一種用于動脈粥樣硬化靶向治療的貨物轉換納米材料制備

摘要：為探究同時針對動脈粥樣硬化的內膜異常脂質沉積和炎癥細胞聚集兩種特征的治療方法，通過主客體自組裝方式，設計制備了β-環糊精-雷帕霉素納米材料。體外利用競爭性結合實驗，檢測β-環糊精對雷帕霉素及膽固醇的親和力；誘導小鼠單核巨噬細胞成炎癥細胞，體外檢測β-環糊精-雷帕霉素納米材料對炎癥細胞的抗炎效果及膽固醇清除效果。研究顯示，β-環糊精對膽固醇的親和能力高于雷帕霉素；β-環糊精與膽固醇結合同時釋放雷帕霉素，能夠實現聯合治療動脈粥樣硬化。

關鍵詞：β-環糊精；雷帕霉素；動脈粥樣硬化；膽固醇

中圖分類號：R542.2文獻標志碼：A

收稿日期：2024-03-10

基金項目：

國家自然科學基金重大研究計劃綜合項目（批準號：92249303）資助。

通信作者：

李培峰，男，博士，教授，主要研究方向為心血管疾病的研究。E-mail： peifli@qdu.edu.cn

世界衛生組織統計分析，心血管疾病位居全球人群死亡原因首位。動脈粥樣硬化通常在大中型動脈中形成斑塊，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要病因^[1-4]。目前，針對動脈粥樣硬化治療的臨床解決方案包括手術干預和使用降血脂藥物（如他汀類藥物）、抗血小板藥物（如阿司匹林）等藥物治療^[5-7]。臨床治療費用成本較高，且難以避免導致再狹窄和血栓形成，長期治療可行性較低。藥物治療存在藥物脫靶、溶解度差、生物利用度低、血液循環短、藥物非特異性分布等問題，會導致療效低下、不良反應嚴重等^[8-11]。研究表明，納米藥物遞送系統已廣泛用于疾病的診斷和治療，作為一種能夠靶向遞送的新型潛在“藥物”引起廣泛關注^[12]。β-環糊精毒性低，能增加藥物溶解性，提高藥物穩定性和生物利用度，靶向膽固醇多的動脈粥樣硬化區域。β-環糊精中空的立體圓柱狀結構能使其內部疏水空腔結合疏水小分子形成包合物，并自組裝成納米顆粒^[13]。環糊精由于優先保留疏水分子，從而能根據其親和力切換貨物分子。雷帕霉素是一種疏水性藥物，可降低炎癥，促進自噬、免疫調節和抗血栓等，能有效治療動脈粥樣硬化^[14-18]。本文選定β-環糊精和雷帕霉素，探究兩者組合物針對動脈粥樣硬化的協同治療作用，以期為動脈粥樣硬化疾病提供新治療方法，同時也為納米藥物遞送系統提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用品

β-環糊精（β-CD）、雷帕霉素（RAP）、無水乙醇、磷酸鹽緩沖液（PBS）、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿（DOPC）、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷酸乙醇胺-n-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG）、羅丹明B（Rho B）、卵磷脂、4%多聚甲醛、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、NBD-膽固醇、胎牛血清（FBS）、DMEM培養基、青霉素、鏈霉素、脂多糖（LPS）、2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、TRIzol試劑、氯仿、異丙醇、二甲基亞砜（DMSO）。

1.2 β-環糊精-雷帕霉素納米材料（β-CD-RAP NMs）的制備方法

因其立體中空圓筒狀分子結構，β-CD具有外部親水、內部親脂的特性，故能和脂類藥物RAP形成包合物。因此，通過主-客體作用介導的自組裝方法制備包合β-CD和RAP的納米材料。β-CD和RAP同時溶解于無水乙醇中，混合至最終濃度分別為30 mmol和5 mmol。輕輕攪拌溶液30 min，真空下完全干燥1 h，使用1 mL PBS再水化，得β-CD-RAP絡合物。用磷脂包裹β-CD-RAP絡合物，脂質膜由DOPC和DSPE-PEG組成（圖1）。

制備熒光β-CD-RAP NMs時，2 mg Rho B與50 mg載體材料共溶于3 mL水溶劑中。6 mg卵磷脂和9 mg DSPE-PEG分散置于0.6 mL無水乙醇中。分散液中加入15 mL去離子水，加熱至65℃恒溫1 h。預熱的脂質水溶液滴入含有熒光染料和載體材料的溶液中，渦旋3 min。再孵育2 h后，以15 000 r離心除去剩余有機溶劑和水。重懸于10 mL去離子水中，15 000r離心10 min，去離子水洗滌3次后，收集所得熒光β-CD-RAP NMs。

1.3 競爭性結合試驗

制備完的β-CD-RAP絡合物與膽固醇聚集物（5 mmol且含2% NBD-膽固醇）于37 ℃下孵育1、6、12 h，使其相互作用，再用PD-10脫鹽柱洗脫。96孔板中收集含有溶解膽固醇和RAP藥物的洗脫液。通過測定NBD-膽固醇的熒光（激發480 nm、發射530 nm）和RAP的吸光度（278 nm）計算膽固醇和RAP含量。

1.4 β-CD-RAP NMs載藥量相關表征

稱取5 mg RAP，溶于50 mL DMSO溶液中，得100 μg/mL原液，原液梯度稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 μg/mL的標準溶液，記錄不同濃度下278 nm處吸光度，根據吸光度建立RAP標準曲線。β-CD-RAP NMs載藥量（%）和包封率（%）計算表達式分別為：β-CD-RAP NMs中RAP的藥物量/β-CD-RAP NMs的質量×100%；β-CD-RAP NMs中RAP的藥物量/實際使用RAP的質量×100%。

RAW 264.7細胞接種于6孔板中，每孔5 × 10⁴個細胞，置于DMEM培養基中過夜。加入β-CD-RAP NMs直至RAP終濃度為5 μg/mL，孵育不同時間（0.5、1、2、4、8、12、16、20、24 h）后，用PBS洗去未進入細胞內的β-CD-RAP NMs。加入組織蛋白提取液，離心后，去上清，測定RAP濃度。

1.5 細胞實驗

1.5.1 細胞培養及炎癥細胞構建 小鼠單核巨噬細胞（RAW 264.7）源自中國長沙湘雅細胞中心。培養基為DMEM + 1%青霉素-鏈霉素溶液 + 10%胎牛血清。RAW 264.7細胞置于恒溫常氧培養箱中培養。

使用不同濃度LPS及不同時間處理的RAW 264.7細胞，探尋誘導炎癥細胞的最佳濃度和時間。通過實時熒光定量PCR，檢測RAW 264.7細胞內相關炎癥因子mRNA表達水平。

1.5.2 體外細胞攝取β-CD-RAP NMs RAW 264.7細胞接種于6孔板中，每孔5×10⁴個細胞，置于DMEM培養基中過夜。加入Rho B標記的熒光β-CD-RAP NMs孵育不同時間（0.5、1、4、6 h）。去除細胞培養基后，用PBS洗滌細胞3次。經熒光β-CD-RAP NMs孵育和PBS洗滌后，收集細胞，懸浮于PBS中完成流式細胞術分析。

RAW 264.7細胞接種于6孔板中，每孔5 × 10⁴個細胞，置于DMEM培養基中，過夜。加入Rho B標記的熒光β-CD-RAP NMs孵育不同時間（0、4、6 h）。去除細胞培養基，用PBS洗滌細胞3次。使用4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS沖洗細胞，以去除未攝取的熒光β-CD-RAP NMs。用DAPI染色細胞核，避光染色15 min，再次用PBS沖洗細胞，加入1 mL DMEM培養基避光保存，于普通倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5.3 細胞毒性試驗 RAW 264.7細胞接種于96孔板中，每孔1.0 × 10⁴個細胞。細胞置于恒溫常氧培養箱中，37℃下孵育24 h。使用不同劑量的含有β-CD-RAP NMs培養基處理細胞。孵育12 h后，采用CCK-8法測定細胞活力。酶標儀測定450 nm處的吸光值以評估細胞活力，表達式為：細胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100。

1.5.4 細胞內膽固醇溶解測定 RAW 264.7細胞接種于48孔板中，每孔2 × 10⁴個細胞。用NBD-膽固醇處理RAW 264.7細胞24 h。徹底洗滌細胞，用β-CD-RAP NMs、β-CD和RAP處理24 h。收集上清液，加入200 μL DMSO裂解細胞并溶解細胞內NBD-膽固醇。使用SpectraMax Gemini XPS酶標儀測量并計算上清液和裂解細胞溶液中NBD-膽固醇的含量。

1.5.5 細胞內活性氧清除活性 RAW 264.7細胞接種于6孔板中，每孔5 × 10⁴個細胞。對照組細胞置于培養基中，不做任何處理，實驗組用1 000 ng/mL LPS處理細胞24 h后。對照組分別加入游離RAP和β-CD-RAP NMs，孵育6 h。用PBS洗滌后，加入1 mL DCFH-DA工作液，37℃細胞培養箱避光孵育30 min。用無血清培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。熒光圖像采用倒置熒光顯微鏡系統拍攝，定量強度采用流式細胞儀測定。

1.5.6 體外抗炎作用 RAW 264.7細胞經LPS、LPS+RAP、LPS+β-CD-RAP NMs處理后，用ELISA測定培養上清液中的各種炎癥因子的表達水平。

1.6 統計分析

數據以均數±標準差（SD）表示。多組數據采用單因素方差分析，兩組數據采用student t檢驗。所有分析均以P lt; 0.05表示有統計學意義（、、分別表示Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001）。

2 實驗結果

2.1 β-CD-RAP NMs表征

透射電子顯微圖像顯示β-CD-RAP NMs大小為90 nm左右，呈球形，有一層脂質涂層（圖2（a））。動態光散射測量顯示，β-CD-RAP NMs平均尺寸為110 nm（圖2（b）），為材料的水合粒徑；去離子水中β-CD-RAP NMs均表現顯著的負Zeta電位值（圖2（c））。圖2（d）顯示37°C下，β-CD-RAP NMs置于三種不同溶劑（H2O、PBS、含有10%血清的PBS）中，25 h內其水合粒徑沒有明顯變化，表明制備的β-CD-RAP NMs穩定性良好。競爭性結合實驗結果顯示，β-CD-RAP NMs與膽固醇于37℃下孵育1 h后，主要以RAP洗脫為主，而膽固醇的洗脫量未有明顯增加；隨時間推移，膽固醇的洗脫量明顯增加，而RAP的洗脫量明顯減少（圖2（e））。上述結果表明，膽固醇存在情況下，β-CD-RAP NMs中β-CD預裝載的RAP轉變成膽固醇，從而有效釋放RAP和消耗膽固醇，以治療動脈粥樣硬化（圖2（f））。

2.2 β-CD-RAP NMs載藥量及體外釋放率

經過紫外分光光度計處測得278 nm處的不同劑量RAP/DMSO（0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL）的吸光度分別為0.043、0.089、0.173、0.342、0.677、1.35、2.64，該標準曲線線性回歸方程為y=0.0529x+0.0086（圖3（a），R²=0.9999）。稱取凍干1 mg β-CD-RAP NMs 溶于10 mL DMSO中，測得吸光度為16.57，計算RAP含量為0.313 mg，載藥量為31.3%，包封率為89.7%。β-CD-RAP NMs藥物釋放實驗表明，隨著時間增加，β-CD-RAP NMs中RAP釋放量逐漸上升，24 h內累計釋放量超過75%（圖3（c））。

2.3 炎癥細胞的構建

利用不同濃度LPS（0、10、100、1 000 ng/mL）作用不同時間（12、24、36、48 h），誘導RAW 264.7細胞成為炎癥細胞，檢測細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、OPN的分泌。LPS誘導濃度范圍設定為10～1 000 ng/mL，探尋不同濃度下細胞內炎癥因子的表達水平。圖4中，經1 000 ng/mL LPS處理后，細胞內炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、OPN的表達明顯升高。處理細胞的LPS濃度固定為1 000 ng/mL，探尋最佳誘導時間。由圖5可知，1 000 ng/mL LPS誘導RAW 264.7細胞24 h，相較于12、36、48 h，細胞內炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、OPN的表達明顯升高。最終篩選確定構建RAW 264.7細胞炎癥模型的最適LPS濃度為1 000 ng/mL，處理時間為24 h。

2.4 體外RAW 264.7細胞攝取β-CD-RAP NMs

RAW 264.7細胞分別與不同劑量β-CD-RAP NMs（0.05、0.5、5 μg/mL）孵育12 h后，相較于對照組，細胞活力略微降低（圖6（a））。通過流式細胞術和熒光成像技術研究RAW 264.7細胞中β-CD-RAP NMs的攝取行為。為方便觀察，β-CD-RAP NMs用紅色熒光Rho B標記，細胞核用DAPI染成藍色。圖6（b）、（c）顯示，隨孵育時間推移，β-CD-RAP NMs的內化增強，說明β-CD-RAP NMs能靶向進入RAW 264.7細胞。圖6（d）中，RAW 264.7細胞內熒光信號明顯。隨孵育時間增加，RAW 264.7細胞熒光信號增強，β-CD-RAP NMs的細胞內化與孵育時間成正比，這與流式細胞術結果一致。這是在β-CD的作用下，β-CD-RAP NMs能夠靶向至膽固醇含量多的動脈粥樣硬化區域，通過細胞內吞作用越過細胞膜進入細胞內部。

2.5 β-CD-RAP NMs對RAW 264.7細胞中的膽固醇清除及抗炎反應

熒光膽固醇預處理的RAW 264.7細胞分別用β-CD-RAP NMs、β-CD、RAP處理24 h。通過β-CD-RAP NMs處理顯著減少了細胞內膽固醇的含量并增加了上清液膽固醇的含量，這與β-CD處理相似（圖7（a）～（b））。上述結果表明，β-CD-RAP NMs可通過摻入的β-CD有效清除細胞外和細胞內膽固醇。

圖7（c）、（d）顯示，相較于對照組，LPS刺激的RAW 264.7細胞內活性氧水平較高，而游離RAP處理后活性氧水平明顯減弱，且β-CD-RAP NMs處理后活性氧信號更弱，這可能是由于β-CD-RAP NMs介導的細胞內遞送。研究表明，細胞內積累的活性氧可激活一系列信號轉導級聯，刺激炎癥，促進動脈粥樣硬化發展^[19]。圖7（e）～（h）顯示，與對照組相比，LPS處理的RAW 264.7細胞中炎癥因子如TNF-α、IL-1β、和IL-6顯著上調表達，OPN略微上調表達。而游離RAP與LPS處理的RAW 264.7細胞孵育后可一定程度抑制細胞內炎癥因子的表達。與游離RAP相比，β-CD-RAP NMs與LPS處理的RAW 264.7細胞孵育后能夠顯著抑制細胞內炎癥因子的表達，表明β-CD-RAP NMs具有強大的抗炎活性。綜上，β-CD-RAP NMs可有效降低細胞內活性氧水平，降低炎癥細胞中炎癥因子表達，用于治療動脈粥樣硬化。

3 討論

動脈粥樣硬化作為一種大動脈的炎癥性疾病，發病機制復雜。炎癥假說作為動脈粥樣硬化發病機制的諸多假說之一，一直備受關注。動脈粥樣硬化是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，病程發展始終伴隨炎癥反應。因此，抑制炎癥可作為對抗動脈粥樣硬化病變的一種治療策略。

目前，大量研究報道稱β-CD已廣泛應用于生物醫學領域，可促進膽固醇溶解，作為動脈粥樣硬化的新藥具有廣闊應用前景。研究發現，β-CD可誘導小鼠和兔的動脈粥樣硬化消退，但需要非常高劑量的給藥^[20]。因此，研究納米材料系統靶向遞送藥物至富含膽固醇的微環境對治療動脈粥樣硬化非常關鍵。本研究設計并制備了具有靶向到富含膽固醇區域的β-CD-RAP NMs，用于遞送RAP，并通過細胞實驗進行驗證。體外細胞實驗表明，β-CD-RAP NMs細胞攝取具有時間依賴性。通過CCK-8實驗說明，β-CD-RAP NMs對RAW 264.7細胞毒性很低。膽固醇清除實驗中，經β-CD-RAP NMs處理顯著減少了細胞內膽固醇并增加了上清液膽固醇。炎癥實驗中，游離的RAP和β-CD-RAP NMs對LPS誘導的RAW 264.7細胞產生的炎癥因子：IL-1β、TNF-α、IL-6、OPN均有抑制作用，且β-CD-RAP NMs的抗炎效果優于游離的RAP。本研究僅初步表明β-CD-RAP NMs通過調節細胞內膽固醇水平和降低細胞內炎癥因子的表達以抑制動脈粥樣硬化，但尚未探討β-CD-RAP NMs對ApoE^-/-小鼠的治療效果。

4 結論

本研究通過材料基本表征及體外細胞實驗，發現由β-CD和疏水性藥物RAP自組裝形成的β-CD-RAP NMs可靶向至動脈粥樣硬化的膽固醇區域，在富含膽固醇的動脈粥樣硬化微環境中釋放低親和力RAP，并清除微環境中高親和力的膽固醇。二者組合物是通過影響膽固醇水平及抑制細胞內相關炎癥因子表達進而抑制動脈粥樣硬化。今后將探索ApoE^-/-小鼠體內β-CD-RAP NMs的生物安全性及治療效果。

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Preparation of Cargo Conversion Nanomaterials for Targeted Therapy of Atherosclerosis

YANG Xiao， FU Qin-rui， LI Pei-feng

（Institute for Translational Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

Abstract： β-cyclodextrin-rapamycin nanomaterials were designed and prepared by host-guest self-assembly to explore a therapeutic approach targeting both abnormal lipid deposition and inflammatory cell aggregation in the intima of atherosclerosis. The affinity of β-cyclodextrin to rapamycin and cholesterol was tested by competitive binding assay in vitro. At the same time， RAW 264.7 cells were induced to become inflammatory cells， and the anti-inflammatory and cholesterol scavenging effects of β-cyclodextrin-rapamycin nanomaterial on inflammatory cells were detected in vitro. Studies show that β-cyclodextrin has a higher affinity for cholesterol than rapamycin. β-cyclodextrin binds to cholesterol and simultaneously releases rapamycin， which can realize the combined treatment of atherosclerosis.

Keywords： β-cyclodextrin; rapamycin; atherosclerosis; cholesterol