基于網絡藥理學和分子對接探討參枝苓口服液治療阿爾茨海默病的作用機制

摘要目的：基于網絡藥理學和分子對接技術探討參枝苓口服液治療阿爾茨海默病（AD）的作用機制。方法：利用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）和中藥分子機制的生物信息學分析工具數據庫（BATMAN-TCM）查找與參枝苓口服液中中藥相關的化學成分及其作用靶點；通過DisGeNET數據庫獲取與AD相關的靶標，并進一步篩選得到參枝苓口服液治療AD的潛在作用靶點；利用Cytoscape軟件構建成分-靶點相互作用網絡，確認可能的關鍵靶點和關鍵通路；采用DAVID數據庫對篩選出的潛在作用靶點進行基因本體（GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析；通過分子對接預測活性成分與靶蛋白的結合能力。結果：在參枝苓口服液中，共篩選出34個與AD相關的潛在活性成分和56個潛在作用靶點；GO生物功能分析共包含541條富集結果，主要涉及基因表達的正向調節、同源蛋白結合等；KEGG富集得到214條代謝通路，主要包括AD及自噬信號通路等。分子對接結果表示β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素與半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、前列腺素內過氧化物合酶（PTGS2）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）均可較好結合，可能是參枝苓口服液抗AD最有效的活性成分。結論：網絡藥理學及分子對接研究結果揭示了參枝苓口服液治療AD的多成分、多靶點、多途徑的作用特點，并預測了其可能的活性成分、作用通路和關鍵靶點，為其藥效物質基礎和作用機制提供了理論基礎。

關鍵詞阿爾茨海默病；參枝苓口服液；網絡藥理學

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.005

The Mechanism of Shenzhiling Oral Liquid for Treating Alzheimer′s Disease Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

CHEN Haiyang， WEN Yichao， YU Zhihua， CHEN Jiulin， LIU Te

Shanghai Geriatric Institute of Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200031， China

Corresponding Author" LIU Te， E-mail： liute1979@shutcm.edu.cn

AbstractObjective：To investigate the mechanism of Shenzhiling oral liquid for treating Alzheimer′s disease（AD） based on network pharmacology and molecular docking technology.Methods：The chemical constituents related to traditional Chinese medicine（TCM） in Shenzhiling oral liquid and its action targets were found in Systematic Pharmacology Database and Analysis Platform of TCM （TCMSP） and bioinformatics analysis tool database of TCM molecular mechanism （BATMAN-TCM） database.The targets related to AD were obtained through DisGeNET database，and the potential targets of Shenzhiling oral liquid for the treatment of AD were further screened.A component-target interaction network" were contructed using Cytoscape software to identify possible key targets and critical pathways.DAVID database was used for gene ontology（GO） analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis of potential targets.Molecular docking was used to predict the binding ability of active ingredients with target proteins.Results：A total of 34 potential active ingredients and 56 potential targets related to AD were screened in Shenzhiling oral liquid.GO biofunctional analysis contained a total of 541 enrichment results，which were mainly related to the positive regulation of gene expression and homologous protein binding，etc.KEGG enrichment yielded 214 metabolic pathways，which were mainly included" the signaling pathways of Alzheimer′s disease and autophagy signaling pathway.The molecular docking results indicated that β-sitosterol，kaempferol，and luteolin bind well with CASP3，PTGS2，IL6，TNF，and Bcl-2，which may be the most effective active ingredients of Shenzhiling oral liquid against Alzheimer′s disease.Conclusion：The results of network pharmacology and molecular docking studies revealed the multi-component，multi-target，and multi-pathway action characteristics of Shenzhiling oral liquid for the treatment of Alzheimer′s disease，and predicted its possible active components，action pathways and key targets，which provided theoretical foundations for the material basis of" efficacy and mechanism of action.

Keywords Alzheimer′s disease; Shenzhiling oral liquid; network pharmacology

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種進行性神經退行性疾病，以進展性的認知功能障礙為主要臨床表現［1］。AD是癡呆的主要病因，且其發病率隨著年齡的增長而增加，2010年患癡呆癥的人數約為3 560萬人，到2050年全球患有癡呆癥的人數可能會增加3倍［2］。AD的發病機制主要有β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的聚集以及Tau蛋白的過度磷酸化等，這些變化導致了大量神經細胞的凋亡和突觸功能的損傷［3］。西藥治療AD的藥物一般使用乙酰膽堿酯酶抑制劑，該藥物通過提升大腦中乙酰膽堿水平來改善認知和行為癥狀，然而，這類藥物常伴隨外周膽堿能副作用，如腿痙攣、胃腸道不適，甚至可能引發心律失常，因此心臟傳導缺陷病人應慎用［4］。中醫藥治療AD的研究結果表明，一些中藥具有增強記憶力、改善認知水平等作用，并且具有不良反應少等特點［5］。

參枝苓口服液，源自上海市名中醫林水淼教授的臨床驗方，系在中醫“心主神明”理論的指導下，用于治療心氣不足型AD［6］，臨床表現有健忘、心悸、少氣懶言、表情淡漠、反應遲鈍、神疲乏力、懶語、舌質淡、脈虛無力等心氣虛的癥狀［7］。參枝苓口服液主要成分包括黨參、桂枝、白芍、甘草、茯苓、干姜、遠志、石菖蒲、龍骨和牡蠣，具有益氣溫陽、化痰安神的功效。本研究通過中藥網絡藥理學評估參枝苓口服液對AD的治療作用，并結合分子對接進行初步驗證，豐富中醫藥治療AD的理論內涵，為今后的實驗研究以及臨床治療提供一定的參考。

1資料與方法

1.1參枝苓口服液活性成分篩選

參枝苓口服液由黨參、桂枝、白芍、甘草、茯苓、干姜、遠志、石菖蒲、龍骨、牡蠣10味中藥組成。通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺［8］（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選活性成分，條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug likeness，DL）≥0.18［9］，獲取參枝苓口服液藥物的化學成分。在TCMSP中未找到有效成分的中藥，在中藥分子機制的生物信息學分析工具數據庫（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）［10］中設置查找條件為截止值（score cutoff）為20和調整后的P值（adjusted Pvalue）為0.05，篩選有效成分后進行整合。

1.2參枝苓口服液、AD相關靶點預測及篩選共同靶點

將在TCMSP數據庫和BATMAN-TCM數據庫中篩選出的有效成分進行靶點預測，在DisGeNET數據庫［11］（https：//www.disgenet.org/）中檢索與AD相關的Score值≥0.1的靶點基因，并將結果導入UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行基因標準化。將參枝苓口服液預測的靶點與AD的預測靶點取交集，得到的共同作用靶點即為參枝苓口服液治療AD的潛在靶點。

1.3成分網絡圖的構建

將參枝苓口服液的中藥、活性成分以及共同作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建“參枝苓口服液-活性成分-靶點”網絡圖，并使用Network Analyzer分析工具分析網絡的特征，其中，節點（node）代表成分和靶點，邊（edge）代表兩者之間的關系，以研究藥物、活性成分與靶點之間的關系［12］。

1.4蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）的構建

將獲得的藥物與疾病的共同靶點上傳至STRING數據庫（https：//cn.string-db.org），模式設置為“多種蛋白”，物種選擇設置為“homo sapiens”［13］。將獲得的數據導入Cytoscape 3.7.2軟件中進行分析，獲取關鍵靶點，構建PPI網絡。

1.5基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

將參枝苓口服液的活性成分靶點與AD共同靶點導入DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）進行GO功能分析和KEGG分析［14］。將所獲數據通過微生信（https：//www.bioinformatics.com.cn）進行進一步可視化分析。

1.6分子對接

根據KEGG通路分析結果，確定核心成分和靶點，從alphafold數據庫（https：//alphafold.ebi.ac.uk/）中獲取蛋白質晶體結構，通過TCMSP數據庫搜索中藥，并建立對接小分子，利用AutoDockTools對受體蛋白進行去水、加氫操作等，并進行受體結構準備工作，最終將結果導入PyMOL進行對接結果的可視化［15］。分子對接結合熱能＜－20.92 kJ/mol表示結合活性較好。

2結果

2.1參枝苓口服液活性成分的篩選

在TCMSP數據庫和BATMAN-TCM數據庫中進行篩選，共獲得173個有效成分，其中，黨參21個，桂枝7個，白芍13個，甘草92個，茯苓15個，干姜5個，遠志6個，石菖蒲7個，龍骨2個，牡蠣5個，利用類藥性和口服利用度篩選，去重整合后得到34個活性成分。詳見表1。

2.2參枝苓口服液潛在靶點、疾病靶點及交集靶點的篩選

利用TCMSP數據庫和BATMAN-TCM進行活性成分的靶點預測，并將所獲得的靶點導入UniProt數據庫進行基因標準化，刪除重復值后獲得作用靶點352個。在DisGeNET數據庫中設置Score值≥0.1，檢索到673個AD相關靶點基因。將參枝苓口服液的352個預測靶點與AD的673個預測靶點取交集，得到參枝苓口服液與AD的共同作用靶點為56個，即為參枝苓口服液治療AD的潛在靶點。詳見圖1。圖1參枝苓口服液與AD交集靶點韋恩圖

2.3“參枝苓口服液-活性成分-靶點”網絡的構建

將上述的中藥，活性成分以及靶點導入Cytoscape軟件進行網絡可視化。圖中藍色節點代表參枝苓口服液中的藥物，綠色節點代表活性成分，粉色節點代表成分預測靶點，節點之間的邊表示成分與靶點之間的相互作用關系（見圖2）。其中預測靶點按度值（Degree值）進行分析（見表2），度值越大，表示與其他的靶點關系越密切，即表示該節點在整個網絡中能發揮關鍵作用。度值排名前5位的活性成分為β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-methoxy-2-methyl isoflavone）、18β-甘草次酸（18beta-glycyrrhetinic acid）。

2.4PPI網絡的構建

將映射得到的56個交集靶點基因導入STRING數據庫進行PPI網絡分析，得到PPI網絡圖（見圖3），顏色越深節點越大越代表其在網絡中越重要。PPI網絡包含54個靶蛋白節點，共有526條邊代表了蛋白之間的相互作用，拓撲分析前10位的核心網絡靶點包括蘇氨酸蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL-6）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）等，可能是參枝苓口服液治療AD的重要靶點。詳見圖4。

2.5GO功能分析

采用DAVID數據庫對56個潛在作用靶點進行GO基因本體分類富集分析，確定了541個GO條目，選取P值排名前10位的功能信息（見圖5），其中，生物過程（BP）相關的條目最多，有409個，主要涉及基因表達的正向調控、對細胞凋亡過程的正向調節等；分子功能（MF）相關條目73個，主要涉及同源蛋白結合、酶結合等；細胞組分（CC）相關的條目59個，主要涉及膜筏、細胞膜穴樣內陷等。

2.6KEGG富集通路分析結果

通過富集分析發現，該56個靶點顯著富集在214條通路上（見圖6），其中，主要通路包括AD、自噬信號通路等。

2.7分子對接

分子對接結合熱能＜－20.92 kJ/mol表示結合活性較好。因此，由AutodockTools軟件分子對接結果可知參枝苓口服液中拓撲學參數排名靠前的中藥化合物小分子β-谷甾醇與CASP3、PTGS2的結合能分別為－31.80kJ/mol、－31.38kJ/mol；山柰酚與PTGS2、IL-6、TNF的結合能分別為－32.63 kJ/mol、－32.63 kJ/mol、32.22 kJ/mol；木犀草素與Bcl-2的結合能為－30.12 kJ/mol，所以，β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素與PPI核心蛋白拓撲學參數靠前的大分子受體CASP3、PTGS2、IL-6、TNF、Bcl-2均具有良好的結合活性。詳見圖7。

3討論

本研究通過網絡藥理學的方法，以參枝苓口服液為研究對象，探討其對于AD的作用機制。最終通過類藥性和口服利用度篩選出β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等34個活性成分，這些活性成分有可能對于治療AD發揮著相對重要的作用。通過疾病和藥物的交集靶點從PPI網絡中獲取到關鍵靶點，其中富集程度較高的靶點有CASP3、PTGS2、IL-6、TNF、Bcl-2、AKT1等。KEGG通路富集分析表明，參枝苓口服液作用于AD的機制中，主要涉及神經退行性疾病、AD及相關疾病等，進一步提煉參枝苓口服液治療AD的生物學過程，發現其涉及基因表達的正向調控、對細胞凋亡過程的正向調節等生物過程及與同源蛋白結合、酶結合、膜筏、細胞膜穴樣內陷等相關，這與AD及其并發癥的發生發展都有一定的關系。為了進一步驗證參枝苓口服液治療AD的作用，將網絡藥理學預測的核心成分與關鍵靶蛋白進行分子對接，核心成分與PTGS2、IL-6、CASP3、Bcl-2蛋白的活性結合位點的結合能均＜－20.92 kJ/mol，表明核心成分與關鍵靶點蛋白之間可以自發結合且具有較強的結合活性。在篩選出來的參枝苓口服液的核心成分中，β-谷甾醇和山柰酚均可與PTGS2相互作用。研究表明，β-谷甾醇和山柰酚對腦部疾病具有關鍵藥理作用，尤其是AD［16-17］，木犀草素可以通過多種機制發揮神經保護作用［18］。基礎研究證實，調心方可以提高動物內皮細胞體外模型的IL-6的含量［19］，也可以通過降低Bcl-2、下調CASP3來減輕神經細胞凋亡，從而提高動物定向學習記憶能力［20］；PTGS2則被認為是AD相關的急性神經創傷和腦細胞損傷的早期關鍵成分［21］。AD信號傳導通路上還有許多未被挖掘的基因，具體這些基因如何通過信號傳導來治療AD還需更深入的探索。

綜上所述，AD是一種復雜的疾病，目前尚未找到完全治愈的方法。網絡藥理學及實驗結果證明，參枝苓口服液多成分-多靶點-多通路的治療機制，對于AD有一定的控制和延緩作用，對于AD的預防與治療有著重要的意義，為發病機制復雜的AD提供了研究方向。

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（收稿日期：2023-10-18）

（本文編輯鄒麗）