植物天然產物抗腸出血性大腸埃希菌的研究進展

摘要：腸出血性大腸埃希菌（enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC）作為人畜共患致病菌，暴發性感染可誘發嚴重的全身性溶血性尿毒癥綜合征（hemolytic uremic syndrome， HUS）。然而傳統的抗生素治療不僅導致耐藥性的產生，還會促進志賀毒素（Shiga toxin， Stx）的釋放，從而加重病情。因此亟需開發新型抗EHEC感染藥物。植物天然產物因其結構和功能的多樣性，在抑制細菌生長和抗毒力方面顯示出巨大的潛力，成為研發新型抗EHEC感染藥物的重要資源庫。本文通過介紹植物天然產物，在此基礎上對抑制EHEC生長和毒力因子的植物天然產物分別進行總結，為尋找預防和治療EHEC感染提供思路和依據。

關鍵詞：植物天然產物；腸出血性大腸埃希菌；抑制生長；抗毒力

中圖分類號：R9 文獻標志碼：A

Research progress on plant-derived natural products against enterohemorrhagic Escherichia coli

Abstract Enterohemorrhagic Escherichia coli （EHEC） is a zoonotic pathogen that poses a significant threat to public health due to its ability to induce severe systemic hemolytic uremic syndrome （HUS） during an outbreak. However， traditional antibiotic treatment not only leads to the development of antibiotic resistance， but also promotes the release of Shiga toxin （Stx） to aggravate the disease. Thus， it is imperative to develop novel drugs for the treatment of EHEC infections. The structural and functional diversity of plant-derived natural products endows them with immense potential for inhibiting bacterial growth and reducing virulence， making them a valuable resource for the development of novel anti-EHEC drugs. This article introduced the types and characteristics of plant-derived natural products and summarized the research on specific plant natural products that inhibited bacterial growth and virulence factors of EHEC， aiming to provide insights and a basis for the prevention and treatment of EHEC infections.

Key words Plant natural products; Enterohemorrhagic Escherichia coli; Growth inhibition; Anti-virulence

大腸埃希菌通常作為共生菌寄居在人體腸道中。但含有編碼特定毒力因子的質粒、噬菌體、轉座子和致病性島的大腸埃希菌具有致病性，并以血清型分為不同亞型。EHEC是一種食源性致病菌，主要血清型為EHEC O157：H7。與普通K-12大腸埃希菌相比，EHEC的基因組上存在177個O島（O-islands， OI），包括編碼三型分泌系統（type 3 secretory system， T3SS）的LEE（locus of enterocyte effacement）致病性島以及Stx轉化噬菌體（OI-45和OI-93），前者可促進細菌緊密黏附在腸細胞上造成腸壁損傷，后者可導致出血性腸炎和全身性溶血性尿毒癥綜合征[1-2]。然而常規的抗生素治療不僅誘導EHEC產生耐藥性[3]，而且促進釋放Stx[4]，從而增加感染患者繼發HUS的風險[5]。目前沒有特定的治療方法可對抗EHEC感染，主要以緩解癥狀為主的支持性治療。除了靶向細菌生長的抑菌藥物研發，抗毒力治療成為新型的治療策略。Shigamab復合抗體通過中和Stx能夠治療由EHEC引起的腹瀉，并在臨床Ⅱ期研究中該抗體顯示出良好的安全性和耐受性。并在臨床Ⅱ期研究中該藥物顯示出良好的安全性和耐受性[6]。但目前只有個別藥物已進入臨床階段，因此開發預防和治療EHEC感染藥物還存在較大的進展空間。

大多數植物能夠產生數百種甚至數千種具有獨特化學結構的中間體和代謝產物，有利于植物進行自我防御或與其他生物相互作用以適應環境，這些化合物統稱為植物次級代謝物或天然產物[7-8]。研究表明這些產物除了靶向細菌生長和存活的抗菌價值外，也能夠靶向細菌毒力和致病途徑[9-10]，具有預防和治療細菌感染的巨大潛力。雖然植物天然產物對病原菌的抗菌活性得到廣泛研究，但關于抗EHEC感染的產物并沒有得到系統的總結。本文通過簡述植物天然產物，在此基礎上對能夠抑制EHEC生長和毒力因子的植物天然產物分別進行總結，介紹其作用機制，為未來開發抗EHEC感染藥物提供潛在策略。

1 植物天然產物

植物天然產物種類繁多，結構復雜。具有不同結構的酚類化合物、萜烯類化合物和生物堿對細菌感染具有良好的預防和治療前景。

1.1 分類

1.1.1 酚類化合物

多酚是在高等植物中自然產生的次生代謝產物，包括黃酮、酚酸、單寧和二苯乙烯類化合物[11]。它們通常具有抗菌、抗氧化和抗炎活性。多酚類化合物通常含有一個或多個帶羥基的芳香環結構。多酚的羥基對蛋白質具有很強的親和力，因此酚羥基的數量和位置都能夠影響蛋白質的結構和功能[12]。羥基的數量越多，可能形成的氫鍵或其他相互作用就越多，從而增強與蛋白質的結合力。羥基的位置也會影響它們與蛋白質相互作用的方式，因為不同的氨基酸殘基在蛋白質表面分布不同，羥基可能與這些殘基形成特定的相互作用。黃酮類化合物是兩個苯環連接到雜環上的多酚物質，根據其化學結構可以分為黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）、（二氫）異黃酮、查爾酮、黃烷酮、黃烷醇、花青素以及橙酮類等，是抗EHEC最常見的天然產物。黃酮類化合物具有兩親性，這使它們能夠穿透細胞膜。同時在黃酮類化合物的環上，C5、C7、C3'和C4'的羥基化以及C6位點的芳香化或異戊二烯化是抗菌活性的重要結構特征[13]（圖1）。酚酸主要分為苯甲酸和肉桂酸，其羧基與苯環相連。酚酸通過解離增加酸度，進而改變細胞膜的電位使膜更具滲透性，最終引起胞內K+外排[14]。而革蘭陽性菌由于沒有外膜，因此對此類化合物更敏感[15]。同時酚酸的抗菌活性隨著烷基鏈長度的增加而增強[16]。根據化學結構和生物合成路徑可以將單寧分為水解單寧和縮合單寧。前者是由沒食子酸或鞣花酸和葡萄糖分子通過酯鍵結合形成的多元酯類化合物，在酸、堿和酶作用下能夠被水解；后者主要由黃烷-3-醇結構單元通過C-C鍵或C-O-C鍵聚合而成，包括兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等[17]。

縮合單寧通常不溶于水，具有較強的收斂性和抗菌活性。單寧的抗菌活性與其化學結構密切相關，特別是與游離沒食子基團的數量、低聚物結合的類型和分子的大小有關[18]。

1.1.2 萜烯類化合物

萜烯類是數量最多、結構最多樣化的天然產物。它們以異戊二烯為基本結構單元。根據異戊二烯的數量不同，萜烯類化合物能夠分為半萜、單萜、倍半萜烯和二萜等。萜烯類化合物通過環合、氧化、還原等反應形成不同的碳骨架和功能團，從而產生多樣的生物活性[19]。萜烯類化合物的抗菌活性與其親脂性和羥基化程度密切相關。其特性和結構有利于它們通過破壞脂質膜成分增加膜的滲透性，或者通過干擾細菌的呼吸代謝和氧化磷酸化過程，從而抑制細菌的生長和繁殖[20]。

1.1.3 生物堿

生物堿是具有廣譜抗生素特性的堿性含氮有機化合物，也是開發臨床藥物的重要母體。根據其化學結構的不同，生物堿可分為吡咯類、吡啶類、喹啉類和吲哚類等數十種[21]。它們通常包含一個或多個氮原子，其中一個氮原子具有孤對電子，可以作為氫鍵的供體，而其他氮原子或碳原子則可能提供質子，作為氫鍵的受體。這種結構特性使得生物堿能夠與蛋白質形成氫鍵，再加上供體官能團的存在，在抗菌活性和抗毒力兩個方面都具有良好的應用潛力[22]。

1.2 作用機制

1.2.1 抗菌機制

由于植物天然產物結構的多樣性，使之對病原菌具有廣泛的抑菌或殺菌作用。植物天然產物通過直接與細菌的結構蛋白活性位點、代謝相關合成酶甚至核酸相互作用，破壞細菌的基本結構和功能，包括細菌細胞壁、細胞膜、骨架蛋白和核酸等，達到抑制細菌生長或殺死細菌的目的。如兒茶素通過與肽聚糖結合干擾金黃色葡萄球菌細胞壁的生物合成[23]；生物堿小檗堿是一種DNA嵌入劑，通過與核酸結合破壞其結構，從而發揮抗菌活性[24]。

1.2.2 抗毒力機制

除了傳統的抑制細菌生長和繁殖的抗菌藥物外，研究人員正在尋找新的抗菌策略，這些策略專注于細菌的毒力，如黏附、定植、侵襲能力以及導致疾病的毒素和固有結構。這些新型作用靶點旨在在不影響細菌的生長情況下，天然產物小分子通過中和毒素、與毒力相關結構相互作用使之失活，或直接抑制毒力相關基因的轉錄，從而削弱病原菌的毒力。例如生物堿小檗堿已被證明可以抑制大腸埃希菌的腸毒素[25]，這種毒素會導致腹瀉等癥狀。因此，小檗堿被廣泛應用于治療細菌性腹瀉。β-谷甾醇葡萄糖苷不僅能夠抑制細菌生長，還可以通過影響rssAB和hns介導的鞭毛主操縱子flhDC的轉錄，從而抑制EHEC的運動和生物膜形成[26]。

1.3 植物天然產物化學修飾

植物天然產物具有廣泛的抗感染潛力，這歸功于它們復雜的化學結構和多樣的生物活性。然而，這些天然化合物的生物利用度往往限制了它們的臨床應用。為了提高植物天然產物在體內的吸收率和抗感染能力，研究表明可以通過化學修飾來優化它們的物理化學性質。化學修飾的策略包括添加新的官能團、水解或金屬絡合，以增強化合物的溶解性和穩定性。例如植物天然產物通過磷酸化和添加磺酸鹽基團可以增加其酸度，從而提高其在特定環境中的溶解度[27]。這種方法有助于化合物更好地通過生物膜，進入細胞發揮作用。度殼聚糖是一種具有抗氧化和抗菌活性的大分子聚合物。由于酚酸的羥基能夠破壞細胞膜結構，度殼聚糖與酚酸共聚后可以進一步強化其抗菌活性[28]。在木脂素中將羥基轉化為氨基后，可以提高化合物的堿度和親核性，這有助于增強其與細菌細胞壁和細胞膜的相互作用，從而提高抗菌活性[29]。

2 植物天然產物抗EHEC

T3SS和Stx是EHEC定植腸道并引起疾病所必需的兩種關鍵毒力因子，而生物膜是EHEC在環境中持久性定植的重要結構。下文將對抑制EHEC毒力（T3SS、Stx和生物膜）和生長的植物天然產物進行具體綜述。

2.1 抗T3SS

T3SS是由LEE毒力島編碼的一種將細菌效應蛋白注入宿主細胞中的針狀結構。T3SS引起的感染主要特征是黏附抹平損傷（attaching and effacing lesions，AE lesions）。這種損傷的特點是細菌緊密黏附于宿主上皮細胞，并誘導特征性肌動蛋白細胞骨架的重排和微絨毛的消失。這種結構改變了宿主細胞的功能，使得細菌能夠更有效地與宿主細胞相互作用并注入效應蛋白[30-32]。在動物模型中，效應蛋白和T3SS相關組裝蛋白的缺失會顯著降低EHEC在腸道定植和引起疾病的能力[33-34]。植物天然產物小分子能夠抑制T3SS相關基因的轉錄、干擾T3SS相關蛋白的正常組裝和易位，達到削弱細菌黏附和定植的目的。植物天然產物抗EHEC毒力見表1和圖2。

2.1.1 抑制T3SS基因轉錄

柑橘中的檸檬苦素化合物異淋酸和橄欖中的羥基酪醇，能夠有效抑制T3SS相關基因的表達。在EHEC中添加異淋酸后， LEE毒力島基因的轉錄受到顯著抑制。然而異淋酸在ΔqseA缺失株中對T3SS的主調節子ler的抑制得到解除，對缺失株進行原位回補后使之恢復到野生型水平。這說明異淋酸可能以QseA（群體感應調節因子）依賴性方式干擾EHEC的腎上腺素通路，進而抑制T3SS的表達和對Caco-2細胞的黏附。同時此研究發現異淋酸依賴于QseBC雙組分系統發揮抗生物膜作用[35]。多酚類化合物羥基酪醇在不影響細菌生長下，使EHEC的ler的轉錄水平下調至原來的1/3.1，其他基因espA、espB和espD分別下調至原來的1/2.5、1/2.6和1/3.9[36]。

2.1.2 抑制T3SS蛋白組裝和易位

T3SS需要20多種膜結構裝置蛋白和轉運蛋白精確組裝才能正常發揮作用。番石榴提取物以劑量依賴性通過抑制轉運蛋白EspB的易位破壞T3SS的組裝，從而削弱EHEC對細胞的黏附。同時番石榴提取物不會導致EHEC釋放Stx[37]。番石榴提取物富含槲皮素、芹菜素、楊梅素和兒茶素等[38]。綠茶中含量最豐富的表沒食子兒茶素沒食子酸酯，不影響轉運蛋白EspB和提供能量的蛋白EscN的表達，但能夠抑制T3SS的正常組裝和分泌[39]。

2.2 抗Stx

Stx是由λ樣噬菌體編碼的一種細胞外毒素，研究表明EHEC感染的嚴重程度主要取決于Stx2的表達[50-51]。Stx基因的表達主要受到SOS反應的調控。SOS反應是一種細胞應激反應，通常在DNA損傷或其他細胞應激情況下被激活，從而調節毒力基因的表達。Stx通過與宿主細胞膜上的神經酰胺三己糖苷（Gb3）受體特異性結合，經內吞進入細胞質，以核糖體為靶點破壞蛋白質的合成進而導致細胞死亡。正常情況下，Gb3含量最高的是腎臟的微血管腎小球和近端腎小管細胞。因此當Stx通過血流傳播到腎臟時，它可以損害腎內皮細胞并導致微血管系統的阻塞，引起腎臟炎癥，最終可能導致HUS的形成[52]。目前發現的植物天然產物小分子，通過抑制SOS反應削弱Stx基因的表達，或者直接結合Stx使其失活，從而在抗毒力方面發揮作用。

2.2.1 抑制SOS反應減少Stx釋放

SOS反應通過激活RceA蛋白，觸發一系列級聯效應，包括促進噬菌體編碼的cI阻遏蛋白自裂解、噬菌體啟動子的釋放和Stx基因的轉錄激活。肉桂油是一種抗菌香料，其主要活性成分是肉桂醛。研究表明在低于亞MIC濃度下，肉桂醛通過抑制SOS反應來減少Stx2噬菌體的裂解，從而降低Stx的產生并減少其對宿主細胞的毒性[49]。

2.2.2 與Stx結合使其失活

黃芩苷是一種從黃芩中分離的黃酮類化合物，它通過與Stx2結合形成無活性低聚物，保護小鼠免受由Stx2引起的致命攻擊。在針對HUS模型的小鼠實驗中，即使在極低濃度下，黃芩苷也能夠顯著改善小鼠的腎臟損傷和降低小鼠的致死率。血尿素和肌酐通常是腎功能檢測的指標，研究表明這兩個指標在經黃芩苷治療的小鼠與正常小鼠中水平相當，這說明黃芩苷能夠有效保護腎臟功能。研究還發現，通過對Stx2與黃芩苷可能結合的殘基進行突變，可以消除或降低Stx2對黃芩苷的敏感性。這表明黃芩苷的作用機制可能與特定的分子結合位點有關，這些位點的突變會減弱或消除黃芩苷對Stx2的抑制效果[53]。

2.3 抗生物膜

EHEC利用自身產生的胞外多糖在自然環境中的各種表面構建生物膜。這種群落協作形成的物理屏障不僅能夠協助EHEC抵抗外界不良環境，還增強其在體內抵御吞噬和附著于宿主細胞的能力。由此，EHEC能夠在宿主體內實現免疫逃避和維持持續性感染[40，54]。植物天然產物小分子通過抑制菌毛、鞭毛等結構，阻止細菌在非生物表面的附著，或者通過影響群體感應來減少生物膜的產生。

2.3.1 抑制菌毛和鞭毛的表達

細菌的鞭毛和菌毛作為黏附因子，通過介導細菌在表面的初始附著，影響生物膜的形成[55]。植物天然產物通過抑制這些參與生物表面黏附的結構，從而有效減少生物膜的產生。根皮素是一種常見的抗氧化劑，主要存在于蘋果和草莓中。研究表明根皮素在不損害腸道共生大腸埃希菌生物膜的前提下，能夠抑制菌毛基因csgA和csgB的表達，從而有效抑制EHEC的生物膜的產生并緩解患者的炎癥性腸炎[42]。另外，香豆素在不影響細菌正常生長情況下，能夠抑制運動基因flhD、motB和菌毛相關基因的表達，進而阻礙生物膜的產生[45]。

2.3.2 抑制群體感應

群體感應作為一種細胞間的信號傳遞機制，是生物膜形成過程中的關鍵環節。在這過程中EHEC會誘導自誘導劑的分泌，而這種分泌物只有在外環境達到一定濃度時，才能促進生物膜的形成[56]。柚皮素，一種存在于葡萄和多數草藥中的天然化合物，能夠直接抑制群體感應誘導劑AI-2的生成，從而減少生物膜量[45]。此外，普遍存在于紅葡萄酒中的白藜蘆醇，在不影響浮游細胞生長的情況下，通過抑制AI-2合成和其轉運蛋白lsrA的表達，能將生物膜的形成量減少85%[41]。

2.4 抗菌活性

抑制EHEC生長的天然產物見表2，結構式見圖3，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）表示抗菌藥物的抗菌活性指標。植物天然產物主要通過改變EHEC細胞膜的結構和功能，破壞細胞膜的完整性和流動性，或者導致代謝功能紊亂和胞內活性氧（reactive oxide species， ROS）積累，最終引起細菌生長受損或死亡。這些作用機制揭示了植物天然產物在抗菌領域的重要潛力。

2.4.1 破壞細胞膜完整性

細胞膜負責滲透調節、呼吸和運輸過程以及脂質的生物合成，膜完整性是執行這些功能的先決條件。從香草蘭豆莢中提取的香蘭素，因其細胞毒性較低，被認為是一種具有潛力的安全抗菌劑。研究表明香蘭素通過破壞EHEC的細胞膜結構，細胞膜發生去極化引起胞內核酸、蛋白質泄漏以及ATP含量降低，最終導致EHEC難以維持正常的生命活動[57]。OmpA蛋白是維持細菌外膜結構穩定性的關鍵蛋白。然而兒茶素處理EHEC后，OmpA表達量下降。這可能是兒茶素通過作用于EHEC細胞膜，降低其流動性，從而發揮抗菌作用[58]。

2.4.2 干擾細菌基礎代謝平衡

代謝平衡是細菌正常生理活動的基礎。有的植物天然產物通過直接作用于特定的代謝酶，阻礙其活性，進而干擾細菌的正常生長。如肉桂酸乙酯不僅能夠增強EHEC細胞膜的通透性，還可能通過與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶結合，降低該酶活性，從而阻礙磷酸戊糖途徑和NAD（P）H生成，干擾細菌的正常呼吸代謝，最終發揮抑菌作用[62]。ROS能引起細胞大分子的氧化損傷。如果ROS的積累不受控制，則大分子物質會持續氧化導致細胞死亡。野櫻莓中提取的花色素苷在破壞EHEC細胞膜的同時，能夠進入胞內干擾碳水化合物、氨基酸和脂質的代謝，導致內容物聚集，從而誘導ROS積累[58]，介導細菌的損傷和死亡。

3 展望

抗生素的廣泛應用易導致EHEC產生耐藥性，甚至激發其釋放致病的Stx，這使抗EHEC藥物的研發成為一項艱巨的挑戰。植物天然產物因其多樣的結構和生物活性，成為抗感染藥物研發的寶貴資源庫。本文介紹了植物天然產物的分類、作用機制和化學修飾，并總結了能夠抑制EHEC生長和毒力因子的植物天然產物，這對篩選潛在抑制劑具有重要意義。在EHEC中，植物天然產物主要通過破壞細胞膜結構和干擾基礎代謝來抑制其生長和存活。雖然這種作用機制相對單一，但對抑制EHEC的繁殖至關重要。植物天然產物在其他致病菌中表現出更廣泛的作用范圍，包括抑制致病菌核酸的復制、轉錄，以及破壞骨架蛋白功能，從而抑制細菌生長。植物天然產物在對抗EHEC的T3SS、Stx以及生物膜方面，顯示出良好的抗毒力作用，這為預防和治療EHEC感染提供了新的策略和靶點。

參 考 文 獻

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