丁酸鈉對脂多糖聯合D-氨基半乳糖誘導小鼠急性肝損傷的保護作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討丁酸鈉 （NaB） 脂多糖 （LPS） 聯合D-氨基半乳糖 （D-Gal） 誘導小鼠急性肝損傷的保護作用，并闡明其作用機制。方法：30只雄性昆明小鼠隨機分為對照組、模型組和NaB組，每組10 只。NaB 組小鼠給予200 mg·kg-1·d-1 NaB，對照組和模型組小鼠給予等體積無菌水。模型組和NaB 組小鼠腹腔注射20 μg·kg-1 LPS 和600 mg·kg-1 D-Gal 誘導建立小鼠急性肝損傷模型。檢測各組小鼠體質量和肝臟質量，計算肝臟指數。HE 染色觀察各組小鼠肝臟組織病理形態表現，試劑盒檢測各組小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT） 和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST） 活性及肝臟組織中總超氧化物歧化酶（T-SOD） 和過氧化氫酶（CAT） 活性及丙二醛（MDA） 水平，Western blotting 法檢測各組小鼠肝臟組織中核因子E2相關因子2（Nrf2）和血紅素加氧酶1（HO-1）蛋白表達水平。結果：各組小鼠體質量比較差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）；與對照組比較，模型組小鼠肝臟指數明顯升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，NaB 組小鼠肝臟指數明顯降低（Plt;0. 01）。HE 染色觀察，對照組小鼠肝臟組織結構正常，肝細胞邊界清晰、大小一致，圍繞中央靜脈呈放射狀均勻排列，且核位于細胞中央；模型組小鼠可見肝細胞排列紊亂，細胞腫脹，多發灶狀肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤及出血；與模型組比較， NaB 組肝細胞形態結構得到改善， 炎癥浸潤減少。與對照組比較， 模型組小鼠血清中ALT 和AST 活性均明顯升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，NaB 組小鼠血清中ALT 和AST 活性均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。與對照組比較，模型組小鼠肝臟組織中T-SOD 和CAT 活性均明顯降低（Plt;0. 01），MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，NaB 組小鼠肝臟組織中T-SOD 和CAT 活性均明顯升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01），MDA 水平明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting法檢測，與對照組比較， 模型組小鼠肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）； 與模型組比較，NaB組小鼠肝臟組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平均明顯升高 （Plt;0. 01）。結論：NaB對LPS/D-Gal誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與NaB 上調肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達和增加抗氧化酶活性，進而減輕肝臟氧化應激水平有關。

［關鍵詞］ 丁酸鈉； 急性肝損傷； 氧化應激； 核因子E2 相關因子2； 血紅素加氧酶1

［中圖分類號］ R459. 3 ［文獻標志碼］ A

肝硬化、病毒性肝炎和肝癌等肝臟疾病每年造成200 余萬人死亡， 占全球死亡人數的4% ［1］。急性肝損傷是指由感染、酒精中毒和藥物等多種因素導致的急性肝臟功能損害及肝細胞壞死， 是肝臟疾病的重要誘因［2］。急性肝損傷發展迅速，診治不及時可導致急性肝衰竭， 危及患者生命。急性肝損傷持續性發生將轉變為慢性肝損傷， 進一步導致肝硬化和肝癌。肝損傷是一個發病率和死亡率較高的世界性健康問題，目前除肝移植外，尚無有效的治療方法， 受肝臟供體的限制， 僅有少部分患者接受了有效的治療［3-4］。因此，探索安全、天然和有效的急性肝損傷防治藥物具有重要意義。丁酸鈉（sodium butyrate， NaB） 為天然存在的短鏈脂肪酸鹽， 是大纖維食物經細菌發酵的主要代謝產物， 結構簡單且不良反應少，具有腸道屏障功能保護、抑制炎癥和抗氧化等作用， 開發應用前景良好［5-7］。近期有研究［8-9］ 證實NaB 在肝功能保護方面具有潛能。研究［10］ 顯示：氧化應激是誘發肝損傷的主要病理過程之一。肝細胞壞死會隨著過氧化氫酶（catalase， CAT） 和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）等抗氧化酶活性的降低而惡化。因此， 抑制氧化應激可以成為緩解急性肝損傷的靶標。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 聯合D- 氨基半乳糖（D-galactosamine， D-Gal） 可造成肝細胞變性壞死， 其建立的小鼠急性肝損傷模型與人類急性肝損傷的病理特征相似， 常用于探索肝損傷機制和潛在防治藥物。核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 是一種重要的轉錄因子， 是改善不同氧化應激和炎癥相關疾病所必需的細胞因子［11］。血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1） 是一種可誘導的酶，對暴露于多種刺激， 如病毒和細菌產物， 包括LPS、細胞因子、癌基因、絲裂原及生長因子，所引起的炎癥過程和氧化組織損傷具有保護作用。Nrf2 是HO-1 表達的主要激活劑［ 12］。研究［ 13］顯示： 上調Nrf2 蛋白表達可增強相關抗氧化酶的活性， 從而改善急性肝損傷。研究［14］ 表明：NaB 通過促進Nrf2 的表達刺激下游抗氧化酶的轉錄， 從而有助于改善高脂肪飲食誘導的氧化應激。因此，本研究通過LPS/D-Gal 誘導構建急性肝損傷小鼠模型， 探討NaB 對急性肝損傷小鼠的影響，并從氧化應激的角度闡明其可能的機制， 為NaB開發利用及急性肝損傷防治奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器 30只雄性昆明小鼠，體質量（20±2） g，購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK （湘）2019-001。NaB 購于美國Sigma-Aldrich 公司，血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartateaminotransferase， AST）、總 SOD （total SOD，T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA） 和CAT 試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，Nrf2 和HO-1 購于武漢三鷹生物技術有限公司，β-actin 購于杭州華安生物技術有限公司，兔二抗購于美國Abclonal 公司，鼠二抗購于武漢亞科因生物技術有限公司。電泳儀電源購于北京六一儀器廠，凝膠成像儀購于上海天能科技有限公司，酶標儀購于美國Bio-Tek 儀器有限公司。

1. 2 實驗動物分組和模型制備 30雄性昆明小鼠隨機分為對照組、模型組和NaB 組， 每組10 只，常規飼料喂養，自由飲水，12 h 光/暗循環。各組小鼠均采用灌胃給藥方式，NaB 組小鼠給予200 mg·kg-1·d-1 NaB［15］， 對照組和模型組小鼠給予等體積無菌水，持續灌胃7 周。末次給藥1 h 后，模型組和NaB 組小鼠腹腔注射20 μg·kg-1 LPS 和600 mg·kg-1 D-Gal 誘導建立小鼠急性肝損傷模型［16］。實驗過程中，每周測定小鼠體質量，密切觀察小鼠狀態。取各組小鼠肝臟組織，稱量肝臟質量，計算各組小鼠肝臟指數。肝臟指數=小鼠肝臟質量（g） /小鼠體質量（g）。

1. 3 HE 染色觀察各組小鼠肝臟組織病理形態表現 將4% 多聚甲醛固定的肝臟組織脫水并包埋于石蠟塊中，制備5 μm 厚的切片，用蘇木精和伊紅處理小鼠肝臟組織，切片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理形態表現。

1. 4 試劑盒檢測各組小鼠血清中ALT和AST活性 模型小鼠建立6 h 后麻醉，采用眼球摘除法收集小鼠血液樣本，分離血清，參照生化試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中ALT 和AST 活性。

1. 5 試劑盒檢測各組小鼠肝臟組織中 T-SOD 和CAT活性及MDA水平 取各組小鼠肝臟組織，按照1∶ 9 的比例將小鼠肝臟組織與預冷生理鹽水混合勻漿，2 500 r·min-1 離心10 min，取上清，采用試劑盒檢測各組小鼠肝臟組織中T-SOD 和CAT 活性及MDA 水平。

1. 6 Western blotting法檢測各組小鼠肝臟組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平 取小鼠冷凍肝臟組織20 mg，提取組織總蛋白。樣品通過SDS-PAGE 分離， 切出含有靶蛋白和內參的凝膠并轉印。將PVDF 膜于5% 脫脂奶粉中封閉，并于4 ℃下與一抗孵育過夜，室溫孵育二抗1～2 h，ECL 顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 7 統計學分析 采用 SPSS 26. 0統計軟件進行統計學分析。各組小鼠體質量和肝臟指數，血清中ALT 和AST 活性，肝臟組織中T-SOD 和CAT 活性及MDA 水平，肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均符合正態分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組小鼠體質量和肝臟指數 各組小鼠體質量比較差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。與對照組比較， 模型組小鼠肝臟指數明顯升高（Plt;0. 01）。與模型組比較，NaB 組小鼠肝臟指數明顯降低（Plt;0. 01）。見表1。

2. 2 各組小鼠肝臟組織病理形態表現 對照組小鼠肝臟組織結構正常， 肝細胞邊界清晰、大小一致，圍繞中央靜脈呈放射狀均勻排列，且核位于細胞中央。模型組小鼠可見肝細胞排列紊亂，細胞腫脹，多發灶狀肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤及出血。與模型組比較，NaB 組肝細胞形態結構得到改善，炎癥浸潤減少。見圖1。

2. 3 各組小鼠血清中 ALT 和 AST 活性 與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT 和AST 活性均明顯升高（Plt;0. 01）。與模型組比較， NaB 組小鼠血清中ALT 和AST 活性均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表2。

2. 4 各組小鼠肝臟組織中 T-SOD和 CAT活性及MDA水平 與對照組比較，模型組小鼠肝臟組織中T-SOD 和CAT 活性均明顯降低（Plt;0. 01），MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）。與模型組比較，NaB 組小鼠肝臟組織中T-SOD 和CAT 活性均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），MDA 水平明顯降低（Plt;0. 01）。見表3。

2. 5 各組小鼠肝臟組織中 Nrf2和 HO-1蛋白表達水平 與對照組比較，模型組小鼠肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較， NaB 組小鼠肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖2。

3 討 論

肝臟在調節新陳代謝、體內平衡和免疫活動方面發揮重要作用。LPS 作為一種經典的內毒素，可誘導肝細胞凋亡和壞死。D-Gal 是一種氨基糖，是抑制肝細胞中RNA 和蛋白質合成的肝毒性物質之一，可導致肝損傷。D-Gal 可特異性地增強肝臟對LPS 細胞毒性作用的敏感性，促進急性肝損傷的發生發展［17］。本研究結果顯示：與對照組比較，模型組小鼠肝臟指數明顯升高，血清中ALT 和AST 活性明顯升高，出現明顯細胞結構紊亂、壞死及炎癥細胞浸潤，提示急性肝損傷模型構建成功；與模型組比較，NaB 組小鼠肝臟指數明顯降低，且NaB 明顯改善了廣泛的細胞壞死和炎癥細胞浸潤。ALT 和AST 是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉移的酶， 當肝細胞受損時，ALT 和AST 由肝細胞釋放至血液中， 導致血清中ALT 和AST 活性升高。AST 和ALT 的血清活性已被公認為肝臟組織損傷的敏感血清學指標， 其異常升高可引起肝細胞損傷和壞死［18］。NaB 干預后， 因腹腔注射LPS/D-Gal 小鼠血清中ALT 和AST 活性明顯降低，提示NaB 可有效緩解急性肝損傷。

氧化應激與急性肝損傷的發病有密切關聯，抑制氧化應激可能是急性肝損傷發展的潛在預防措施［19］。SOD 與CAT 的功能相互關聯，均可通過直接清除氧自由基發揮肝細胞保護作用。MDA 是脂質過氧化的最終產物，MDA 水平可提示肝臟氧化損傷的程度［20］。研究［21］ 顯示：NaB 可通過提高抗氧化穩定性改善奶山羊亞急性瘤胃酸中毒。研究［22］發現：NaB 干預可減輕過氧化氫引起的氧化損傷，升高細胞中SOD 和CAT 等抗氧化酶活性，明顯降低活性氧（resctive oxygen species，ROS） 和MDA水平。本研究結果顯示：經過NaB 的干預，腹腔注射LPS/D-Gal 的急性肝損傷小鼠MDA 水平升高和CAT 及T-SOD 活性降低的情況被逆轉。提示NaB具有抗氧化應激活性， 有助于清除ROS， 從而減輕急性肝損傷的嚴重程度。

抗氧化應激的機制是目前研究的熱點，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、沉默調節蛋白1（silent information regulator protein 1， SIRT1） /Nrf2、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） - 蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）、Akt/叉頭框蛋白O1 （orkhead box proteinO1，FoxO1） 和Nrf2/HO-1 等通路受到廣泛關注，其中，Nrf2/HO-1 通路作為人體最關鍵的內源性防護系統之一，在保護機體免受氧化應激過程中發揮關鍵作用。在無應激條件下， Nrf2 在蛋白酶體中以Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1 （Kelch-likeECH-associated protein 1，Keap1） 依賴性方式不斷泛素化和降解。在氧化條件下，Keap1 中關鍵半胱氨酸殘基被共價修飾， 阻止其介導Nrf2 泛素化，新合成的Nrf2 可以積累并轉移至細胞核中，與肌腱膜纖維肉瘤蛋白（musculoaponeurotic fibrosarcomaprotein，MAF） 蛋白二聚化，以促進細胞保護基因的轉錄。Nrf2 缺乏會加重小鼠原代肝細胞中ROS 的積累［23］。Nrf2/HO-1 信號傳導在多種肝臟疾病中的關鍵作用已被證實，包括非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病和肝缺血再灌注損傷等［24-25］。TANG 等［26］研究發現：NaB 通過促進糖原合成酶激酶3 β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β） /Nrf2 信號通路和線粒體功能，防止高脂肪飲食誘導的肥胖大鼠的氧化應激。LUO 等［27］ 研究發現： NaB 通過G 蛋白偶聯受體43 （G protein coupled receptor 43，GPR43） /β 抑制蛋白2（β-arrestin-2） /核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 信號通路部分減少炎癥反應，明顯減輕了LPS 誘導的肝損傷。本研究結果顯示：與對照組比較，急性肝損傷小鼠肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低，NaB 干預可明顯上調Nrf2 和HO-1 蛋白表達。

綜上所述，NaB 對LPS/D-GalN 誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用， 其作用機制可能與NaB上調肝臟組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達和減少肝臟氧化損傷，進而增加抗氧化酶活性有關。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：龍毅參與研究設計、實驗質量控制和論文撰寫，游子怡參與實驗操作、數據收集和統計學分析，譚秀英參與研究設計和實驗質量控制，張柔參與實驗數據收集和文獻檢索，張鈺浛參與實驗操作和數據收集整理，楊麗娜參與研究設計、實驗質量控制和論文審校。

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