ Smit DJ， Pantel K. Circulating tumor cells as liquid biopsy markers in cancer patients［J］. "Mol Aspects Med， 2024， 96： 101258.

（編輯：郎 "朗）