黃連堿預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠JNK/p38MAPK信號通路的影響

摘要目的：探討黃連堿預處理對心肌缺血再灌注（MI/RI）大鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路的影響。方法：將60只大鼠隨機分為MI/RI組、假手術組、黃連堿低劑量組（黃連堿-L組，50 mg/kg黃連堿）、黃連堿中劑量組（黃連堿-M組，100 mg/kg黃連堿）、黃連堿高劑量組（黃連堿-H組，200 mg/kg黃連堿）及黃連堿-H＋激活劑組（50 mg/kg黃連堿＋25 mg/L JNK/p38MAPK通路激活劑茴香霉素），每組10只。除假手術組外，其余各組均進行冠狀動脈結扎構建MI/RI大鼠模型，造模后，觀察血流動力學參數左室內壓最大上升（LVdp/dtmax）、左室內壓最大下降速率（LVdp/dtmin）、收縮壓以及舒張末壓變化；采集大鼠腹部主動脈血，評估心肌損傷程度指標肌酸激酶同工酶（CK-MB）及乳酸脫氫酶（LDH）含量；分離心肌組織，檢測心肌組織病理學變化、細胞凋亡、炎性因子［腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）］水平及JNK/p38MAPK通路相關蛋白表達。結果：與假手術組比較，MI/RI組存在大量炎性細胞浸潤、組織結構紊亂，病理損傷嚴重，LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均降低，但凋亡率、舒張壓、LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6含量、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組病理損傷得到改善，LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均增加，凋亡率、舒張壓、LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6含量、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組病理損傷進一步加劇，LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均降低，但凋亡率、舒張壓、LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6含量、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達增加（P＜0.05）。結論：黃連堿預處理可通過抑制JNK/p38MAPK通路減輕MI/RI大鼠心肌損傷。

關鍵詞心肌缺血再灌注；心肌損傷；黃連堿；c-Jun氨基末端激酶/促分裂素原活化蛋白激酶信號通路；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.008

Effect of Coptisine Pretreatment on JNK/p38MAPK Signaling Pathway in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

ZHAO Zhicheng， GUO Tianlong

The Fourth Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150000， Heilongjiang， China

Corresponding AuthorGUO Tianlong， E-mail： eginfa32668@163.com

AbstractObjective：To investigate the effect of coptisine pretreatment on c-Jun amino-terminal kinase（JNK）/mitogen-activated protein kinase（p38MAPK） signaling pathway in myocardial ischemia-reperfusion（MI/RI） rats.Methods：Sixty rats were randomly divided into MI/RI group，sham operation group，low dose of coptisine（coptisine-L，50 mg/kg coptisine） group，medium dose of coptisine（coptisine-M，100 mg/kg coptisine） group，and high dose of coptisine（coptisine-H，200 mg/kg coptisine） group and coptisine-H＋activator（50 mg/kg coptisine＋25 mg/L JNK/p38MAPK pathway activator-anisomycin） group，10 rats" in each group.MI/RI rat model was constructed by coronary artery ligation in all groups except the sham operation group.After modeling，the hemodynamic parameters of left chamber pressure maximum rise（LVdp/dtmax），decline rate（LVdp/dtmin），systolic blood pressure，and end diastolic blood pressure were observed.The contents of creatine kinase isoenzyme（CK-MB） and lactate dehydrogenase（LDH） were evaluated by collecting aorta blood from rats.Myocardial tissue was isolated，and myocardial histopathological changes，apoptosis，TNF-α，interleukin-6（IL-6） levels，and JNK/p38MAPK pathway-related protein expression were detected.Results：Compared with the sham operation group，MI/RI group showed a large number of inflammatory cells infiltration，tissue structure disorder，serious pathological damage，LVdp/dtmax，LVdp/dtmin，systolic blood pressure decreased，however，apoptosis rate，end-diastolic blood pressure，LDH，CK-MB，TNF-α，IL-6 content，P-JNK/JNK，P-P38MAPK/p38MAPK expression increased（P＜0.05）.Compared with MI/RI group，the pathological damage of coptisine-L group，coptisine-M group and coptisine-H group were improved，and LVdp/dtmax，LVdp/dtmin and systolic blood pressure increased，and apoptosis rate，end diastolic blood pressure，LDH，CK-MB，TNF-α，IL-6 content，P-JNK/JNK，P-P38MAPK/p38MAPK expression decreased（P＜0.05）.Compared with the coptisine-H group，the pathological damage of coptisine-H＋activator group was further aggravated，and LVdp/dtmax，LVdp/dtmin and systolic blood pressure decreased，however，apoptosis rate，end diastolic blood pressure，LDH，CK-MB，TNF-α，IL-6 content，P-JNK/JNK，P-P38MAPK/p38MAPK expression increased（P＜0.05）.Conclusion：Pretreatment with coptisine could reduce myocardial injury in MI/RI rats by inhibiting JNK/p38MAPK pathway.

Keywords myocardial ischemia reperfusion; myocardial injury; coptisine; c-Jun amino-terminal kinase/mitogen-activated protein kinase signaling pathway; experimental study

缺血性心臟病是全球死亡的主要原因，目前再灌注是急性缺血性心臟病的決定性治療方法，然而目前缺乏有效的治療方法預防心肌缺血再灌注損傷（myocardial"ischemia reperfusion injury，MI/RI）［1］。研究發現，細胞凋亡是MI/RI的特征之一，因此，抑制細胞凋亡可預防MI/RI的進展［2］。已有研究表明，MI/RI發生后c-Jun氨基末端激酶（JNK）/促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路信號明顯被激活，阻斷該通路可明顯減輕臟器功能損傷、抑制細胞凋亡及炎性水平增加［3］。黃連堿是一種具有多種生物學功能的生物堿，在缺血再灌注引起的心肌損傷中可發揮保護作用，但其作用機制尚不明確［4］。本研究旨在探討黃連堿預處理對MI/RI大鼠心肌損傷的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

60只體質量280～300 g的8周齡雄性Sprague Dawley大鼠，購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（粵）2022-0063。將大鼠置于（23±2）℃、濕度為40%～60%的12 h∶12 h光照/黑暗循環中，可以自由獲得標準食物和水。所有動物實驗程序均經動物護理和使用委員會批準。

1.2實驗試劑

黃連堿（純度≥98%）購自南京景竹生物科技有限公司；JNK/p38MAPK通路激活劑茴香霉素購自美國MCE公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫吸附（ELISA）法試劑盒購自上海拜沃生物科技有限公司；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白檢測試劑盒、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）試劑盒購自Merck公司；p-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK一抗購自Abcam公司。

1.3大鼠分組、預處理及MI/RI模型的制備

60只大鼠適應性喂養1周后隨機分為MI/RI組、假手術組、黃連堿低劑量（黃連堿-L）組、黃連堿中劑量（黃連堿-M）組、黃連堿高劑量（黃連堿-H）組以及黃連堿-H＋激活劑組，每組10只，其中MI/RI組、假手術組連續7 d給予生理鹽水灌胃及腹腔注射干預，每日1次；黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組分別以50、100、200 mg/kg黃連堿灌胃，同時腹腔注射生理鹽水，每日1次［5］；黃連堿-H＋激活劑組以200 mg/kg黃連堿灌胃干預，同時腹腔注射25 mg/L茴香霉素，每日1次［6］。連續干預7 d，干預結束后，采用戊巴比妥鈉進行麻醉，之后固定大鼠，進行氣管插管，連接呼吸機維持呼吸，同時以生物機能實驗系統監測左心室血流動力學參數及心電圖，待數據平穩后，開胸，暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支部位30 min，再恢復血流供應2 h。其中假手術組僅穿線，不結扎。當松開結扎線恢復冠狀動脈血量，抬高的ST段下降，缺血部位心肌顏色恢復，標志著造模成功，除假手術組外，其余各組大鼠均符合造模標準［7］。

1.4檢測血流動力學參數

造模成功后，通過生物機能實驗系統監測左心室血流動力學參數，包括左室內壓最大上升速率（LVdp/dtmax）、左室內壓最大下降速率（LVdp/dtmin）、收縮壓及舒張末壓。

1.5評估心肌損傷程度

采集大鼠腹部主動脈血液，離心，收集上清液，通過全自動生化分析儀檢測肌酸激酶同工酶（CK-MB）及乳酸脫氫酶（LDH）含量。

1.6ELISA法檢測心肌組織中炎性因子水平

取部分左心室心肌組織，ELISA法的具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，通過酶標儀分析TNF-α、IL-6水平。

1.7蘇木精-伊紅（HE）染色檢測心肌組織病理學變化

取部分心臟組織固定在4%多聚甲醛中，然后將樣品包埋在石蠟中，切成4 μm厚的切片，使用HE染色，在顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.8TUNEL檢測細胞凋亡

心臟組織脫蠟后，用乙醇脫水，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，按照試劑盒的操作步驟，加入TUNEL混合液，于37 ℃避光孵育1 h。繼續用4，6-雙脒-2-苯基吲哚（DAPI）對細胞核進行染色，在室溫下孵育10 min，并用PBS沖洗2次。在熒光顯微鏡下觀察心肌組織并拍照，其中凋亡細胞核呈綠色，計算細胞凋亡率。

1.9蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測JNK/p38MAPK通路相關蛋白表達

取部分心臟組織，使用BCA蛋白檢測試劑盒測定樣品的濃度。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。隨后在室溫下用5%脫脂乳封閉該膜1 h，并與p-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK一抗在4 ℃下孵育過夜。洗滌后，將樣品與二抗在室溫下孵育1.5 h。使用增強化學發光法（ECL）系統和熒光成像系統檢測印跡，Image J分析蛋白表達水平。

1.10統計學處理

采用SPSS 27.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，以snk-q檢驗進一步兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1黃連堿對各組大鼠血流動力學參數的影響

與假手術組比較，MI/RI組LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓均降低，但舒張壓增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮增加，舒張壓降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組LVdp/dtmax、LVdp/dtmin、收縮壓降低，舒張壓增加（P＜0.05）。詳見表1。

2.2黃連堿對各組大鼠心肌損傷程度的影響

與假手術組比較，MI/RI組LDH、CK-MB含量增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組LDH、CK-MB含量降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組LDH、CK-MB含量增加（P＜0.05）。詳見表2。

2.3黃連堿對各組大鼠心肌組織中炎性因子的影響

與假手術組比較，MI/RI組TNF-α、IL-6含量增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組TNF-α、IL-6含量降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組TNF-α、IL-6含量增加（P＜0.05）。詳見表3。

2.4黃連堿對心肌組織病理學的影響

假手術組大鼠心肌組織無明顯病理學變化；MI/RI組存在大量炎性細胞浸潤、心肌纖維排列松散，組織結構紊亂；黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組病理損傷逐漸改善；但黃連堿-H＋激活劑組與黃連堿-H組比較病理損傷加劇，細胞結構缺損，炎性浸潤依然存在。詳見圖1。

2.5黃連堿對大鼠細胞凋亡的影響

與假手術組比較，MI/RI組細胞凋亡率增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組細胞凋亡率增加（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6黃連堿對大鼠心肌組織JNK/p38MAPK通路相關蛋白表達的影響

與假手術組比較，MI/RI組p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達增加（P＜0.05）；與MI/RI組比較，黃連堿-L組、黃連堿-M組、黃連堿-H組p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達降低（P＜0.05）；與黃連堿-H組比較，黃連堿-H＋激活劑組p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達增加（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3討論

由冠狀動脈閉塞引起的急性心肌梗死是全世界發病率和死亡率的主要原因，給病人帶來了嚴重的心理和經濟負擔，急性心肌缺血后的早期再灌注治療可以恢復冠狀動脈血流、挽救心肌細胞并延長存活時間，但同時也會導致額外的損傷并加重心臟功能障礙，增加急性心肌梗死病人的死亡率［8-9］。因此，探索MI/RI的作用機制有助于尋找有效治療藥物預防MI/RI的發生發展。

中藥具有資源豐富、毒副作用低、易于接受等優勢，在心血管疾病防治方面已做出重大貢獻，如人參皂苷能釋放一氧化氮保護心肌，黃連等有抗心律失常作用［10］。中藥能激發藥物性預適應對心肌缺血的保護作用具有重要意義，為防治心肌缺血性疾病提供了新思路。黃連堿是一種天然存在的異喹啉生物堿，是黃連干燥根莖的生物活性成分，具有抗炎、抗高膽固醇血癥、舒張血管和保護心臟等特性［11］。Guo等［12］研究發現，黃連堿可抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，保護心肌缺血再灌注大鼠心臟。本研究發現，MI/RI大鼠中細胞凋亡明顯增加，有研究顯示，抑制心肌細胞凋亡可有效改善MI/RI的進展［13］。此外，炎癥反應在MI/RI進展中也發揮關鍵作用［14］。本研究發現，MI/RI大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6含量增加，與Kingery等［15］的研究結果一致，同時心肌損傷標志物LDH、CK-MB含量上升，HE染色顯示，心肌組織中存在大量炎性細胞浸潤、心肌纖維排列松散，組織結構紊亂，影響血流動力學參數，提示MI/RI大鼠心臟功能受損。但經黃連堿預處理的MI/RI大鼠，抑制了細胞凋亡以及炎癥反應，在一定程度上緩解了MI/RI大鼠心臟受損，提示黃連堿可能通過抑制細胞凋亡及炎癥反應改善MI/RI大鼠心臟受損，但具體機制尚不明確。

MAPKs在神經元的適應、增殖和分化中起著重要的作用。MAPK信號通路通常分為3個主要的亞組，包括細胞外信號調節激酶（ERK）1/2、JNK和p38MAPK。研究表明，ERK1/2激活通常保護神經元免于凋亡，而p38和/或JNK的激活通常導致神經元細胞死亡，對于腦缺血再灌注期間炎癥和凋亡的調節是必不可少的［16-17］。本研究結果發現，MI/RI大鼠心肌組織中p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達顯著增加，提示激活JNK/p38MAPK通路，可促進炎性因子的釋放，加速細胞凋亡，從而加重MI/RI。研究發現，咪達唑侖通過抑制JNK/p38MAPK信號通路抑制缺血/再灌注誘導的心肌細胞凋亡［18］。李明航等［19］研究表明，全反式維A酸保護大鼠腦缺血再灌注損傷作用的主要機制是通過抑制JNK/p38MAPK信號通路實現。本研究發現黃連堿預處理后，p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK表達明顯被抑制，緩解了MI/RI進展。最后實驗以JNK/p38MAPK通路激活劑進行恢復驗證，結果發現茴香霉素逆轉了黃連堿對MI/RI大鼠的保護作用，表明黃連堿預處理可減輕MI/RI大鼠心肌損傷，與抑制JNK/p38MAPK通路有關。

綜上所述，黃連堿預處理可降低炎癥反應、抑制細胞凋亡、減輕MI/RI大鼠心肌損傷，可能通過抑制JNK/p38MAPK通路實現。

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（收稿日期：2023-02-07）

（本文編輯鄒麗）