MALDI-TOF MS負離子模式下快速鑒別腸桿菌目細菌多黏菌素耐藥機制的研究

摘要：目的 探究徐州地區多黏菌素耐藥的腸桿菌目細菌主要耐藥機制及其快速檢測技術，為臨床合理規范使用多黏菌素提供全面的實驗室依據。方法 收集徐州醫科大學附屬醫院2022年11月—2023年11月分離的多黏菌素耐藥腸桿菌目菌株，采用PCR擴增法檢測雙組分系統調控基因pmrA、pmrB、phoP、phoQ、mgrB和mcr-1，采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF MS）在負離子模式下檢測脂質A基礎峰發生的位移變化。結果 共收集24株非重復多黏菌素耐藥的腸桿菌目細菌，其中肺炎克雷伯菌19株，大腸埃希菌5株?；驒z測顯示大腸埃希菌均為mcr-1基因陽性菌株，肺炎克雷伯菌中有4株攜帶mcr-1基因，3株mgrB基因發生過早終止，6株pmrB基因發生G256R突變，另外2株pmrB基因同時發生G256R和A246T突變，2株phoQ基因分別發生L26Q和A351D突變，1株phoP基因發生D191G突變，還有1株不僅攜帶mcr-1基因還發生了mgrB的堿基137C→G突變。負離子模式下的MALDI-TOF MS檢測顯示mcr-1陽性菌株在天然脂質A基礎峰上發生+123 m/z位移，而染色體上基因突變菌株在天然脂質A基礎峰上發生+131 m/z位移。結論 徐州地區的腸桿菌目細菌對多黏菌素主要存在兩種耐藥機制，即攜帶mcr-1基因和雙組分系統調控基因的突變，負離子模式下的MALDI-TOF MS可以實現主要腸桿菌目細菌因脂多糖修飾導致的多黏菌素耐藥表型檢測及耐藥機制的鑒別。

關鍵詞：MALDI-TOF MS；腸桿菌目細菌；多黏菌素；耐藥機制；快速檢測

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Rapid identification of bacterial polymyxin resistance mechanisms in Enterobacterales in negative ion mode by MALDI-TOF MS

Abstract Objective To investigate the main resistance mechanism of polymyxin-resistant Enterobacterales in Xuzhou and its rapid detection technology， and provide a comprehensive laboratory basis for the rational and standardized use of polymyxin in the clinic. Methods Polymyxin-resistant Enterobacterales strains isolated from November 2022 to November 2023 at the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University were collected. The polymyxin-resistant regulatory genes pmrA， pmrB， phoP， phoQ， mgrB， and mcr-1 were detected by PCR amplification， and the displacement of the lipid A basal peaks was detected by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） in negative ion mode. Results A total of 24 non-repetitive polymyxin-resistant Enterobacterales strains were collected， including 19 strains of Klebsiella pneumoniae and 5 strains of Escherichia coli. Genetic testing showed that all of the Escherichia coli were mcr-1 gene-positive strains， while four of the Klebsiella pneumoniae strains carried the mcr-1 gene， three strains had premature termination of the mgrB gene， six strains had the G256R mutation in the pmrB gene， another two strains had both the G256R and A246T mutations in the pmrB gene， two strains had the L26Q and A351D mutations in the phoQ gene， one strain had the D191G mutation in the phoP gene， and one strain not only carried the mcr-1 gene but also had the base 137C→G mutation in mgrB. MALDI-TOF MS in negative ion mode showed that all mcr-1 positive strains had a +123 m/z shift in the natural lipid A base peak， while all strains with mutations in the gene on the chromosome had a +131 m/z shift in the natural lipid A base peak. Conclusions There were two main resistance mechanisms to polymyxin in Enterobacterales bacteria in Xuzhou， i.e.， carrying the mcr-1 gene and the mutation of the regulatory gene of the two-component system， and MALDI-TOF MS in negative ion mode could realize the detection of the polymyxin-resistant phenotypes of the main Enterobacterales bacteria due to the modification of the lipopolysaccharides， as well as the identification of their resistance mechanisms.

Key words MALDI-TOF MS; Enterobacterales; Polymyxin; Drug resistance mechanism; Rapid detection

近年來腸桿菌目細菌出現的多重耐藥、廣泛耐藥和進一步難以治療的耐藥，已成為世界范圍內嚴重的公共衛生威脅[1]。多黏菌素被認為是治療多重耐藥菌特別是碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌感染的“最后一道防線”[2]。但隨著多黏菌素在臨床上的應用，耐藥性在逐年增加，耐藥形勢愈發嚴峻。

多黏菌素是一種多陽離子抗菌肽，其主要靶位是革蘭陰性桿菌細胞壁中的脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）。多黏菌素耐藥機制最常見的是染色體上pmrAB和phoPQ雙組分系統（TCS）以及質粒攜帶基因mcr-1的突變導致LPS中發生相關修飾即在LPS脂質A末端磷酸基團添加磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，PEtN）和/或4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-L-arabinose，L-Ara4N）從而降低細胞膜的電負性，使多黏菌素對LPS的親和力降低而產生耐藥性[3-4]。據文獻報道[5]，mgrB基因編碼一個小的跨膜蛋白是TCS的負調控因子，mgrB基因的突變或插入失活主要導致L-Ara4N添加到脂質A中，而質粒介導的mcr-1基因可編碼磷酸乙醇胺轉移酶導致PEtN添加到脂質A中，而脂質A的結構變化可以通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）得到檢測[6]。

多黏菌素耐藥性檢測最常用微量肉湯稀釋法測定MIC值，該法需要18～24 h，耗時較長[7]，而快速、準確、靈敏的檢測技術對多黏菌素耐藥的防控和治理、臨床的規范化使用至關重要[8]。本研究將對收集的徐州醫科大學附屬醫院多黏菌素耐藥臨床分離株，使用PCR方法確定其耐藥基因型，并通過MALDI-TOF MS快速檢測LPS脂質A的變化，實現

1 h內完成臨床分離的腸桿菌目細菌對多黏菌素耐藥表型及耐藥機制的鑒別。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

篩選徐州醫科大學附屬醫院2022年11月—2023年11月臨床首次分離對多黏菌素耐藥的非重復肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）和大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）。陰性對照菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603和大腸埃希菌 ATCC25922。本研究已通過徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準（批文號：XYFY2021-KL102-01）。

1.2 試劑與儀器

MALDI-TOF MS質譜儀（重慶中元匯吉生物技術有限公司），VITEK-2Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀（法國Bio-Merieux公司），PCR儀（美國Bio-Rad公司），DYY-6C型瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠），成像分析儀（美國Bio-Rad公司），DTC-100恒溫金屬?。ê贾萑鹫\儀器有限公司）；多黏菌素藥敏試劑（溫州市康泰生物科技有限公司）、PCR相關試劑、甲醇、三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司）、無水乙酸鈉（上海易恩化學技術有限公司）、9H-吡啶［3，4-b］吲哚（上海麥克林生化科技股份公司）。引物合成由上海生工生物公司完成。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定與藥物敏感性實驗

用MALDI-TOF MS質譜儀進行菌種鑒定，用VITEK-2Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀進行常用抗菌藥物敏感性實驗，微量肉湯稀釋法進行多黏菌素藥敏實驗復核。折點判斷參照2023年臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準[9]。

1.3.2 耐藥基因檢測

高溫煮沸法提取DNA模板，PCR檢測染色體上多黏菌素耐藥基因mgrB、pmrA、pmrB、phoP、phoQ及質粒介導的基因mcr-1。引物序列及反應條件參照相關文獻[10-12]見表1。PCR反應體系包括上、下游引物各1 μL、Premix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA模板2 μL，共25 μL。擴增產物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性擴增產物送上海生工生物公司用美國ABI 3730XL分析儀進行Sanger法測序，結果用snapgene軟件與GenBank中的原序列比對分析突變位點。通過軟件PROVEAN（ProteinVariationeffect Analyzer） v1.1.3（http：//provean.jcvi.org/index.php）檢測突變位點有害效應。

1.3.3 MALDI-TOF MS質譜儀脂質A檢測

試劑配制" " ①基質溶液：稱取5 mg基質（9H-吡啶[3，4-b]吲哚）溶于500 μL基質溶劑（氯仿/甲醇/純水（12：6：1））中渦旋溶解配制成10 mg/mL濃度的基質溶液。②醋酸鈉溶液：稱取8.2 mg無水乙酸鈉，溶于

1 mL純水配制出100 mmol/L醋酸鈉溶液，然后用醋酸調節到pH值為4.0 。

脂質A提取液制備" " 400 μL pH4.0 100 mmol/L的醋酸鈉溶液溶解2～3個單個菌落，充分渦旋混勻，100 ℃水浴加熱30 min，每隔5 min取出渦旋混勻40 s，

冷卻至室溫。離心（8000×g，5 min），棄上清液，剩余部分加入500 μL 95%乙醇，渦旋溶解，再次離心（8000×g，3 min）棄上清液，待乙醇揮發干燥后，加入100 μL基質溶劑，劇烈攪動菌體，渦旋溶解，再次離心（5000×g，5 min），所得上清液即為脂質提取液。在MALDI 靶板上滴加0.75 μL脂質提取液，晾干后覆蓋0.75 μL基質溶液，待晾干后， MALDI-TOF MS質譜儀負離子模式下檢測。

2 結果

2.1 菌種及藥敏結果

篩選經VITEK-2Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀檢測并通過微量肉湯稀釋法復核24株耐藥腸桿菌目細菌對常用抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC），具體藥敏結果見表2。

2.2 耐藥基因檢測結果

24株多黏菌素耐藥的腸桿菌目細菌經Sanger法測序分析，檢出10株（E. coli 5株，Kpn 5株）攜帶mcr-1基因與GenBank的原序列MT070410.1完全一致[13]，

其中一株KPn3421同時有mgrB基因137位堿基由C→G，發生46位氨基酸由Pro→Arg。與GenBank中的MN187248原序列[3]比對結果顯示，KPn2778、KPn2786、KPn2932 mgrB基因88位堿基由C→T，過早出現終止密碼子TAG。KPn2459、KPn2608、KPn3044、KPn3045、KPn3127和KPn2915的pmrB基因存在G256R突變，另外KPn3199和KPn3405的pmrB基因同時存在G256R和A246T突變。KPn2985、 Kpn3483的phoQ基因分別存在L26Q和A351D突變。Kpn3422的phoP基因存在D191G突變（表3）。部分電泳結果見圖1。

2.3 MALDI-TOF MS質譜分析

負離子模式下，肺炎克雷伯菌多黏菌素敏感菌株的天然脂質A基礎峰值（m/z）為1824、1840、2062，大腸埃希菌的基礎峰值（m/z）為1796。9株mcr-1陽性菌株均出現敏感菌株中不存在的獨特離子（m/z）

1919、1947，1919、1947代表在基礎峰（m/z）1796和1824上發生+123的位移，14株染色體上突變菌株出現獨特離子（m/z）1955、1971、1955和1971代表在基礎峰1824和1840上發生+131的位移，還有一株Kpn3421菌株檢出mcr-1陽性同時檢出染色體突變，存在獨特離子（m/z）1955和2185，1955代表在基礎峰1824上發生+131的位移，2185代表在基礎峰2062上發生+123質量位移。具體見表3和圖2。

3 討論

腸桿菌目對多黏菌素耐藥主要由染色體TCS和質粒介導的LPS修飾導致。其中質粒介導的mcr-1是由中國學者Liu等[12]于2015年在大腸埃希菌中首次發現并報道，隨后全球40多個國家也相繼發現了這種可在不同物種間水平轉移傳播的耐藥基因。國內外研究[14]表明無論是動物源性還是人源性mcr-1在E. coli中流行率較高，而在Kpn中流行率較低。Quan等[15]收集了我國28家醫院血流感染患者標本發現mcr-1在大腸埃希菌中檢出率為1%，而KP檢出率僅為0.17%。本研究耐藥基因及測序結果顯示，5株多黏菌素耐藥大腸埃希菌中未檢測到phoP、phoQ、pmrA、pmrB以及mgrB基因的突變，其耐藥均由mcr-1基因介導，表明本地區大腸埃希菌對多黏菌耐藥主要為mcr-1介導。相對于大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌對多黏菌素的耐藥機制呈現多樣性，以基因突變為主，這種基因的突變往往與過度的抗菌藥物使用壓力有關，因此，需要促進抗菌藥物的規范、合理使用來減少突變的風險。mcr-1基因可隨質粒在腸桿菌目細菌間傳播，因此應當引起臨床的足夠重視，通過合理的感染預防措施來控制傳播。本次研究檢測到一株肺炎克雷伯菌（Kpn3421）同時存在mcr-1基因和mgrB的突變，這是本地區首次發現同時存在兩種多黏菌素耐藥機制的肺炎克雷伯菌，雙機制介導了對多黏菌素更高的MIC（≥16 μg/mL），對臨床治療提出了更高的挑戰。

常規實驗室主要通過細菌鑒定藥敏儀并用微量肉湯稀釋法測定MIC值復核來確定多黏菌素耐藥性，測試一般需要等待24～48 h才能讀取結果，耗時較長?；诖耍琇iang等[16]描述了一種基于MALDI-TOF MS質譜的方法，通過檢測脂質A修飾快速區分多黏菌素耐藥性。在Dortet等[6]的研究中發現染色體上基因突變主要在天然脂質A上添加L-Ara4N，這種修飾可導致天然脂質A基礎峰m/z的+131位移，而mcr-1是一種pEtN轉移酶，可導致pEtN添加到天然脂質A中，從而引起+123的位移。通過對基因測序發現，出現基礎峰位移與多黏菌素耐藥呈高度一致性，位移大小因耐藥機制不同而不同，基于此，本研究完成了對多黏菌素耐藥表型以及耐藥機制的鑒別。通過優化相關前處理流程，可以在1 h內完成脂質A的提取和質譜鑒定分型，進而實現了負離子模式下MALDI-TOF MS對腸桿菌目細菌多黏菌素耐藥性及耐藥機制的快速檢測。

本研究發現應用MALDI-TOF MS在負離子模式下檢測脂質A基礎峰的位移可在1 h內初步判定多黏菌素耐藥性，并通過發生位移不同區分主要耐藥機制，這可為臨床及時反饋多黏菌素耐藥性，為臨床合理使用抗生素提供參考。但由于本研究為單中心研究，且涉及樣本量較小，多黏菌素耐藥的機制除了本研究涉及的機制還有其他突變機制以及外排泵機制等，尚不能代表本地區的整體情況，因此，需納入更大的樣本量進行驗證本研究的結果。

綜上所述，本地區腸桿菌目細菌對多黏菌素耐藥機制主要是染色體上基因突變和攜帶mcr-1基因介導的。負離子模式下，MALDI-TOF MS能夠在1 h內實現對上述耐藥機制的快速鑒別及鑒定，這種方法為臨床合理、規范使用抗菌藥物提供了強力的實驗室支持。

參 考 文 獻

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