孕晚期孕婦無乳鏈球菌耐藥狀況與其血清型和毒力基因分析研究

摘要：目的 分析孕晚期孕婦生殖道無乳鏈球菌莢膜血清型、毒力基因的分布以及和紅霉素、克林霉素耐藥率及D試驗陽性率的相關性，為臨床無乳鏈球菌（group B Streptococcus GBS）感染的預防控制與治療提供依據。方法 收集昆明醫科大學第一附屬醫院2021年11月—2022年10月孕晚期孕婦臨床分離的GBS菌株，采用標準紙片擴散法進行藥物敏感性實驗，多重PCR的方法進行莢膜血清型分型，PCR方法進行毒力基因分析，藥敏分析應用WHONET 5.6進行，統計分析應用SPSS26.0。結果 共收集168株無乳鏈球菌，血清分型中血清型Ⅲ的檢出率最高為31.5%（53/168），其次為Ⅴ型31.0%（52/168），Ⅰb型25.0%（42/168），Ⅰa型7.7%（13/168），Ⅱ、Ⅳ型少見，未檢出Ⅳ型、Ⅶ型、Ⅷ型、Ⅸ型。檢出的9種不同的毒力基因中每株菌至少含有3種上的毒力基因，其中cylB、fbsA和fbsB基因檢出率為100.0%（168/168），hylB、lmb和scpB基因檢出率均大于91.0%，bac基因檢出率最低，為27.0%（47/168）。血清型Ⅰb中bca和bac基因的表達率顯著高于其他血清型（Plt;0.05），分別為92.1%（39/42）和88.1%（42/47），血清型Ⅲ中bac基因的表達率明顯低于其他血清型（Plt;0.05），為3.8%（2/53）。未檢出對青霉素和萬古霉素耐藥的菌株，對克林霉素和紅霉素的耐藥率分別為76.7%和70.8%。克林霉素和紅霉素的耐藥率在不同的血清型之間差異顯著（Plt;0.05）。D實驗陽性率為16.6%（28/168），其中Ⅴ型血清型中D實驗陽性率為85.7%（24/28），與其他血清型之間差異顯著（Plt;0.05）。結論 孕晚期孕婦生殖道GBS血清型以Ⅲ型和Ⅴ型為主，普遍存在3種以上毒力基因，不同血清型之間毒力基因表達率、D試驗陽性率、紅霉素和克林霉素的耐藥率存在差異。未發現耐青霉素G和萬古霉素的菌株，青霉素仍可作為治療無乳鏈球菌感染的首選藥物。

關鍵詞：無乳鏈球菌；血清型；毒力基因；耐藥性

中圖分類號：R446.5 文獻標志碼：A

Drug resistance status of Streptococcus agalactiae in pregnant women in the third trimester of pregnancy and its serotype and virulence gene analysis

Abstract Objective To analyze the distribution of capsular serotypes and virulence genes of genital Streptococcus agalactiae in pregnant women in the third trimester of pregnancy and the correlation between the resistance rates to erythromycin and clindamycin， with positive D test rates to provide a basis for the prevention， control， and treatment of group B Streptococcus （GBS） infection. Methods The GBS strains clinically isolated from pregnant women in the third trimester of pregnancy from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from November 2021 to October 2022 were collected， and the drug susceptibility experiment was carried out by the standard paper diffusion method; capsular serotyping was carried out by multiplex PCR; virulence gene analysis was performed by the PCR method; WHONET 5.6 was used for drug susceptibility analysis; and SPSS26.0 was used for statistical analysis. Results A total of 168 strains of Streptococcus agalactiae were collected， and the highest detection rate of serotype Ⅲ was 31.5% （53/168）， followed by 31.0% （52/168） of type V， 25.0% （42/168） of type Ⅰb， and 7.7% （13/168） of type Ⅰa. The detection rate of type Ⅱ and Ⅳ was rare， and type Ⅳ， type Ⅶ， type Ⅷ， and type IX were not detected. Among the 9 different virulence genes， each strain contained at least 3 virulence genes， among which the detection rates of the cylB， fbsA， and fbsB gene were 100.0% （168/168）， the detection rates of the hylB， lmb， and scpB gene were all greater than 91.0%， and the detection rate of the bac gene was the lowest （27.0%） （47/168）. The expression rates of bca and bac genes in serotype Ⅰb were significantly higher than those of other serotypes （Plt;0.05）， which were 92.1% （39/42） and 88.1% （42/47）， respectively， and the expression rates of bac genes in serotype III were significantly lower than those of other serotypes （Plt;0.05）， which were 3.8% （2/53）. No strains resistant to penicillin and vancomycin were detected， and the resistance rates to clindamycin and erythromycin were 76.7% and 70.8%， respectively. The resistance rates of clindamycin and erythromycin were significantly different among different serotypes （Plt;0.05）. The positive rate of the D test was 16.6% （28/168）， and the positive rate of the D test was 85.7% （24/28） among Ⅴ serotypes， which was significantly different from other serotypes （Plt;0.05）. Conclusion The serotypes of GBS in the genital tract of pregnant women in the third trimester of pregnancy were mainly type Ⅲ and Ⅴ， and there were more than three virulence genes. There were also differences in the expression rate of virulence genes， the positive rate of the D test， and the resistance rates of erythromycin and clindamycin among different serotypes. No strains resistant to penicillin G or vancomycin have been found， and penicillin could still be used as the drug of choice for the treatment of Streptococcus agalactiae infection.

Key words Streptococcus agalactiae;" Serotype; Virulence genes; Antimicrobial resistance

無乳鏈球菌又稱B群鏈球菌（group B Streptococcus， GBS），常定植于直腸及陰道，全球孕婦GBS的總體定植率為18%，中國孕婦的定植率為11.3%，定植的孕婦約50%會傳播給新生兒[1-2]。定植的GBS一般沒有臨床癥狀，當妊娠、免疫低下、高齡或伴隨糖尿病等基礎疾病時，感染的風險會明顯增加[3]。GBS是圍產期感染的主要病原體，可以造成孕婦產褥感染，也可以上行至宮內造成宮內感染，導致流產，是新生兒早發性膿毒癥和腦膜炎（出生后28 d）的主要原因[4]。新生兒疾病的嚴重程度是由血清型和毒力基因決定的，莢膜多糖是血清型分型的依據，與毒力基因一樣，不同的地區之間存在地域差異性，積極監測有助于了解本地區GBS流行情況，并針對性地采取可行的預防措施。在本研究中，分析2021年11月—2022年10月我院檢出的168株GBS的莢膜血清型與毒力基因的分布及與不同藥物的耐藥率、D試驗陽性率等的相關性，為GBS研究的溯源和臨床用藥提供參考依據。

1 資料和方法

1.1 菌株來源

收集2021年11月—2022年10月孕晚期婦女臨床分離的GBS菌株，所有分離株均通過GBS顯色培養基初篩、基質輔助激光解析/電離飛行時間質MALDI-TOF MS鑒定，所有孕婦均經B超檢查確認妊娠35～37周，同一患者陰道分泌物或直腸拭子均陽性者只選取1株，多次復查陽性者，僅收集第一株。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

清潔孕婦外陰后使用一次性無菌女性拭子于陰道下1/3的位置旋轉1周，收集陰道分泌物標本；將拭子插入肛門內，在肛門括約肌上方2～3 cm處輕輕旋轉，得到直腸拭子，所有標本取樣后立即送檢。

1.2.2 藥敏試驗

合格標本按照《臨床檢驗操作規程》第4版要求進行，采用三區劃線將標本接種于B群鏈球菌顯色培養基，置于35 ℃、5%CO2培養箱培養18～24 h，根據顯色情況及菌落形態初步判斷，使用MALDI-TOF MS鑒定細菌，通過標準紙片擴散法進行藥敏試驗和D實驗，藥敏結果參照CLSIM100（第31版）標準進行判讀[5]。質控頻率為每周1次，質控菌株包括肺炎鏈球菌ATCC49619、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922，均購自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。

1.2.3 血清分型和毒力基因

將-80 ℃凍存備用的菌株轉種，經18～24 h培養后，挑取單個菌落，提取菌株DNA，使用多重PCR的方法檢測Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ等10種血清型（表1）以及bac、bca、rib、hylB、lmb、scpB、cylB、fbsA、fbsB等9種毒力基因（表2）。血清型PCR反應總體系為25 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，模板 2.5 μL，上下引物各1μL，ddH2O 8 μL。反應條件：預變性95 ℃，15 min；變性94℃，30 s；退火 54 ℃，90 s；延伸 72 ℃， 60 s

（35個循環）； 延伸 72 ℃，10 min。毒力基因PCR反應總體系 20 μL，包括2×Taq MasterMix 10 μL，模板 3 μL，正反向引物各1 μL（引物濃度為μmol/L），ddH2O 5 μL，反應條件：預變性 94 ℃，2 min； 變性94℃，30 s；退火50 ℃，60 s；延伸72 ℃，60 s（30 個循環）；延伸72 ℃，2 min。血清型PCR擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳成像觀察條帶，結果判讀參照文獻[6]，毒力基因PCR產物行瓊脂糖電泳凝膠成像，觀察對應的條帶，部分產物委托北京博邁德生物科技有限公司進行測序，引物序列見表1和3[7-8]。

1.2.4 統計分析

藥敏統計分析應用WHONET 5.6軟件進行，統計分析使用SPSS26.0，計數資料以頻數或率表示，比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率法，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏結果

共收集168株孕晚期婦女GBS菌株，未發現對青霉素和萬古霉素耐藥的菌株，克林霉素和紅霉素的耐藥率較高，分別為59.5%和70.8%，D試驗陽性率為16.6%（28/168），D試驗陽性修正后的克林霉素耐藥率為76.2%（128/168），見表4。

2.2 血清型分型及毒力基因分布

血清型Ⅲ的檢出率最高，為31.5%（53/168），其次為Ⅴ型31.0%（52/168），Ⅰb型檢出率25.0%（42/168），Ⅰa型檢出率為7.7%（13/168）；Ⅱ型檢出率為3.0%（5/168）；Ⅵ型檢出率為1.2%（2/168），1株為不定型（NT），檢出率為 0.6%（1/168），血清型Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ未檢出（圖1）。毒力基因中cylB、fbsA和fbsB檢出率為100.0%（168/168），hylB和lmb基因檢出率均為92.2%（155/168），scpB基因的檢出率為91.6%（154/168），bca基因檢出率53.5%（90/168）；rib基因檢出率42.2%（71/168）；最少的是bac基因，檢出率為27.9%（47/168）（圖2）。

2.3 血清型與毒力基因分布關系

cylB基因、fbsA基因和fbsB基因所有血清型均有表達，未表現出明顯差異，bca和bac基因在Ⅰb型血清型中較其他血清型表達率高，其中bac基因型在Ⅲ型和Ⅴ型血清型中表達率顯著低于其他血清型，差異有統計學意義（χ2=781.7，P=0），血清型與毒力基因分布（圖3）。

2.4 血清型與耐藥率、D試驗的相關性分析

本研究分析了168株GBS不同的血清型中，紅霉素和克林霉素的耐藥率存在顯著差異（Plt;0.05）（表5和圖4）。D試驗陽性率為16.6%（28/168），其中V型24株，占85.7%（24/168），D試驗陽性率在6種血清型的GBS中差異存在統計學意義（χ2=42.901，P=0）（圖5）。

3討論

無乳鏈球菌于20世紀30年代首次從患乳腺炎的奶牛中分離出來，是新生兒致病的主要病原體，妊娠期無癥狀攜帶GBS除了增加如尿路感染等母體感染的風險外，也是通過垂直傳播發生新生兒侵襲性疾病的危險因素[9]。GBS的致病性與莢膜多糖（capsular polysaccharide， CPS）、CAMP因子、AIP蛋白家族、溶血素、Sip蛋白和FbsA蛋白相關，尤其是莢膜多糖，它可以協助GBS躲避巨噬細胞的吞噬穩定地定植于宿主內，起到了免疫逃逸的作用[10]。GBS是圍生期感染的首要致病菌，可引起流產、早產、胎兒窘迫和新生兒感染等嚴重結局。

GBS依據其CPS的不同，共分為10個血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ），不同地區優勢血清型存在明顯的差異，Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ血清型是主要致病血清型，涵蓋了98%的GBS分離株，一項研究[11]分析了包括美國、英國和法國的孕產婦分離的GBS，Ⅰa血清型是導致孕產婦感染最流行的血清型，Lin等[12]發現Ⅰb型是臺灣最常見的血清型，在孕婦、新生兒和非懷孕成人混合人群的分離率占21.6%，我國報道最多的高致病血清型為Ⅲ型[13-14]，與本研究一致。我國流行的Ⅲ型因可致胎膜早破引起早發性GBS感染而被廣泛關注，是導致不良妊娠結局的重要因素，目前傳統的干預措施仍然以預防性使用抗生素為主，莢膜多糖作為GBS最重要的毒力因子之一，是GBS疫苗研發的主要關注點，不同的疫苗針對不同的莢膜血清型發揮作用，CPS結合疫苗可以引起免疫后特異性抗體的顯著增加，以起到保護的作用。目前Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型的疫苗已經進入了2期臨床試驗，也有針對血清型Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的五價疫苗進入1期臨床試驗中，這將會明顯地改善圍產期孕產婦及新生兒的結局，針對特定血清型進行疫苗接種是未來GBS預防感染的重要目標[1，16]。積極監測GBS的血清型可以了解各地區的流行病學資料，有助于GBS研究的溯源并及時篩查出優勢基因型，有利于GBS的監測與預防，為未來針對性的疫苗研發提供更廣泛、更準確的目標。

GBS感染的嚴重程度與GBS的莢膜血清型和毒力基因相關。GBS涉及毒力的主要包括蛋白C，包括表面蛋白Cα（bca基因）、Rib（rib基因）和Cβ（bca基因），蛋白C有助于GBS侵入宮頸上皮細胞，增加侵襲性感染的風險，lmb基因編碼Lmb蛋白，該蛋白參與宿主細胞細胞外基質，特別是胎盤膜的層黏連蛋白的黏附，還能促進中樞神經系統內皮細胞的侵襲，纖維蛋白原（fbsB）的黏附蛋白是由fbsB基因編碼，它可以讓GBS黏附在肺上皮細胞中，起到免疫逃逸的作

用[17-18]。cyl基因編碼的β溶血素與組織損傷和腦膜炎的全身擴散有關，hylB基因編碼透明質酸裂解酶，與細菌全身擴散有關，fbsA基因編碼的蛋白FbsA保護細菌免受吞噬細胞的吞噬，促進細菌進入通過血腦屏障，促進腦膜炎，scpB基因編碼C5a肽酶，使C5a的趨化作用減弱，抑制中性粒細胞的募集[19–21]。在本研究中，毒力基因在GBS中分布廣泛，cylB、fbsA和fbsB基因所有菌株均有表達，普遍含有3種以上的毒力基因，bac基因的陽性率最低，占28.0%（47/168），bac、bca和rib基因的檢出率較少，這與國外的研究類似[22]。比起國內項君艷等人對河南地區GBS毒力基因的研究，這3種基因型的陽性率存在一定的差異，表明不同地區之間毒力基因的分布的差異性[23]。

不同的毒力基因與血清型之間存在一定的相關性，bca和bac基因表達最高的血清型是Ⅰb型，bac基因型在Ⅲ型和Ⅴ型血清型中表達率最低，差異顯著（Plt;0.05），這與Martins等[24]的研究一致。毒力基因作為GBS特征性質的生物學特性之一，目前尚未被充分利用，研究不同的毒力基因與臨床相聯系，有助于GBS定植與感染的防控與治療。

無乳鏈球菌的感染，如不及時進行臨床干預，可引起孕婦、新生兒、老年人及免疫缺陷者感染甚至死亡，青霉素是治療GBS感染的首選藥物[25]。本研究中GBS對青霉素及萬古霉素仍保持高度的敏感性，對克林霉素（修正后）和紅霉素的耐藥率較高，分別為59.5%和70.8%，與CHINET的數據基本一致[26]。紅霉素和克林霉素的耐藥率在不同的血清型之間存在差異，但考慮到本研究納入的數據較少，尤其是對部分檢出率較少的菌株耐藥率可能存在偏差，臨床在治療或者預防性使用時需依據藥敏結果選用。值得注意的是，納入研究的168株GBS中D試驗陽性率16.7%（28/168），主要分布在血清型Ⅴ型中，占85.7%（24/28），D試驗陽性率在不同血清型之間差異顯著，本研究與宋小華等[27]的研究一致。但彭捷等[28]的研究中D試驗的陽性率達29.5%，結合前文所述血清型之間的地域差異，D試驗陽性率的不同可能與各地區之間血清型分布差異有關，動態監測GBS的藥敏情況，為臨床GBS的治療提供依據，與GBS的特征性生物學特性相結合為未來GBS預防與控制提供溯源依據。

綜上所述，GBS血清分型以Ⅲ、Ⅴ型為主，cylB、fbsA和fbsB基因普遍存在，bca和bac基因在Ⅰb型血清型中表達率最高，bac基因在Ⅲ型中的表達率最低，差異有統計學意義，紅霉素和克林霉素的耐藥率在不同的血清型之間差異顯著。值得注意的是，Ⅴ型血清型中D實驗陽性率明顯高于其他血清型，差異顯著。藥敏結果青霉素和萬古霉素仍具有較高的敏感性，青霉素仍可以作為臨床治療的首選用藥，對紅霉素、克林霉素的耐藥率較高，臨床使用時應根據藥敏結果謹慎選擇，合理用藥。

參 考 文 獻

Russell N J， Seale A C， O’Driscoll M， et al. Maternal colonization with group B Streptococcus and serotype distribution worldwide： Systematic review and meta-analyses[J]. Clin Infect Dis， 2017， 65（suppl_2）： S100-S111.

Ding Y， Wang Y， Hsia Y， et al. Systematic review and meta-analyses of incidence for group B Streptococcus disease in infants and antimicrobial resistance， China[J]. Emerg Infect Dis， 2020， 26（11）： 2651-2659.

English B K. Group B Streptococcus[J]. Lancet， 1995， 346（8976）： 700.

Ge Y， Pan F， Bai R， et al. Prevalence of group B Streptococcus colonization in pregnant women in Jiangsu， East China[J]. BMC Infect Dis， 2021， 21（1）： 492.

Clinical Laboratory Standard Institute. Performancestandards for antimicrobiol susceptibility[S]. 2023.

Imperi M， Pataracchia M， Alfarone G， et al. A multiplex PCR assay for the direct identification of the capsular type （Ia to IX） of Streptococcus agalactiae[J]. J Microbiol" Methods， 2010， 80（2）： 212-214.

Poyart C， Tazi A， Réglier-Poupet H， et al. Multiplex PCR assay for rapid and accurate capsular typing of group B streptococci[J]. J Clin Microbiol， 2007， 45（6）：1985-1988.

胥志超， 張波， 鐘婉瑩， 等. 無乳鏈球菌毒力基因的分布及其與耐藥性和MLST的關系[J]. 中國病原生物學雜志， 2018， 13（11）： 1216-1220.

Patras K A， Nizet V. Group B Streptococcal maternal colonization and neonatal disease： Molecular mechanisms and preventative approaches[J]. Front" Pediatrics， 2018， 6： 27.

張行， 李新圃， 楊峰， 等. 無乳鏈球菌研究進展[J]. 中國獸醫學報， 2020， 40（4）： 864-872.

Hall J， Adams N H， Bartlett L， et al. Maternal disease with group B Streptococcus and serotype distribution worldwide： Systematic review and meta-analyses[J]. Clin Infect Dis， 2017， 65（suppl_2）： S112-S124.

Lin H C， Chen C J， Chiang K H， et al. Clonal dissemination of invasive and colonizing clonal complex 1 of serotype VI group B Streptococcus in central Taiwan， China[J]. J Microbiol Immunol Infect. 2016， 49（6）： 902-909.

周燕珍， 王利民， 方寅飛. 無乳鏈球菌致新生兒血流感染的血清型與耐藥性研究[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2017， 27（8）： 1190-1193.

楊景， 田輝， 蘇慧琳， 等. 孕晚期無乳鏈球菌感染的血清型耐藥性及分子遺傳背景特征[J]. 廣東醫學， 2022， 43（9）： 1134-1140.

高爽， 孫曉娟， 柳中洋， 等. 沈陽地區孕晚期婦女攜帶B群鏈球菌不同血清型的調查研究[J]. 國際婦產科學雜志， 2019， 46（5）： 515-518.

Lin S M， Zhi Y， Ahn K B， et.al. Status of group B Streptococcal vaccine development[J]. Clin Exp Vaccine Res， 2018， 7（1）： 76-81.

Ragunathan P， Sridaran D， Weigel A， et al. Metal binding is critical for the folding and function of laminin binding protein， Lmb of Streptococcus agalactiae[J]. PloS One， 2013， 8（6）： e67517.

Devi A S， Ponnuraj K. Cloning， expression， purification and ligand binding studies of novel fibrinogen-binding protein FbsB of Streptococcus agalactiae[J]. Protein Expres Purif， 2010， 74（2）： 148-155.

Schubert A， Zakikhany K， Pietrocola G， et al. The fibrinogen receptor FbsA promotes adherence of Streptococcus agalactiae to human epithelial cells[J]. Infecti Immun， 2004， 72（11）： 6197-6205.

Wang Z， Guo C， Xu Y， et al. Two novel functions of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae are enhanced intracellular survival and inhibition of proinflammatory cytokine expression[J]. IAI， 2014， 82（6）： 2615-2625.

Lindahl G， St?lhammar-Carlemalm M， Areschoug T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens[J]. Clin Microbiol Rev， 2005， 18（1）： 102-127.

Bobadilla F J， Novosak M G， Cortese I J， et al. Prevalence， serotypes and virulence genes of Streptococcus agalactiae isolated from pregnant women with 35～37 weeks of gestation[J]. BMC Infect Dis， 2021， 21（1）： 73.

項君艷， 李君瑞， 劉志惠， 等. 孕產婦無乳鏈球菌感染現狀與毒力基因分析[J]. 中華醫院感染學雜志， 2021， 31（19）： 3022-3025.

Martins E R， Andreu A， Correia P， et al. Group B Streptococci causing neonatal infections in barcelona are a stable clonal population： 18-year surveillance[J]. J Clin Microbiol， 2011， 49（8）： 2911-2918.

Assabahi A， Driggers R， Keeys C A， et al. Evaluation of appropriate vancomycin prescribing for the prevention of newborn group B Streptococcal infections in a community hospital obstetrics service[J]. J Perinat Med， 2022， 50（9）： 1218-1224.

胡付品， 郭燕， 朱德妹， 等. 2021年CHINET中國細菌耐藥監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2022， 22（5）： 521-530.

宋小華， 應群華， 樓秀敏. 妊娠晚期孕婦無乳鏈球菌感染與耐藥性變遷分析[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2017， 27（9）： 1338-1340.

彭捷， 黃榮富， 鐘文， 等. 圍產期孕婦泌尿生殖道無乳鏈球菌的感染與耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志， 2017， 27（8）： 1841-1844.