隱丹參酮調節TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路對高糖誘導的心肌細胞焦亡的影響

摘要 目的：探討隱丹參酮調節Toll樣受體4/核轉錄因子κB/NOD樣受體蛋白3（TLR4/NF-κB/NLRP3）信號通路對高糖誘導的心肌細胞焦亡的影響。方法：將H9c2細胞分為對照組（正常葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖組（葡萄糖33 mmol/L）、2.5 μmol/L隱丹參酮組（葡萄糖33 mmol/L＋2.5 μmol/L隱丹參酮）、5 μmol/L隱丹參酮組（葡萄糖33 mmol/L＋5 μmol/L隱丹參酮）和脂多糖（LPS）組（葡萄糖33 mmol/L＋5 μmol/L隱丹參酮＋1 μg/mL TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路激活劑LPS），各組細胞培養在相應的培養基中48 h。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞存活率；2′，7′-二乙酰二氯熒光素（DCFH-DA）法檢測細胞活性氧（ROS）水平；半胱氨酸天冬氨酸酶-1抑制劑（FLICA）-半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞焦亡情況；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞上清白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞GSDMD蛋白N端片段（GSDMD-N）、TLR4、NLRP3、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65、Cleaved Caspase-1、Caspase-1蛋白表達。結果：與對照組比較，高糖組H9c2細胞存活率下降（P＜0.05），細胞ROS水平、焦亡細胞比例、細胞上清IL-1β和IL-18水平及細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65、GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達升高（P＜0.05）；與高糖組比較，2.5 μmol/L隱丹參酮組、5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞存活率升高（P＜0.05），細胞ROS水平、焦亡細胞比例、細胞上清IL-1β和IL-18水平及細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65、GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達降低（P＜0.05）。TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路激活劑LPS可逆轉隱丹參酮對高糖誘導細胞增殖和焦亡的抑制作用。結論：隱丹參酮可抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路減輕高糖誘導的心肌細胞焦亡。

關鍵詞 心肌細胞；隱丹參酮；Toll樣受體4/核轉錄因子κB/NOD樣受體蛋白3信號通路；高糖；焦亡；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.14.010

Effect of Cryptotanshinone on Hyperglycemic-induced Pyroptosis of Cardiomyocytes by Regulating TLR4/NF-κB/NLRP3 Signaling Pathway

WU Yujia， WU Wenyin， LI Yan， DONG Yinhong

Tangshan Traditional Chinese Medical Hospital， Tangshan 063000， Hebei， China， E-mail： wio3y2@sina.com

Abstract Objective：To investigate the effect of cryptotanshinone regulating Toll-like receptor 4/nuclear transcription factor-κB/NOD-like receptor protein 3（TLR4/NF-κB/NLRP3） signaling pathway on hyperglycemic-induced pyroptosis of cardiomyocytes.Methods：H9c2 cells were divided into control group（normal glucose 5.5 mmol/L），high glucose group（glucose 33 mmol/L），2.5 μmol/L cryptotanshinone group（glucose 33 mmol/L＋2.5 μmol/L cryptotanshinone） and 5 μmol/L cryptotanshinone group（glucose 33 mmol/L＋5 μmol/L cryptotanshinone） and lipopolysaccharide（LPS） group（33 mmol/L＋5 μmol/L cryptotanshinone＋1 μg/mL TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway activator LPS）.The cells of each group were cultured in the corresponding medium for 48 h.The cell survival rate was detected by MTT method.The level of reactive oxygen species（ROS） was detected by 2′7′-diacetyldichlorofluorescein（DCFH-DA） method.Cysteine aspartase 1 inhibitor（FLICA）-cysteine aspartase 1（Caspase-1）/propyl iodide（PI） double staining method was used to detect the pyroptosis of cells.The levels of interleukin-6（IL-6） and interleukin-1β（IL-1β） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The N-terminal fragment of GSDMD protein（GSDMD-N），TLR4，NLRP3，phosphorylated NF-κB p65（p-NF-κB p65），NF-κB p65，Cleaved Caspase-1，and Caspase-1 protein expression were detected by Western Blot.Results：Compared with the control group，the survival rate of H9c2 cells in the high glucose group decreased（P＜0.05），while the level of ROS，proportion of pyrodead cells，levels of IL-1β and IL-18，the expressions of TLR4，NLRP3，P-NF-κB p65/NF-κB p65，GSDMD-N，Cleaved Caspase-1/Caspase-1 protein increased（P＜0.05）.Compared with the high glucose group，the survival rate of H9c2 cells in the 2.5 μmol/L cryptotanshinone group and the 5 μmol/L cryptotanshinone group increased（P＜0.05），while the level of ROS，proportion of pyrodead cells，levels of IL-1β and IL-18，the expressions of TLR4，NLRP3，P-NF-κB p65/NF-κB p65，GSDMD-N，Cleaved Caspase-1/Caspase-1 protein decreased（P＜0.05）.TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway activator LPS showed reversing the inhibitory effect of cryptotanshinone on hyperglucose induced cell proliferation and pyroptosis.Conclusion：Cryptotanshinone could inhibit TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway to reduce hyperglycemic-induced myocardial pyroptosis.

Keywords cardiomyocytes; cryptotanshinone; Toll-like receptor 4/nuclear transcription factor κB/NOD-like receptor protein 3 signaling pathway; hyperglycemic; pyroptosis; experimental study

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的主要心血管并發癥，是全球糖尿病病人殘疾或死亡的主要原因之一，病理改變包括心肌纖維化、心室擴張和收縮功能受損、心功能不全［1-2］。有研究表明，心肌細胞死亡在DCM的發展中發揮著關鍵作用，已提出一系列導致心肌細胞死亡的機制，如自噬、鈣蛋白酶活化、炎癥、內質網應激、氧化應激積累、葡萄糖毒性、脂毒性及線粒體損傷等［3］。目前，DCM的發病機制尚未明確。最新研究表明，焦亡可能與DCM密切相關［4］。Toll樣受體4/核轉錄因子κB/NOD樣受體蛋白3（TLR4/NF-κB/NLRP3）信號通路參與各種炎癥反應和炎癥相關疾病的發病機制，TLR4的激活促進NF-κB的激活，將NF-κB易位到細胞核并增加促炎細胞因子生成，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）［5］。TLR4通過促進NF-κB的活化激活NLRP3炎癥小體，增加促炎細胞因子如IL-1β和IL-18釋放，當IL-1β和IL-18在細胞中不斷釋放和積累時，導致焦亡、組織損傷和器官功能障礙［6-7］。Yao等［8］研究發現，田薊苷和紫丁香苷聯合使用可抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路，減弱DCM大鼠炎癥和心肌細胞凋亡，改善DCM大鼠心臟功能和DCM標志物。隱丹參酮是從丹參根中純化的活性成分，臨床研究表明，隱丹參酮具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤作用［9］。已有研究證實，隱丹參酮可減輕糖尿病大鼠心臟纖維化及高糖誘導的心肌細胞損傷，展現了隱丹參酮治療DCM的潛力［10］。隱丹參酮對高糖誘導的心肌細胞作用機制尚未明確。本研究通過體外高糖誘導心肌細胞實驗探討隱丹參酮是否通過調控TLR4/NF-κB/NLRP3通路減緩高糖誘導的心肌細胞焦亡情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞H9c2購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗試劑

隱丹參酮（PF04523）購自北京普非生物科技有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒（YT290-HSU）購自北京百奧萊博科技有限公司；FAM FLICATM Caspase-1 Kit（ICT098）購自Bio-Rad公司；IL-1β（ER1094）和IL-18（ER0036）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；抗體Gasdermin家族成員D-N端（GSDMD-N，ab215203）、TLR4（ab13556）、NLRP3（ab263899）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65，ab76302）、NF-κB p65（ab16502）、Cleaved Caspase-1（ab179515）、Caspase-1（ab207802）、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，ab8245）和辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗（ab6721）購自Abcam公司。

1.3 細胞培養與造模分組

將H9c2細胞培養在含10%胎牛血清、1%雙抗的杜氏改良Eagle培養基（DMEM）中，并在37 ℃含5%CO2的培養箱中培養，當細胞匯合到80%時，進行細胞傳代或實驗。

將H9c2細胞分為對照組（正常葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖組［11］（葡萄糖33 mmol/L）、2.5 μmol/L隱丹參酮組［10］（葡萄糖33 mmol/L＋2.5 μmol/L隱丹參酮）、5 μmol/L隱丹參酮組（葡萄糖33 mmol/L＋5 μmol/L隱丹參酮）和脂多糖（LPS）組［12］（葡萄糖33 mmol/L＋5 μmol/L隱丹參酮＋1 μg/mL TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路激活劑LPS），各組細胞在相應的培養基中培養48 h。

1.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞存活率

H9c2細胞以每孔1×104個接種到96孔板中培養24 h后，按照實驗分組方法繼續處理細胞48 h，之后每孔加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h后，棄去上清，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），使用波長為490 nm的酶標儀測量吸光度，計算細胞存活率。

1.5 2′，7′-二乙酰二氯熒光素（DCFH-DA）法檢測細胞ROS水平

收集各組細胞，使用100 μL無血清培養基重懸細胞，之后加入1 mL稀釋后的DCFH-DA，在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育40 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞2次后重懸，使用流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度評估ROS水平。

1.6 半胱氨酸天冬氨酸酶-1抑制劑（FLICA）-半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞焦亡情況

收集各組細胞，PBS洗滌后，加入10 μL FLICA-Caspase-1，在37 ℃避光孵育30 min，洗滌離心后加入5 μL的PI溶液繼續孵育15 min，采用流式細胞儀分析細胞焦亡。雙陽性細胞認為焦亡細胞。

1.7 ELISA法檢測細胞上清IL-1β和IL-18水平

收集各組細胞培養上清液，根據試劑盒說明檢測細胞上清液中IL-1β和IL-18水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞相關蛋白

收集各組細胞，加入RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定法定量蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白并轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脫脂牛奶封閉膜2 h，在4 ℃用以下抗體孵育過夜：GSDMD-N、TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65、Cleaved Caspase-1、Caspase-1、GAPDH將膜與HRP偶聯的二抗在37 ℃下孵育1 h。通過發光試劑顯影，采用Image J軟件對蛋白條帶進行量化。

1.9 統計學處理

使用GraphPad Prism 9軟件進行統計分析。符合正態分布和方差齊性的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 隱丹參酮對高糖誘導H9c2細胞存活率的影響

與對照組比較，高糖組H9c2細胞存活率下降（P＜0.05）；與高糖組比較，2.5 μmol/L隱丹參酮組、5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞存活率升高（P＜0.05）；與2.5 μmol/L隱丹參酮組比較，5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞存活率升高（P＜0.05）；與5 μmol/L隱丹參酮組比較，LPS組H9c2細胞存活率下降（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 隱丹參酮對高糖誘導H9c2細胞ROS水平的影響

與對照組比較，高糖組H9c2細胞ROS水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，2.5 μmol/L隱丹參酮組、5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞ROS水平降低（P＜0.05）；與2.5 μmol/L隱丹參酮組比較，5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞ROS水平降低（P＜0.05）；與5 μmol/L隱丹參酮組比較，LPS組H9c2細胞ROS水平升高（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3 隱丹參酮對高糖誘導H9c2細胞焦亡的影響

與對照組比較，高糖組H9c2細胞焦亡水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，2.5 μmol/L隱丹參酮組、5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞焦亡水平降低（P＜0.05）；與2.5 μmol/L隱丹參酮組比較，5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞存活率降低（P＜0.05）；與5 μmol/L隱丹參酮組比較，LPS組H9c2細胞焦亡水平升高（P＜0.05）。詳見圖2、表3。

2.4 隱丹參酮對高糖誘導H9c2細胞上清IL-1β和IL-18水平的影響

與對照組比較，高糖組H9c2細胞上清IL-1β和IL-18水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，2.5 μmol/L隱丹參酮組、5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞上清IL-1β和IL-18水平降低（P＜0.05）；與2.5 μmol/L隱丹參酮組比較，5 μmol/L隱丹參酮組細胞上清IL-1β和IL-18水平降低（P＜0.05）；與5 μmol/L隱丹參酮組比較，LPS組H9c2細胞上清IL-1β和IL-18水平升高（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 隱丹參酮對高糖誘導H9c2細胞TLR4/NF-κB/NLRP3通路及焦亡相關蛋白的影響

與對照組比較，高糖組H9c2細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65、GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達升高（P＜0.05）；與高糖組比較，2.5 μmol/L隱丹參酮組、5 μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65、GSDMD-N、 Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達降低（P＜0.05）；與2.5μmol/L隱丹參酮組比較，5μmol/L隱丹參酮組H9c2細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65、GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達降低（P＜0.05）；與5 μmol/L隱丹參酮組比較，LPS組H9c2細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65、GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達升高（P＜0.05）。詳見表5、圖3。

3 討 論

DCM的發展是一個復雜過程，高血糖引起的心肌細胞死亡是DCM的根本改變，可觸發心臟重塑、左心室功能障礙和心力衰竭的發生［13］。高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷是體外模擬DCM的常用模型［14］。本研究采用上述方法模擬體外DCM，結果顯示，高糖刺激下，H9c2細胞存活率降低，使用隱丹參酮干預后，細胞存活率升高，提示隱丹參酮可減輕高糖誘導的心肌細胞損傷。

焦亡是由Caspase-1家族（如Caspase-1）激活介導的程序性細胞死亡，發病機制以細胞死亡和過度炎癥為特征，在器官發育、細胞更新分化和其他生理過程中發揮著重要作用［15］。一般情況下，焦亡通過激活NLRP3炎癥小體啟動，NLRP3炎癥小體的活化可誘導Caspase-1裂解為活化的Caspase-1，從而驅動焦亡執行物GSDMD的成熟及促炎細胞因子IL-1β和IL-18的釋放［16］。GSDMD蛋白是細胞焦亡的執行者，其被活化的Caspase-1切割釋放N端片段，誘導細胞焦亡，之后GSDMD-N被轉移至細胞質膜上形成1～2 nm的孔隙，進而破壞細胞膜，并釋放IL-1β和IL-18等小分子［17］。ROS作為NLRP3驅動炎性小體活化的第二信使，參與焦亡的發生機制［18］。在正常情況下，抗氧化酶在細胞代謝過程中消除ROS，以維持ROS生成和消除的平衡，當ROS不斷積累，內源性抗氧防御系統不能及時消除時，ROS可激活NF-κB/NLRP3通路誘發細胞焦亡，增加促炎因子的釋放［19-20］。已有研究表明，糖尿病病人高血糖增強了氧化應激，導致糖尿病心肌細胞ROS的產生增加，進而誘導炎癥級聯反應［21］。Wang等［22］研究顯示，沉默心肌H9c2細胞中AIM2表達，可降低高糖刺激的H9c2細胞ROS水平及IL-1β、Caspase-1、GSDMD-N水平，通過抑制高糖誘導的H9c2細胞焦亡緩解DCM。本研究結果顯示，高糖誘導H9c2細胞后，細胞ROS水平和細胞GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達升高，細胞上清IL-1β和IL-18分泌及焦亡細胞比例增加，表明高糖可誘導心肌細胞焦亡，隱丹參酮干預后細胞ROS水平、GSDMD-N、Cleaved Caspase-1/Caspase-1蛋白表達、細胞上清IL-1β和IL-18分泌及焦亡細胞比例降低，與Wang等［22］研究結果一致，表明隱丹參酮通過減輕高糖誘導的心肌細胞焦亡緩解DCM。

高糖誘導的細胞焦亡受TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路調控。TLR4是先天免疫應答的關鍵參與者，活化的TLR4可激活NF-κB通路，并上調NLRP3蛋白表達，促進IL-1β和IL-18的產生，最終導致焦亡［23-24］。已有研究顯示，高血糖可激活NLRP3炎癥小體，最終激活Caspase-1，誘導促炎細胞因子IL-1β和IL-18成熟，進而導致DCM小鼠心肌細胞發生焦亡［25］。Huang等［26］研究表明，高糖誘導可激活H9c2細胞中TLR4、p-NF-κB及NLRP3表達，促進Cleaved Caspase-1蛋白及IL-1β、IL-18和ROS水平表達，外源性硫化氫通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路減輕高糖誘導的心肌細胞焦亡。本研究結果顯示，高糖誘導H9c2細胞后，細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達升高，隱丹參酮干預后細胞TLR4、NLRP3、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達降低，與Huang等［26］研究結果一致，提示隱丹參酮通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路，減輕高糖誘導的心肌細胞焦亡。使用TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路激活劑LPS結果顯示，LPS可逆轉隱丹參酮對高糖誘導H9c2細胞ROS水平、細胞上清IL-1β和IL-18分泌、焦亡細胞比例、TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路及誘導焦亡相關蛋白表達的減少，證實了隱丹參酮可抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路，減輕高糖誘導的心肌細胞焦亡。

綜上所述，隱丹參酮可促進高糖誘導的心肌細胞增殖，通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路介導的細胞焦亡，減輕心肌細胞損傷，揭示了隱丹參酮通過TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路發揮DCM心肌細胞保護的作用機制，為DCM的治療提供了新思路。

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（收稿日期：2023-02-27）

（本文編輯薛妮）

基金項目 河北省中醫藥管理局中醫藥類科研計劃課題（No.2019206）

作者單位 唐山市中醫醫院（河北唐山" 063000），E-mail：wio3y2@sina.com

引用信息 武禹佳，武文印，李艷，等.隱丹參酮調節TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路對高糖誘導的心肌細胞焦亡的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（14）：2553-2558.