基于16S rRNA測序的植茶溫室土壤細菌多樣性及群落結構研究

摘要：為了明確溫室栽培模式對茶園土壤細菌多樣性和群落結構的影響，找尋溫室栽培、露天栽培模式之間的差異指示種，以更科學地為管理溫室茶園提供理論依據。采用NovaSeq 6000高通量測序技術，以及主坐標分析（PCoA）、置換多元方差分析（Adonis）及LEfSe等分析方法對不同栽培模式茶園土壤細菌多樣性及群落結構進行研究。結果表明，16S rRNA測序質控后，土壤樣品總共獲得操作分類單元（OTU）數量為11 137個（497 556條有效序列）。3個處理間共同含有200個OTU，溫室間共同含有495個OTU。茶園土壤細菌主要優勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等。ACE指數、Chao1指數、Simpson指數與Shannon指數等α多樣性指數均以露天栽培模式極顯著高于溫室。PC1和PC2主成分貢獻率分別為65.10%、21.55%，共解釋了86.65%（R2=0.612，P=0.001）的信息。露天栽培處理差異指示種為酸桿菌門（Acidobacteriota）、Acidobacteriae等。溫室處理指示種為羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）等。以上研究結果為從微生物水平上研究溫室栽培模式對茶園土壤生態質量的影響提供了參考。

關鍵詞：溫室；茶園；土壤細菌；α多樣性；β多樣性；群落結構；高通量測序

中圖分類號：S182；S571.106" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0235-06

茶樹設施栽培技術為一種新型的可控性相對較高的茶樹栽培管理模式，可提早開采名優綠茶的時間，降低茶樹免受霜凍、“倒春寒”等危害［1］。智能玻璃溫室為結合了現代計算機及傳統農業的現代化農業生產設施。細菌、真菌和放線菌等茶園土壤微生物是茶園生態系統的重要組成部分。在數量上，茶園土壤的主要微生物為細菌。溫室栽培土壤與露天栽培土壤微生物群落結構存在明顯的差異，如孫曉東等曾在溫室土壤中分離得到3個我國新記錄種［2］。茶園土壤細菌數量受到多種因素的影響，包括植茶年限、種植模式、農業管理方式以及季節變化等［3-13］。當前，茶園土壤細菌群落的研究主要集中于不同土壤類型、不同農業措施的影響等方面，尚未見玻璃溫室栽培對茶園細菌群落結構及多樣性影響的報道［14-21］。土壤微生物可直接或間接影響土壤理化性質以及生物特性［22］。探索土壤中微生物的多樣性、群落結構，闡明農作物基于不同農業種植模式的土壤環境質量以及功能結構差異的發生機制已成為近年來的研究熱點。

本研究采用高通量測序技術，研究玻璃溫室下茶園土壤細菌多樣性和群落結構，闡明溫室栽培模式下土壤細菌群落結構的差異，旨在為溫室栽培茶園土壤生態環境改善和茶園施肥管理技術提供數據支撐以及理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建省福安市社口鎮（119°57′E，22°22′N）。溫室坐北朝南，長、寬分別為21、18 m。溫室北端用隔斷隔開，并從東向西依次設立6個玻璃小室（3 m×3 m）；露天茶園位于溫室南端。溫室內外種植茶樹品種為金牡丹，單行雙株條栽種植，行、株距分別為1.50、0.33 m，培肥管理一致。試驗地屬于亞熱帶海洋性季風氣候，海拔91 m，年均氣溫13.4～20.2 ℃，年均降水量1 250～2 350 mm，無霜期235～300 d。溫室外土壤有機質含量1.20%，硝態氮含量27.42 mg/kg，銨態氮含量2.72 mg/kg。溫室內土壤有機質含量1.13 %，硝態氮含量377.60 mg/kg，銨態氮含量201.28 mg/kg。

1.2 試驗設計及采樣方法

試驗按露天A（X）、溫室B（18 m×18 m，Y）、溫室C（3 m×3 m，Y）栽培模式設置3個處理。2022年9月，取0～20 cm耕層土壤（五點采樣法），將土壤混勻剔雜，存于-80 ℃超低溫冰箱，重復3次，用于后續土壤 DNA的提取。

1.3 DNA提取及高通量測序

土壤總DNA采用試劑盒提取。PCR上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAATC-3′。 DNA及PCR擴增產物質檢測量：1%、2%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物回收質檢后，采用Illumina NovaSeq 6000平臺進行測序。

1.4 數據分析

采用 Trimmomatic v0.33、Cutadapt 1.9.1軟件及QIIME2 2020.6中的dada 2方法等對測序所得原始數據進行過濾、引物識別與去除、去噪。OTU聚類采用RDP classifier貝葉斯算法（97%相似水平），隨后對OTU的代表序列作物種注釋并計算相對豐度。α多樣性、β多樣性評估使用QIIME2 2020.6軟件。采用SPSS 19.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同栽培模式土壤OTU分布

測序質控后，9個土壤樣品總共獲得497 556條有效序列（OTU數為11 137）。本研究中的3組處理覆蓋度為99.97%，稀疏曲線（圖 1）漸趨平緩，表明各樣本測序量充分，達到了較好的反映細菌群落的種類與數量的程度。

2.2 不同栽培模式土壤Venn圖

由圖2可知，露天A共有6 674個OTU，溫室B共有3 724個OTU，溫室C共有4 298個OTU。3個處理間共同含有200個OTU，溫室間共同含有495個OTU。露天栽培特有4 978個OTU，溫室B栽培特有2 432個OTU，溫室C特有2 886個OTU。

2.3 不同栽培模式土壤細菌群落結構

提取OTU代表序列（97%相似水平）進行分類學分析（RDP classifier貝葉斯算法），結果（圖3）表明，不同栽培模式土壤細菌門水平主要優勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）等。酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）等在露天栽培茶園土壤中相對豐度較高；放線菌門（Actinobacteria）、髕骨細菌門（Patescibacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等在溫室栽培茶園土壤中相對豐度較高。在綱水平上，優勢菌群為酸桿菌綱、放線菌綱、γ-變形菌綱等。

2.4 不同栽培模式的土壤細菌α多樣性分析

α多樣性指數（QIIME2 2020.6軟件）結果（表1）表明，不同栽培模式Chao1指數差異顯著，露天A極顯著最高（Plt;0.01），溫室B顯著最低（Plt;0.05），溫室間差異顯著。ACE指數與Chao1指數在不同處理間表現的趨勢一致，表明露天A的物種總數顯著最多。Simpson指數、Shannon 指數均以露天A極顯著高于溫室，溫室間差異不顯著。

2.5 不同栽培模式土壤細菌β多樣性分析

2.5.1 不同栽培模式土壤細菌群落的主坐標分析

為探究不同栽培模式間土壤細菌群落結構差異，對土壤細菌群落進行PCoA和Adonis分析（基于weighted_unifrac），結果（圖4）表明，PC1和PC2 2個主成分貢獻率分別為65.10%、21.55%，共解釋了86.65%（R2=0.612，P=0.001）的信息，3種栽培模式均在模式間能很好地聚在一起，且不同模式之間能較好地分開。露天A分布在PC1的負軸，溫室B、C均分布在PC1的正軸。溫室處理圍繞PC2軸完全分開，溫室B分布在PC2的負軸，溫室C分布在PC2的正軸，表明露天A、溫室間土壤細菌群落水平上有明顯差異。

2.5.2 組間差異顯著性LEfSe

對溫室與露天栽培茶園土壤進行LEfSe（LDAgt;4.5、Plt;0.05），結果（圖5）表明，露天栽培處理差異指示種為酸桿菌門（Acidobacteriota）、Acidobacteriae。溫室栽培茶園土壤中差異指示種為羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、放線菌門（Actinobacteriota）、朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、放線菌綱（Actinobacteria）、熱酸菌屬（Acidothermus）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、未分類朱氏桿菌（unclassified Chujaibacter）、熱酸菌科（Acidothermaceae）等。上述物種均對溫室栽培茶園土壤和露天栽培茶園土壤之間群落結構組成的差異產生重要的作用。

2.6 相關性網絡分析

斯皮爾曼（Spearman ）秩相關分析（Rgt;0.1，Plt;0.05）結果（圖6）表明，負相關的屬為硝化螺旋菌屬（Nitrospira）與朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、赭黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）與乳桿菌屬（Lactobacillus）、潮濕桿菌屬（Humibacter）與鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等；正相關的屬為Nitrolancea與朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、叢生放線菌屬（Actinospica），乳桿菌屬（Lactobacillus）與Jatrophihabitans等。

2.7 BugBase表型預測

利用BugBase對細菌群落進行表型預測分析，得到不同表型細菌在不同樣本中的豐度比例與差異。露天革蘭氏陰性菌、氧化脅迫耐受菌豐度表現為明顯高于溫室，而生物膜形成、革蘭氏陽性菌、需氧菌明顯低于溫室（圖7）。

3 討論與結論

微生物區系的演變（數量、組成結構）為重要的生物指標，可以反映土壤環境質量變化，其中土壤細菌為一種重要組分［23-26］。采用高通量測序技術對溫室茶園土壤和露天茶園土壤進行了細菌多樣性及群落結構分析。α多樣性分析結果表明，ACE指數、Chao1指數、Simpson指數與Shannon指數均以露天栽培土壤高于溫室栽培土壤，說明溫室栽培降低了茶園細菌群落結構的多樣性。在對溫室茶園的栽培管理中可考慮增施有機肥、微生物菌肥等農藝措施以增加其土壤微生物多樣性。不同栽培模式土壤細菌主要優勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等。其中，露天栽培茶園土壤中的優勢菌門為酸桿菌門、芽單胞菌門等，溫室栽培茶園土壤中的優勢菌門為放線菌門、變形菌門以及厚壁菌門等。酸桿菌門能夠對作物殘體多聚物進行降解，并進行一定的光合作用。酸桿菌門、芽單胞菌門等門的細菌可產生如抗生素、抗真菌劑、鐵載體等多種次級代謝產物，介導與其他生物體與其所在環境間的溝通、競爭以及相互作用。放線菌門可較好地吸收環境中的營養成分，并作為抗生素的來源（70%）；厚壁菌門通過產生芽孢，防御外界有害因子的闖入，從而具有較強的抗逆性［27］。變形菌門與能量代謝有關。固氮菌群主要分布于變形菌門、厚壁菌門和藍藻菌門，可見溫室栽培茶園土壤菌群具有較好的固氮能力［28］。

PCoA、Adonis及LEfSe結果表明，不同栽培方式茶園土壤細菌結構存在差異，露天栽培處理差異指示種為酸桿菌門（Acidobacteriota）、Acidobacteriae。溫室栽培茶園土壤中差異指示種為羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、放線菌門（Actinobacteriota）、朱氏桿菌屬（Chujaibacter）、放線菌綱（Actinobacteria）、熱酸菌屬（Acidothermus）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、未分類朱氏桿菌、熱酸菌科（Acidothermaceae）等。熱酸菌屬可起到分解有機質、利用碳源的作用［29］。熱酸菌屬（從科到屬）為溫室栽培茶園土壤中的差異指示種，與杜思瑤等研究的有機設施種植土壤中熱酸菌屬相對豐度顯著較大［29］結論一致。通過BugBase表型預測發現，革蘭氏陰性菌、氧化脅迫耐受菌豐度表現為露天明顯高于溫室，而生物膜形成、革蘭氏陽性菌、需氧菌則表現出相反的趨勢。

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