精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸品質及安全性的影響

摘 要：為探究香辛料精油與乳酸菌共同使用對鯰魚肉風干腸品質和安全性的影響，將前期優選出的八角精油和紫蘇精油組合（star anise essential oil and perilla oil，AP）與商業乳酸菌發酵劑PRO-MIX5復配，作為實驗組

（AP-PRO組），以不接菌的AP組作為對照。以水分活度、水分質量分數、pH值、硫代巴比妥酸反應物值、亞硝酸鹽殘留量、乳酸菌數、腸桿菌科數、假單胞菌數、生物胺含量及發酵終點的N-亞硝胺含量為評價指標，分析乳酸菌復配精油對鯰魚肉風干腸成熟期間品質及安全性的影響。結果表明：發酵過程中風干腸的水分質量分數和水分活度均明顯降低，脂肪氧化程度降低；在成熟終點，AP-PRO組的風干腸中含有較多的腸桿菌科數，而假單胞菌的數量相對較少，AP組和AP-PRO組乳酸菌含量分別為8.4、8.7（lg（CFU/g））；AP-PRO組風干腸中生物胺和N-亞硝胺總量均顯著低于AP組

（P＜0.05），抑制率分別為14.5%和41.0%。綜上，AP-PRO組在改善鯰魚肉風干腸品質和提高安全性方面的效果優于AP組。

關鍵詞：香辛料精油；乳酸菌發酵劑；革胡子鯰魚；風干腸；品質；安全性

Effect of Mixed Spice Essential Oil Combined with Lactic Acid Bacteria on the Quality and Safety of Dried Catfish Sausage

DONG Xiaowei SONG Jiayi CHENG Junli ZHANG Yuting LIANG Liya

（1. College of Food Science and Bioengineering， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China;

2. Disease Prevention and Control Center of Jinzhong City， Shanxi Province， Jinzhong 030600， China;

3. Tianjin Aquatic Products Processing and Quality Safety School-Enterprise Collaborative Laboratory， Tianjin 300392， China;

4. National Research and Development Sub-center of Freshwater Fish Processing Technology （Tianjin）， Tianjin 300392， China）

Abstract： This study was conducted in order to explore the effects of addition of a mixed spice essential oil of star anise and perilla （1：1， m/m） combined with inoculation of a commercial lactic acid bacterial starter culture （PRO-MIX5） on the quality and safety of dried catfish sausage. Uninoculated sausage with the mixed oil was used as control （AP）. The quality and safety of sausages were evaluated in terms of water activity， water content， pH， thiobarbituric acid reactive substance （TBARS） value， nitrite residue， lactic acid bacteria， Enterobacteriaceae and Pseudomonas counts， biogenic amine content and N-nitrosamine content at the end of fermentation. The results showed that the water content and water activity of dried sausage were significantly reduced during the fermentation process， and the degree of fat oxidation was reduced. At the end of fermentation， higher Enterobacteriaceae and lower Pseudomonas counts were found in the inoculated sausage （AP-PRO）. The content of lactic acid bacteria in the AP and AP-PRO groups was 8.4 and 8.7 （lg（CFU/g））， respectively. The contents of total biogenic amines and N-nitrosamines were 14.5% and 41.0% in the AP-PRO group， significantly lower than the AP group （P lt; 0.05）， respectively. In conclusion， the AP-PRO group was superior to the AP group in terms of quality and safety.

Keywords： spice essential oil; lactic acid bacterial starter culture; Clarias gariepinus; dried sausage; quality; safety

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-125

中圖分類號：TS254.4" " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）07-0022-07

風干腸是一種發酵肉制品，制作過程包括前期原料肉絞碎、腌制、灌腸，后期發酵、風干和成熟等加工步驟。近年來，研究報道顯示，除了常見的豬肉、羊肉和牛肉外[1-3]，還有利用魚肉進行發酵加工的腸產品[4-5]。

前期的研究[6]表明，在鯰魚肉風干腸加工過程中添加一定量的香辛料精油有利于改善其質量，并提高食品安全性，但在自然條件下發酵的風干腸易受環境因素的影響，自然發酵的產品品質不穩定，不適合工廠大批量生產。乳酸菌作為肉制品發酵過程中的主要菌種之一，被廣泛認可為安全微生物，是食品生產過程中廣泛使用的益生菌[7-8]。通過向革胡子鯰魚肉餡中接種乳酸菌可以調節風干腸發酵初期的微生物環境，抑制腐敗微生物的生長，從而改善產品品質。目前已有大量研究[9-10]證明乳酸菌在發酵肉制品中能分解亞硝酸鹽，發酵產生的有機酸能影響微生物生長。

因此，擬將前期篩選出的對發酵肉制品作用效果較好的乳酸菌發酵劑PRO-MIX5與八角精油、紫蘇精油一起添加在鯰魚肉風干腸中，測定風干腸理化性質，分析乳酸菌發酵劑搭配香辛料精油對風干腸安全性的提升效果，本研究旨在提高風干腸的可食用性，使風干腸的制作工藝更加適應工廠化生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革胡子鯰魚（體質量（1.5±0.1）kg） 天津市紅旗農貿綜合水產批發市場；紫蘇精油 吉安市青原區利康天然香料油有限公司；八角精油 頂興（天津）食品科技發展有限公司；乳酸菌發酵劑PRO-MIX5（木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌、類植物乳桿菌） 意大利薩科公司；30 mm膠原蛋白腸衣 梧州神冠蛋白腸衣有限公司。

N-亞硝胺標準品 美國Supelco公司；生物胺標準品" "美國Sigma公司；三氯乙酸、氯化鉀、亞鐵氰化鉀鹽酸、硫代巴比妥酸、亞硝酸鈉、二氯甲烷（色譜純）、乙腈（分析純）、三氯甲烷（分析純） 天津風船化學試劑科技有限公司；高氯酸、丹磺酰氯、丙酮 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T25高速分散機 德國IKA公司；LC-CCA冷卻液循環泵、SHZ-D循環水式真空泵 上海力辰儀器科技有限公司；HD-4智能水分活度測量儀 迪樂電子儀器科技有限公司；Climacell恒溫恒濕箱 艾力特國際貿易有限公司；BVBJ-30F真空攪拌機、BJRJ-82絞肉機 浙江嘉興艾博實業有限公司；STARTER 3100實驗室pH計"奧豪斯儀器（上海）有限公司；ST-40R冷凍離心機"德國Thermo Fisher公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋 億捷科技公司；CM-5分光測色計 日本柯尼卡美能達公司；7890A氣相色譜儀、1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鯰魚肉風干腸制作

參考陳援援等[11]的方法，對風干腸工藝進行調整。革胡子鯰魚→冰浴致暈→宰殺（去內臟、魚皮）→取肉→

清洗→魚肉絞碎→真空攪拌→加入輔料（1.8%食鹽、0.055%抗壞血酸鈉和0.01%亞硝酸鈉）→肉餡表面覆保鮮膜→4 ℃下腌制24 h→二次真空攪拌（肉餡、0.2%味精、0.3%醬油、4%白砂糖、1.5%曲酒、10%水和0.03%香辛料精油（八角精油、紫蘇精油質量比1∶1））→攪拌8 min→灌腸→24 ℃發酵12 d。其他參數如表1所示。

1.3.2 實驗分組

按照1.3.1節制作方法，在調味過程中，一組以質量比1∶1的比例復配添加八角精油和紫蘇精油（AP組），精油總添加量為前期實驗選出的0.03%（以肉質量計）；另一組在添加精油的基礎上，添加0.02%（以肉質量計）經滅菌乳活化后的發酵劑PRO-MIX5（AP-PRO組）。在第12天完成風干后，測定成熟產品各項理化指標。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 水分質量分數、水分活度測定

使用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法測定風干腸的水分質量分數。將風干腸絞碎后均勻平鋪在玻璃測量皿底部，使用水分活度測量儀測定樣品水分活度。

1.3.3.2 pH值測定

采用GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》方法對鯰魚肉風干腸的pH值進行測定。

1.3.3.3 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值測定

參考張雨婷等[6]的方法，取5 g風干腸與15 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液混合，冰浴勻漿（13 000 r/min、30 s），過濾，取2.5 mL上清液與2.5 mL 0.02 mol/L"2-硫代巴比妥酸溶液混合，搖勻，沸水浴40 min后冰浴降溫，再加入7.5 mL三氯甲烷離心（2 000×g、10 min），于532 nm波長處測定吸光度（A532 nm）。TBARS值

按式（1）計算：

TBARS值/（ mg/kg）=A532 nm×V×M×1 000/ε×L×m （1）

式中：V為樣品體積/mL；M為丙二醛分子質量/（g/mol）；ε為摩爾吸光系數（1.56×10⁵ L/（mol·cm））；L為光學路徑長度（1 cm）；m為樣品質量/g。

1.3.3.4 亞硝酸鹽殘留量測定

參考GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.3.3.5 乳酸菌數、腸桿菌科數、假單胞菌數測定

將無菌生理鹽水與風干腸按質量比9∶1混勻，無菌均質器拍打5 min，梯度稀釋10 倍備用。

向無菌平皿中加入1 mL適宜濃度的樣品勻液，分別加入假單胞菌CFC鑒別瓊脂、MRS培養基、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂，于36 ℃培養。其中，腸桿菌科培養1 d后取出計數，其余樣品2 d后取出計數。

1.3.3.6 生物胺含量測定

樣品前處理：取風干6、12 d的5 g風干腸與20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液混合，低溫勻漿30 s，重復離心2 次（4 000 r/min、10 min）后過濾，將濾液移入50 mL容量瓶，用上述高氯酸溶液定容。

標準溶液和樣品的衍生化：向試管中加入飽和碳酸氫鈉溶液0.3 mL、2 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 mL，以及生物胺標準溶液與樣品溶液各1 mL，再加入2 mL 10 mg/mL

丹磺酰氯溶液，40 ℃水浴0.5 h后加入0.1 mL氨水，將混合液移入5 mL容量瓶，乙腈定容，離心（4 ℃、5 000 r/min、5 min），過濾后檢測。

高效液相色譜檢測條件：色譜柱選用Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×150 nm，5 μm）；流動相A為水，流動相B為乙腈；進樣量20 μL；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長254 nm。梯度洗脫程序：0 min，80% A；0～3 min，80%～65% A；3～10 min，65% A；10～16 min，65%～10% A；16～25 min，10%～0% A；25～27 min，0% A；27～35 min，80% A。

以生物胺標準溶液質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。樣品中生物胺含量按式（2）計算：

生物胺含量 /（mg/kg）=ρ×V×n/m （2）

式中：ρ為樣品溶液中生物胺質量濃度/（mg/L）；V為樣品溶液體積/mL；n為稀釋倍數；m為樣品質量/g。

1.3.3.7 N-亞硝胺含量測定

取風干12 d的風干腸樣品，按照GB 5009.26—2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》中的氣相色譜-質譜法測定。

1.4 數據處理

用Excel 2021和IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行數據整理和差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸成熟過程中水分

質量分數和水分活度的影響

由圖1可知，隨著成熟過程的進行，鯰魚肉風干腸中的水分質量分數和水分活度均呈明顯下降趨勢，AP組和AP-PRO組的水分質量分數分別由初始的69.04%和68.05%降至27.39%和26.06%，接近李國柱等[12]添加乳酸菌發酵劑生產的發酵腸的水分質量分數（25%）。水分活度由初始的0.889和0.893降至0.746和0.751，低于大多數香腸中腐敗菌生長所需水分活度[13]。趙佳瑩等[14]發現，牦牛肉發酵香腸在發酵初期水分質量分數迅速下降，大量自由水蒸發，到了成熟后期自由水減少，與蛋白質結合緊密的結合水開始蒸發，水分質量分數下降變慢，與研究結果趨勢一致。同時，水分活度的降低可能與pH值有關，酸性環境使肌肉蛋白發生變性，造成腸表面的水分進一步蒸發，使水分活度降低[15]。

小寫字母不同表示不同時間差異顯著（P＜0.05）。圖2～5同。

2.2 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸成熟過程中pH值的影響

如圖2所示，2 組鯰魚肉風干腸成熟過程中pH值的變化趨勢一致，首先在3 d前迅速降低至5.4以下，在3～6 d內pH值變化較小，在9 d時pH值相比3～6 d時顯著升高（P＜0.05），與同類型產品研究結果[11，16]相似。蔡永敏等[17]發現，豬肉發酵香腸在3～6 d干燥期間，溫度和濕度的下降對乳酸菌的代謝活性有一定的影響；同時，能產氨類等堿性物質的酶活性增大，產品pH值略有升高。陳援援等[11]在篩選發酵劑時發現，AP-PRO組的pH值在成熟過程中顯著高于其他處理組，說明PRO-MIX5組乳酸菌產酸能力相比其他商業乳酸菌發酵劑較弱。鯰魚肉風干腸在成熟12 d時，AP-PRO組的pH值高于AP組。總的來看，2 種處理方法制備的風干腸pH值均低于5.4，酸性環境能抑制有害微生物的生命活動，使風干腸的安全性得到提高。

2.3 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸成熟過程中TBARS值的影響

脂肪氧化是鯰魚肉風干腸中一些風味物質的產生原因之一，TBARS值能反映脂肪氧化程度，有時適當的氧化可以令產品風味豐富，但是過度氧化會產生不良風味。由圖3可知，0～6 d時TBARS值呈現上升趨勢，在9 d時AP-PRO組的TBARS值開始低于AP組，說明接種乳酸菌能抑制風干腸中脂肪氧化，有利于特有風味的生成。郭玲玲[18]將植物乳桿菌6003接種到發酵香腸中，發現乳酸菌能夠顯著降低發酵香腸中的TBARS值。可能是接種乳酸菌發酵劑后，乳酸菌產生過氧化氫酶并分解過氧化氫，降低氧化作用，抑制發酵肉制品中的脂質氧化。

2.4 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸成熟過程中亞硝酸鹽含量的影響

肉制品生產加工中經常用到亞硝酸鹽，它在發酵香腸的感官和理化特性中具有重要作用，還能有效抑制微生物的生長[19-20]。但是，過量的亞硝酸鹽殘留對人體有害，因為其在肉制品中發色生成的亞硝基化合物對人體有致癌作用[21]。由圖4可知，2 組風干腸中亞硝酸鹽的殘留量在3 d內迅速降低，并在后期的成熟過程中變化較小。除了八角精油和紫蘇精油對亞硝酸鹽的抑制外，環境中的微生物發酵產酸也對風干腸中亞硝酸鹽含量減少作出貢獻，因為低酸的環境促進亞硝酸鹽還原成NO發色。在9 d時，亞硝酸鹽殘留量升高，可能是風干腸內的硝酸鹽還原菌繁殖較多，將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽。12 d時由于乳酸菌大量繁殖，產生較多乳酸，不利于硝酸鹽還原菌的生長，所以亞硝酸鹽殘留量減少?？偟膩碚f，3 d之后2 組樣品亞硝酸鹽含量均低于國家限量標準的30 mg/kg，在品質安全方面具有一定的保障。

2.5 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸成熟過程中微生物的影響

由圖5A、B可知，風干腸的腸桿菌科和假單胞菌數均呈先上升后下降的趨勢。肉制品的腐敗大多與腸桿菌科有關，其主要來源于糞便。AP-PRO組的腸桿菌科數在1.5 d左右時超過AP組，在之后的成熟過程中與AP組保持相同的變化趨勢。分析原因可能是2 組風干腸中添加的香辛料精油中的某種成分改變了發酵菌株的活力，使風干腸中的優勢菌發生變化，從而使腸桿菌科數在前期增長過快。假單胞菌在環境中分布廣泛且適應性強，在某些極端環境下也能生存[22]，例如水產品在冷鏈運輸中容易感染假單胞菌，增加腐敗幾率[23-24]。AP-PRO組的假單胞菌數在3～9 d時明顯高于AP組，在12 d時低于AP組。由于風干腸制作時初始發酵溫度為24 ℃，并不是乳酸菌生長的最佳溫度，反而更適合嗜冷菌的生長，造成乳酸菌在初期不是優勢菌，對腐敗微生物生長的抑制效果不理想。

由圖5C可知，在0～3 d時乳酸菌生長迅速，3～12 d時生長較為緩慢，2 組風干腸分別從初始菌數5.8、5.5（lg（CFU/g））增加到成熟終點的8.4、8.7（lg（CFU/g））。Cenci-Goga等[25]研究認為，通常大于7（lg（CFU/g））的乳酸菌含量被認為是充足的乳酸菌水平，有利于控制早期肉糜中的腐敗菌、致病菌的生長繁殖，提升產品的安全性。AP組和AP-PRO組在3 d時乳酸菌數就已達到8.3、8.5（lg（CFU/g）），對有害微生物的抑制具有很大優勢。乳酸、乙酸和苯乳酸均能降低酶活、破壞細胞質和細胞壁、抑制蛋白質合成，而乳酸菌通過發酵產生這些有機酸，進而破壞細胞正常代謝，達到抑菌效果[26-27]。

2.6 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸成熟過程中生物胺含量的影響

生物胺是發酵肉制品在加工過程中易形成的化合物。Roselino等[28]研究發現，低濃度的生物胺有利于維持機體部分生理功能和代謝，其以激素或神經遞質的形式調節免疫系統和腸道健康。當生物胺攝入過多時，則會導致中毒癥狀，如頭痛、惡心和呼吸困難等，因此對食品中的生物胺進行控制十分有必要。表2顯示了2 組風干腸在發酵中期（第6天）與末期（第12天）生物胺的含量，可以看出AP組和AP-PRO組在第12天的生物胺總量均比第6天高，表明隨著發酵的進行，2 組風干腸的生物胺出現了積累。風干腸在第6天時未檢測到色胺，到第12天時雖有檢出，但是AP-PRO組的含量顯著低于AP組（P＜0.05），說明乳酸菌對色胺的生成有一定的抑制作用。同時，第12天的苯乙胺、腐胺和精胺含量比第6天時減少，尤其是苯乙胺的含量未達到檢測限，這可能與腐敗微生物如腸桿菌科數量降低有關。黃巖等[29]認為腸桿菌是產生腐胺和尸胺的主要微生物，12 d時AP-PRO組腐胺的含量高于AP組，與圖5A中成熟終點AP-PRO組的腸桿菌科數高于AP組結果一致。組胺和酪胺是毒性最強的2 種生物胺，是評價風干腸安全性的重要指標之一。生物胺的毒性因不同種族、地域和人體內胺類氧化酶等諸多因素的存在而因人而異，因此很難統一標準來衡量其毒性閾值[30]。根據國家規定，水產品中組胺含量應≤20 mg/kg，而2 組風干腸在成熟終點均未超過此限值，說明2 種處理下的風干腸安全性有一定的保障。有研究發現，人體一旦攝入超過100 mg/kg的酪胺會引發偏頭痛，而攝入量達到1 080 mg/kg更會讓人體嚴重中毒[31]，本研究中的酪胺含量遠低于此值，且在成熟過程中含量變化較小。就對人體健康的危害而言，總生物胺的最高閾值為1 000 mg/kg[32]。鯰魚肉風干腸的生物胺總量低于此限值，說明其安全品質有一定保障。同時，發酵結束后AP-PRO組生物胺總量相比AP組降低14.5%，且組間差異顯著（P＜0.05），說明添加PRO-MIX5乳酸菌后對生物胺抑制效果較好。

2.7 精油復配乳酸菌對鯰魚肉風干腸N-亞硝胺含量的影響

N-亞硝胺對人和動物都有潛在危害，在動物體內會導致“三致”[33-34]。發酵肉制品在加工過程中產生的蛋白質、氨基酸及生物胺能作為前體物質轉化成亞硝胺。轉化方式有2 種，一種是部分前體物質與亞硝化試劑直接生成亞硝胺，第2種是先轉化為次級胺類物質，再與亞硝化試劑反應形成亞硝胺[35]。由表3可知，2 組風干腸中N-二甲基亞硝胺、N-亞硝基吡咯烷和N-二丙基亞硝胺均未檢出，可能是由于乳酸菌和香辛料都能減少N-二甲基亞硝胺的含量，且乳酸菌產生了能夠降解N-二甲基亞硝胺的酶系[36]，說明鯰魚肉風干腸具有一定的安全性。風干結束后AP-PRO組對N-亞硝胺的抑制率為41.0%。孫學穎等[37]研究發現，商業發酵劑PRO-MIX5和彎曲乳桿菌單菌均能顯著降低N-亞硝胺的含量，與本研究結果一致。

3 結 論

本研究在添加八角精油和紫蘇精油的基礎上，探究接入乳酸菌發酵劑PRO-MIX5后對鯰魚肉風干腸品質的提升及對安全性的影響。結果表明：接入PRO-MIX5發酵劑后風干腸的水分質量分數降低至26.06%，pH值降低至5.26，低水分質量分數和高酸的環境限制了腐敗微生物的生長，有利于提高產品的安全性；AP-PRO組中的乳酸菌能降低鯰魚肉風干腸中的TBARS值，延緩脂肪氧化，其亞硝酸鹽含量雖然高于AP組，但遠低于國家限量標準；在成熟終點，AP-PRO組的腸桿菌科數高于AP組，假單胞菌數低于AP組，說明乳酸菌發酵劑和香辛料精油復配使用對假單胞菌生長的抑制效果更好，同時AP-PRO組具有更高的乳酸菌水平（8.7（lg（CFU/g））），有利于發酵產酸，抑制腐敗微生物生長；AP-PRO組對生物胺和N-亞硝胺都有很好的抑制效果，抑制率分別為14.5%和41.0%。綜上，AP-PRO組在改善鯰魚肉風干腸品質和提高安全性方面的效果優于AP組。

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