腦膠質瘤PSMA5的表達、功能及臨床意義

【摘要】 目的 研究蛋白酶體Alpha-5亞單位（PSMA5）在腦膠質瘤中的表達情況、功能及臨床意義。方法 利用獲取自癌癥基因組圖譜（TCGA）和中國腦膠質瘤基因組圖譜（CGGA）的膠質瘤樣本信息，通過生物信息學方法分析PSMA5的表達情況。利用DESeq2 R程序包篩選出差異表達基因（DEGs），并通過基因本體論（GO）和基因集富集分析（GSEA）進行功能富集分析。利用單因素和多因素Cox回歸分析和Kaplan-Meier法評估PSMA5對患者預后的影響。利用SiRNA敲低PSMA5的表達以探究其對膠質瘤細胞生長的影響。結果 PSMA5在膠質瘤患者中呈高表達（Plt;0.05），且在高級別膠質瘤及異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）野生型膠質瘤患者中有更高的表達水平（Plt;0.05）。GO和GSEA分析結果顯示，PSMA5與免疫反應、有絲分裂等密切相關。Cox分析的結果表明，PSMA5的高表達是膠質瘤的一個顯著獨立預后因素（CGGA：Plt;0.01，TCGA：P=0.032）；Kaplan-Meier法結果表明，PSMA5高表達組的患者生存期明顯少于低表達組（Plt;0.001）。敲低PSMA5后，膠質瘤細胞增殖受抑制，誘發細胞周期停滯。結論 PSMA5的高表達水平會導致患者的不良預后，PSMA5可以作為膠質瘤患者預后的預測因素。此外，PSMA5還有作為治療膠質瘤的生物靶點的潛在作用。

【關鍵詞】 蛋白酶體Alpha-5亞單位；神經膠質瘤；基因表達；預后；PSMA5

【中圖分類號】 R739.41" 【文獻標志碼】 A" 【文章編號】 1672-7770（2024）06-0629-07

Expression， function and clinical significance of PSMA5 in glioma LI Nanding， JIA Bo， WANG Zan， LI Chengcai， WANG Jiwei， GUI Yufan， LIU Wei. Department of Neurosurgery， The First Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000， China

Corresponding author： LIU Wei

Abstract： Objective To study the expression， function and clinical significance of Proteasome Subunit Alpha Type-5（PSMA5） in glioma. Methods The expression of PSMA5 with the glioma sample information obtained from The Cancer Genome Atlas（TCGA） and Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA） were analyzed by using bioinformatics methods. Differentially expressed genes（DEGs） were screened by using the DESeq2 R package， and functional enrichment analysis was performed by using Gene Ontology（GO） and Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）. Univariate and multivariate Cox regression analysis and Kaplan-Meier method were used to evaluate the impact of PSMA5 on patient prognosis. SiRNA was used to knock down the expression of PSMA5 to explore its effect on the growth of glioma cells. Results PSMA5 was highly expressed in glioma patients（Plt;0.05）， and had a higher expression level in patients with high-grade glioma and isocitrate dehydrogenase 1（IDH1） wild-type glioma（Plt;0.05）. GO and GSEA analysis results showed that PSMA5 was closely related to immune response， mitosis， etc. The results of Cox analysis showed that high expression of PSMA5 was a significant independent prognostic factor for glioma（CGGA：Plt;0.01，TCGA：P=0.032）. The results of the Kaplan-Meier method showed that the survival time of patients in the PSMA5 high expression group was significantly shorter than that in the low expression group（Plt;0.001）. After knocking down PSMA5， glioma cell proliferation was inhibited and cell cycle arrest was induced. Conclusions High expression levels of PSMA5 will" lead to poor prognosis in patients. PSMA5 can be used as a predictive factor for the prognosis of glioma patients. In addition， PSMA5 has the potential to serve as a biological target for the treatment of glioma.

Key words： proteasome subunit alpha type-5; glioma; gene expression; prognosis; PSMA5

腦膠質瘤是最常見的原發性惡性腦腫瘤類型，預后不良且生存率低^［1］。為了更準確地定義不同的膠質瘤實體，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）2016年修訂了彌漫性膠質瘤的分類：低級別膠質瘤（low-grade glioma，LGG，Ⅱ和Ⅲ級），膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM，Ⅳ級）；腫瘤進一步根據是否存在異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）變異和1p/19q編碼進行分類，GBM作為其中最具侵襲性的腦癌類型，占新診斷病例的一半左右^［23］。盡管多年來廣大醫務人員對腦膠質瘤治療措施不斷進行開發和研究，但治療手段仍局限于外科手術和放化療等方式，更為行之有效的治療方法依然未被發現^［4］。由于腫瘤界限不清，且存在耐化療和耐放射的腫瘤干細胞等原因，往往導致其預后不良^［5］。膠質瘤患者的中位生存期僅為12～14個月^［67］。因此，尋找新的治療方式勢在必行。

泛素-蛋白酶體途徑是細胞內蛋白質降解的主要機制，負責降解超過80%的細胞蛋白質^［89］。在高等真核生物中，蛋白酶體作為該系統的核心部分，分布于細胞核和細胞質中。這一關鍵的蛋白分解過程主要依賴于26S蛋白酶體，而26S蛋白酶體是由2個19S和1個20S亞單位組成的桶狀結構^［10］。20S蛋白酶體的核心復合體包含PSMA5，它在與19S調節復合體的互動中扮演著關鍵角色^［11］。蛋白酶體能夠催化已經被泛素標記的蛋白質迅速降解，因此，蛋白酶體抑制劑作為腫瘤抑制因子和負生長調節劑在哺乳動物細胞增殖中起著至關重要的作用^［12］。研究表明，這種作用與多種癌癥的發生有關，PSMA5在肺神經內分泌腫瘤中的表達水平顯著高于正常組織，并且前列腺癌的發生與PSMA5的上調表達也有關聯^［1314］。由于泛素-蛋白酶體系統在細胞周期調控、細胞凋亡以及蛋白質降解等方面的關鍵作用，它已成為腫瘤治療的一個重要靶點。然而，目前對PSMA5在膠質瘤中的臨床意義和生物學作用知之甚少，本研究利用生物信息學方法，探索PSMA5的在膠質瘤中的表達模式以及患者預后的影響，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 本研究使用了來自UCSC數據庫（https：//xenabrowser.net/）的泛癌數據集，以及癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和中國腦膠質瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）數據庫中獲取的膠質瘤樣本來進行分析。經過篩選分析，從TCGA數據庫中納入了690例患者，其中男性394例，女性296例；WHO分級Ⅱ級257例，Ⅲ級266例，Ⅳ級167例。CGGA數據庫中共納入306例患者，其中男性189例，女性117例；WHO分級Ⅱ級97例，Ⅲ級74例，Ⅳ級135例。本研究還根據兩數據庫中PSMA5表達水平的中位數，將樣本分為高表達與低表達兩組，即表達水平大于中位數為高表達組，反之則為低表達組，TCGA數據庫中每組各有345例，CGGA數據庫中每組各有153例 。

1.2 功能富集分析 本研究使用R軟件（4.3.3版）中的DESeq2包對高表達組和低表達組的基因表達譜進行了比較分析，以確定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。從中挑選了logFCgt;1和padjlt;0.05的DEG數據來進行功能富集分析。為了明確PSMA5高表達和低表達組之間的功能和途徑差異，本研究使用ClusterProfiler（3.14.3版）進行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。使用BioGRID（https：//thebiogrid.org）的網絡模塊（4.3版本）作為分析工具。

1.3 細胞培養與轉染 U251人腦膠質瘤細胞系（美國模式培養物集存庫ATCC），置于含10%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的DMEM培養基（美國賽默飛公司）中培養，培養環境為37 ℃，5% CO2的潮濕孵箱，每3 d當細胞密度達到80%時傳代一次。使用靶向PSMA5（si-PSMA5）（5′-GGUGGUGAACCGAGUGUUU-3′）對U251細胞系進行轉染，陰性對照為不經轉染的U251細胞系。

1.4 細胞增殖實驗 依據廠商提供的說明，使用CCK-8試劑盒評估細胞增殖。在96孔板中培養兩組細胞各2 000個，孵育24、48、72、96 h后，分別在450 nm處檢測吸光度以評估結果。

1.5 細胞周期分析 將si-Control或si-PSMA5導入細胞轉染24 h后，收集細胞，按照廠家說明將細胞處理后置于流式細胞儀中，分析處于細胞周期各個時相的細胞百分比。

1.6 Western Blot分析 使用Western Blot評估蛋白質的表達情況，采用標準操作流程。用于該實驗的一抗有PSMA5（cat. no. 31384-1-AP; 1∶1，500 dilution;Proteintech）、CDK1（cat. no. 65182-1-Ig;1∶1 000 dilution; Proteintech）、CDK2（cat. no. 83635-4-RR;1∶10 000 dilution;Proteintech）和GAPDH（cat.no.60004-1-Ig;1∶200 000 dilution;Proteintech），購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.7 免疫組織化學染色 使用免疫組織化學染色方法評估PSMA5在膠質瘤組織中的表達水平。收集河北醫科大學第一醫院2023年1月—2024年1月手術切除、經病理確診的15例腦膠質瘤標本；正常腦組織取自同期因腦外傷或自發性顱內出血而行開顱手術的患者共5例。本研究已獲得河北醫科大學第一醫院人體研究倫理委員會批準（批準號：No.20221107）。染色使用標準操作流程，PSMA5一抗為Western Blot中使用的同種一抗，購自武漢三鷹生物技術有限公司。在對染色結果進行評價時，選用了免疫反應評分法。

1.8 統計學分析 使用R軟件（4.3.3版）進行統計分析。驗證PSMA5表達水平時，兩組間的比較方法本研究選用t檢驗，在多組間采用單因素方差分析。評估患者預后情況時，本研究使用R軟件包survival，整合生存時間、生存狀態和基因表達數據。利用Cox分析評估每個因素的預后顯著性，對于單因素Cox分析中Pgt;0.2的因素，不予納入多因素Cox分析。數據以三個獨立實驗的均值±標準差（x-±s）呈現。以Plt;0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 PSMA5在泛癌和膠質瘤中的表達情況 從UCSC數據庫中獲得的泛癌RNA-seq數據顯示，與正常組織相比，PSMA5在28種癌癥類型中顯著上調，包括LGG和GBM（圖1A）。為了驗證PSMA5的高表達在膠質瘤中的情況，本研究又使用了免疫組化分析方法對PSMA5在正常腦組織和膠質瘤組織中的表達情況進行分析（圖1B、C），結果表明，PSMA5在膠質瘤組織中的表達高于正常腦組織。本研究依據WHO分級以及IDH突變狀態，以TCGA和CGGA數據庫分別作為數據來源，對PSMA5的表達情況做了進一步探究。對兩數據庫樣本的研究結果均提示PSMA5在高級別腦膠質瘤和IDH1野生型中高表達（圖2），差異有統計學意義（Plt;0.05）。

2.2 PSMA5的功能富集分析結果 為探究PSMA5對細胞功能的影響，本研究對PSMA5高表達組和低表達組之間的差異進行了分析。從CGGA數據庫中篩選出276個DEGs，有95個是PSMA高表達組上調的基因，有181個是PSMA低表達組下調的基因（篩選條件是|logFC|gt;1.0，Plt;0.05，圖3A）。從TCGA數據集獲得2 263個DEG，其中1 089個是PSMA5高表達組上調的基因，1 174個是PSMA5低表達組下調的基因（篩選條件是|logFC|gt;1.0，Plt;0.05，圖3B）。本研究取了兩數據庫中上調水平最高的20個基因和下調最嚴重的20個基因繪制了熱圖（圖3C、D）。本研究還通過基因本體論（Gene Ontology，GO）和GSEA對PSMA5進行分析，以確定其生物學功能。GO分析顯示，高水平的PSMA5與有絲分裂姐妹染色單體分離、B細胞介導的免疫、獲得性免疫反應和體液免疫反應等密切相關 （圖4A、B）。GSEA顯示，在CGGA和TCGA數據庫中，高水平的PSMA5與G2M檢驗點、上皮-間充質轉化、E2F靶點和NFKB介導的TNF信號傳遞呈正相關（圖4C、D） 。

2.3 PSMA5表達水平與患者預后關系 采用Kaplan-Meier生存曲線分析PSMA5表達與生存期的關系，兩個數據庫中PSMA5高表達組的患者生存期均明顯少于低表達組（Plt;0.001），見圖5。對獨立危險因素進行單因素和多因素Cox回歸分析，根據CGGA和TCGA數據集（表1、表2），PSMA5的表達水平（Plt;0.001）、年齡（Plt;0.001）、腫瘤分級（Plt;0.001）和IDH1狀態（Plt;0.001）被確定為膠質瘤的獨立危險因素。在多因素回歸分析中，PSMA5的高表達仍是一個顯著的獨立預后因素（CGGA：Plt;0.001，TCGA：P=0.032，表1和表2） 。以上分析結果顯示，PSMA5的表達水平與患者預后狀況呈顯著的負相關關系。

2.4 PSMA5與細胞周期的關系 在研究中本研究發現，PSMA5與CDK1和CDK2之間存在緊密的聯系（圖6A、B），通過BioGRID查詢，本研究發現CDK1和CDK2這兩種蛋白質主要在細胞周期調節、有絲分裂調節、腫瘤發生等進程發揮作用（圖6C）。為了進一步驗證這種聯系，本研究通過SiRNA敲低了PSMA5的表達。Western Blot試驗結果證明了，在敲低PSMA5后，CDK1和CDK2的表達量出現了顯著的下降（圖7A）。本研究使用CCK-8試劑盒來評估細胞增殖，發現敲低PSMA5后，U251細胞的增殖能力被抑制（圖7B）。通過流式細胞儀對細胞周期進行分析后，本研究發現，與對照組相比，敲低PSMA5后，停滯在G2/M期的細胞數量變多（圖7C），即敲低PSMA5誘導了細胞周期的停滯。綜上所述，本研究認為，敲低PSMA5后，膠質瘤細胞增殖受抑制，誘發細胞周期停滯。

3 討 論

泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）是細胞內蛋白質降解的關鍵途徑，對于調控眾多細胞活動至關重要^［9］。它是蛋白質在人體內被降解的主要方式之一，涉及四個主要步驟：底物的泛素化、識別、分解以及分解產物的再循環^［15］。UPS激活是腫瘤生長的一個重要環節，故而抑制蛋白酶體的活動成為一種抗腫瘤治療的方向。

26S蛋白酶體作為UPS的重要組成部分，主要負責清除細胞內不必要或折疊不正確的轉錄因子或酶，以維持內環境的穩定^［16］。PSMA5作為26S蛋白酶體的重要成分，它的異常表達會導致蛋白質的異常降解，這種異常可導致生理紊亂，進而引起腫瘤等疾病。既往研究表明，蛋白酶體的活性在多種腫瘤細胞中都存在異常升高^［1314］。目前，PSMA5在不同類型的癌癥中的表達情況以及其潛在的預后意義尚未得到證實，為了探究PSMA5的作用，本研究使用來自UCSC數據庫中的數據進行分析，結果顯示，PSMA5在28種類型的腫瘤組織中高表達，表明了PSMA5可能是一種癌基因。本研究證實了PSMA5在CGGA和TCGA數據庫中的膠質瘤樣本中存在過表達，且PSMA5在高級別腦膠質瘤和IDH1野生型中表達水平更高，這可能對膠質瘤的研究與治療起到一定的指導作用。

本研究對PSMA5進行了功能富集分析，篩選出來與PSMA5表達水平降低或升高可能有關聯的20個基因，通過GO和GSEA發現了PSMA5與細胞有絲分裂、機體免疫反應之間的潛在關聯。通過細胞實驗，本研究發現了PSMA5經CDK1與CDK2通路誘導細胞周期變化、改變細胞增殖速率。這些發現揭示了PSMA5在膠質瘤發生發展過程中的機制與作用，這能為進一步的研究提供一些幫助。

既往的研究表明，隨著膠質瘤患者腫瘤級別的增長和年齡的升高，患者的預后也在逐漸變差^［17］。在此基礎上，本研究通過Cox回歸分析和Kaplan-Meier法，分析PSMA5表達水平與患者預后的關系。Cox分析的結果表明，PSMA5的高表達是膠質瘤的一個顯著的獨立預后因素；Kaplan-Meier法結果表明，PSMA5高表達組的患者生存期明顯少于低表達組；本研究認為，PSMA5的表達水平與患者預后狀況呈明顯的負相關關系。

PSMA5作為蛋白酶體的重要組成結構，其表達量與蛋白酶體活性息息相關。目前，針對蛋白酶體異常而開發出的蛋白酶體抑制劑主要有兩代，第一代以Bortezomib為代表，第二代以Marizomib為代表^［18］。一代的Bortezomib在治療骨髓瘤上已經取得了一定的進展^［19］，其對其他腫瘤的應用研究也正在進行之中。遺憾的是，Bortezomib對血腦屏障的穿透力較弱，對于腦膠質瘤的作用不便評價。二代的Marizomib對血腦屏障的穿透力有所進步^［20］，在2015年被美國食品藥品監督管理局批準為治療惡性膠質瘤的孤兒藥。值得注意的是，先前的研究^［13］已經證實，PSMA5在前列腺癌組織和細胞中存在過表達，沉默PSMA5后，前列腺癌細胞增殖受到了抑制并發生凋亡，對于一些Bortezomib耐藥的前列腺癌患者，抑制PSMA5可以減緩這種耐藥作用。基于PSMA5對于前列腺癌的這種作用，本研究推測抑制PSMA5可能會增強膠質瘤患者對蛋白酶體抑制劑治療的敏感性。

本研究的研究還存在一些不足，應在未來通過更多的細胞系實驗乃至體內實驗進行更為詳細深入的研究，以驗證本研究的結論，此外，對于膠質瘤患者的蛋白酶體抑制劑治療方面，本文的研究還很初步。盡管存在缺點，但本研究的研究清楚地提供了證據，表明PSMA5在膠質瘤組織和細胞中過度表達，導致膠質瘤患者預后不良；揭示了PSMA5對膠質瘤的作用及其相關的機制，提示其作為治療膠質瘤的生物靶點具有潛在的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李南丁負責起草文章、查閱文獻及分析、解釋數據；賈博、劉偉負責統計分析，獲取研究經費，行政、技術或材料支持、指導；王贊、李成才、桂宇凡負責查閱文獻和論文數據采集、分析、解釋數據；王冀偉負責課題監管與指導、文章的審閱及修訂。

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基金項目：河北省自然科學基金基礎研究項目（H2023206403）；河北省衛生健康委醫學科學研究課題計劃項目（20221385）

通信作者：劉偉