基于BDNF/TrkB信號通路介導的線粒體自噬對心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

摘要目的：探討基于腦源性神經營養因子（BDNF）/原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）信號通路介導的線粒體自噬對心肌缺血再灌注（I/R）損傷的作用。方法：將小鼠隨機分為假手術（Sham）＋磷酸鹽緩沖液（PBS）組、Sham＋7，8-二羥基黃酮（7，8-DHF）組、I/R＋PBS組和I/R＋7，8-DHF組，每組12只。除Sham組，其余小鼠建立心肌I/R損傷模型（心肌缺血45 min/再灌注2 h）。Sham＋7，8-DHF組和I/R＋7，8-DHF組小鼠在心肌I/R損傷前7 d腹腔注射7，8-DHF；Sham＋PBS組和I/R＋PBS組則給予相同體積的PBS。超聲心動圖、蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學用于檢測心臟功能、組織學和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達。從各組小鼠心臟中分離心臟微血管內皮細胞（CMEC），通過將TrkB小干擾RNA（si-TrkB）轉染到CMEC細胞中抑制TrkB活化，然后進行線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）開放率測量。結果：I/R＋PBS組中紅細胞在I/R損傷后聚集成塊，I/R＋7，8-DHF組則維持了紅細胞的線性形態并阻止了其在微血管中的會聚。與I/R＋PBS組相比，I/R＋7，8-DHF組p-eNOS水平、室間隔厚度、左心室短軸縮短分數、左心室射血分數上調（P＜0.05），內皮素-1（ET-1）、ICAM-1、心臟質量、心臟質量指數、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑下調（P＜0.05）。I/R＋PBS組CMEC中BDNF、TrkB、FUN14結構域1（FUNDC1）蛋白表達和酸性自溶酶體形成較Sham＋PBS組減少（P＜0.05），而I/R＋7，8-DHF組CMEC中BDNF、TrkB、FUNDC1蛋白表達和酸性自溶酶體形成較I/R＋PBS組增加（P＜0.05）。當在7，8-DHF存在的情況下施用si-TrkB以抑制CMEC中的TrkB活化時，FUNDC1的表達被抑制（P＜0.05），并且線粒體輕鏈3（mito-LC3Ⅱ）的線粒體水平和酸性自溶酶體形成減少（P＜0.05）。結論：激活BDNF/TrkB/FUNDC1信號通路通過恢復線粒體自噬改善I/R小鼠的內皮功能和微血管結構。

關鍵詞心肌缺血再灌注；線粒體自噬；腦源性神經營養因子；原肌球蛋白受體激酶B；7，8-二羥基黃酮；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.010

Mechanism of Mitochondrial Autophagy Mediated by BDNF/TrkB Signaling Pathway on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

WANG Baoli， LIU Wenjun， LI Ying， LI Chenhui

Xi′an First Hospital（First Affiliated Hospital of Northwest University），Xi′an 710002， Shaanxi， China

Corresponding AuthorLIU Wenjun， E-mail： 3398839255@qq.com

AbstractObjective：To explore the mechanism of mitochondrial autophagy mediated by brain-derived neurotrophic factor（BDNF）/tropomyosin receptor kinase B（TrkB） signaling pathway on myocardial ischemia-reperfusion（I/R） injury.Methods：The mice were randomly divided into Sham＋phosphate buffer（PBS） group，Sham＋7，8-dihydroxyflavone（7，8-DHF） group，I/R＋PBS group and I/R＋7，8-DHF group，with 12 mice in each group.Myocardial I/R injury model（myocardial ischemia 45 min/reperfusion 2 h） were established in other mice except Sham group.Mice in Sham＋7，8-DHF group and I/R＋7，8-DHF group were intraperitoneally injected with 7，8-DHF 7 d before myocardial I/R injury.Sham＋PBS group and I/R＋PBS group were given the same volume of PBS.Echocardiography，hematoxylin-eosin（HE） staining and immunohistochemistry were used to detect cardiac function，histology，and intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1） expression.Cardiac microvascular endothelial cells（CMEC） were isolated from the hearts of mice in each group.TrkB small interfering RNA（si-TrkB） was transfected into CMEC cells to inhibit TrkB activation，and then the opening rate of mitochondrial membrane permeability transition pore（mPTP） was measured.Results：In the I/R＋PBS group，red blood cells clustered after I/R injury，while in the I/R＋7，8-DHF group，the linear morphology of red blood cells were maintained and the convergence in microvessels was prevented.Compared with I/R＋PBS group，P-ENOS level，ventricular septal thickness，left ventricular short axis shortening fraction，and left ventricular ejection fraction in I/R＋7，8-DHF group increased（P＜0.05）.Endothelin-1（ET-1），ICAM-1，heart mass，heart mass index，left ventricular end-diastolic diameter and left ventricular end-systolic diameter were down regulated（P＜0.05）.The expression of BDNF，TrkB，FUN14 domain 1（FUNDC1） protein and the formation of acid autolyssome in CMEC in I/R＋PBS group decreased compared with those in Sham＋PBS group（P＜0.05），the expression of BDNF，TrkB，FUNDC1 protein and the formation of acid autolyssome in CMEC in I/R＋7，8-DHF group increased compared with those in I/R＋PBS group（P＜0.05）.When si-TrkB was administered in the presence of 7，8-DHF to inhibit TrkB activation in CMEC，FUNDC1 expression was inhibited（P＜0.05），and mitochondrial levels of mito-LC3Ⅱ and acid autolyssome formation were reduced（P＜0.05）.Conclusion：Activation of the BDNF/TrkB/FUNDC1 signaling pathway improved endothelial function and microvascular structure in I/R mice by restoring mitochondrial autophagy

Keywords myocardial ischemia-reperfusion; mitochondrial autophagy; brain-derived neurotrophic factor; tropomyosin receptor kinase B; 7，8-dihydroxyflavone; experimental study

缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的發生增加了心肌梗死的發病率和死亡率［1］。與心肌細胞I/R損傷相比，心臟微血管I/R損傷的分子機制尚不完全清楚［2］。研究發現，腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）通過與其高親和力受體原肌球蛋白受體激酶B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）結合抑制缺血誘導的心臟凋亡和功能障礙［3］；因此，BDNF/TrkB通路可能是I/R損傷的治療靶點。線粒體在協調細胞外損傷信號和維持心臟微血管內皮功能中至關重要［4］。線粒體自噬是發生在溶酶體的作用下修復功能受損線粒體的保守過程［5］。研究表明，線粒體自噬可在各種病理生理條件下保護微血管結構和功能，包括保護心肌I/R損傷［6］。有研究證實，BDNF/TrkB信號通路介導的線粒體自噬對缺血誘導的神經損傷具有保護作用［7］。然而，尚不清楚BDNF/TrkB信號通路對I/R損傷的保護作用是否與線粒體自噬有關。因此，本研究探討BDNF模擬物7，8-二羥基黃酮（7，8-dihydroxyflavone，7，8-DHF）是否可以通過激活線粒體自噬來改善I/R誘導的內皮線粒體損傷，并評估其在心臟微血管I/R損傷中的分子機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

無特定病原體8周齡雄性C57BL/6小鼠，體質量22～26 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。在特定的無病原體環境下飼養小鼠，允許其隨意獲取食物和水，飼養環境為：12 h的暗/光周期（室溫20～24 ℃，相對濕度40%～70%）。

1.2小鼠心肌I/R損傷模型建立

使用耳標順序編號小鼠，建立分配隱藏［8］，將小鼠隨機分為假手術（Sham）＋磷酸鹽緩沖液（PBS）組、Sham＋7，8-DHF組、I/R＋PBS組和I/R＋7，8-DHF組，每組12只。除Sham組，其余小鼠參照文獻［9］建立小鼠心肌I/R損傷模型（心肌缺血45 min/再灌注2 h）。Sham＋7，8-DHF組和I/R＋7，8-DHF組小鼠在心肌I/R損傷前7 d給予腹腔注射7，8-DHF（每日5 mg/kg，溶于PBS中，購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度≥98%）；Sham＋PBS組和I/R＋PBS組則給予相同體積的PBS［10］。

1.3超聲心動圖

使用帶有MS400換能器的Vevo 2100超聲儀在麻醉小鼠（3.0%異氟醚和1.0 L/min的O2流量）中進行二維超聲心動圖掃描。計算左心室射血分數、左心室短軸縮短分數、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑、室間隔厚度、左心室后壁厚度。

1.4心臟質量指數

處死小鼠后收集心臟組織并稱重，計算心臟質量指數＝心臟質量/體質量。

1.5心臟微血管內皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMEC）分離

心肌I/R損傷后分離CMEC［11］。在含有Ca2＋和Mg2＋的培養皿中用Hanks平衡鹽溶液徹底清洗離體心臟。切除心房和右心室，左心室用于后續實驗。將左心室的切除部分與0.2%（w/v）I型膠原酶（美國Gibco公司）一起孵育10min，然后在37 ℃下將0.25%（w/v）胰蛋白酶（美國Hyclone公司）搖浴孵育5 min。在解離步驟之后，通過添加500 μL胎牛血清中和膠原酶，并將混合物通過過濾器轉移到 50 mL Falcon管中。離心后將管底部沉淀的CMEC重新懸浮在5 mL的Hanks平衡鹽溶液I和牛血清白蛋白中，并在37 ℃置于6 cm2的培養皿中。將CMEC分為Sham＋PBS組、Sham＋7，8-DHF組、Sham＋7，8-DHF＋si-TrkB組、I/R＋PBS組、I/R＋7，8-DHF組、I/R＋7，8-DHF＋si-TrkB組。其中，Sham＋7，8-DHF＋si-TrkB組和I/R＋7，8-DHF＋si-TrkB組轉染TrkB小干擾RNA（si-TrkB）。

1.6蛋白質印跡檢測

組織和細胞在補充有蛋白酶抑制劑（美國Thermo Fisher公司）和磷酸酶抑制劑（美國Sigma-Aldrich公司）的RIPA緩沖液（美國Sigma-Aldrich公司）中在冰上裂解10 min。收集裂解物并在4 ℃下以14 000 r/min離心15 min。通過Bio-Rad蛋白質測定試劑盒（美國Bio Rad公司，Bradford方法）測定上清液中的總蛋白質濃度。添加LDS樣品緩沖液（美國Lifetechnologies" " "公司）后，將樣品在90 ℃下煮沸10 min。通過10%～15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離20 μg蛋白質并轉移到0.2 μm硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。第2天，將膜與二抗一起孵育1 h。在用含有0.05% Tween 20（TBST）的Tris緩沖鹽水洗滌3次后，通過PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate（美國Lifetechnologies公司）對膜進行溫育，并在ChemiDoc凝膠成像系統（美國Bio Rad公司）下觀察。使用Image J軟件量化每個蛋白質條的強度。免疫印跡的一抗均購自英國Abcam公司：內皮素-1（ET-1）（1∶1 000），一氧化氮合酶（eNOS）（1∶1 000），p-eNOS（1∶1 000），線粒體輕鏈3（mito-LC3Ⅱ）（1∶1 000），FUN14結構域的1（FUNDC1）（1∶1 000），Tom20（1∶1 000），BDNF（1∶1 000），TrkB（1∶1000）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1∶1 000）。

1.7蘇木精-伊紅（HE）染色分析

將心臟組織固定在4%多聚甲醛中并包埋在石蠟中。組織切片脫蠟和再水化后，進行HE染色以評估紅細胞形態。用光學顯微鏡（日本Olympus公司）獲得圖像。

1.8免疫組織化學分析

對石蠟包埋的心臟組織樣品的4 μm切片進行免疫染色。組織載玻片在二甲苯中脫蠟，并在一系列分級乙醇中再水化。將載玻片用10%山羊血清封閉，用細胞間黏附分子-1（ICAM-1）小鼠單克隆抗體（英國Abcam公司）孵育過夜，然后在室溫下與HRP綴合的二抗孵育30 min。通過DAB檢測抗體結合，并將載玻片浸入去離子水中抑制反應。

1.9線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）開放率測量和線粒體自噬測定

通過向CMEC中加入5 μmol/L Calcein-AM和3 mmol/L氯化鈷（美國Molecular Probes公司）來確定mPTP開放率。結果表示為相對于對照的熒光強度。熒光、pH敏感線粒體自噬報告基因Keima（pMT-mKeima-Red，美國MBL Medical Biological Laboratories公司）具有雙峰激發光譜，由中性pH下的458 nm峰和534 nm在酸性pH條件下達到峰值。按說明書方法，將Kemia-Red質粒轉染到CMEC細胞中。線粒體自噬被量化為534 nm/458 nm激發比［12］。

1.10siRNA轉染

在體外，從各治療組小鼠的心臟中分離CMEC。將細胞培養24 h，使用Lipofectamine RNAiMAX試劑（美國Thermo Fisher公司）將si-TrkB轉染到CMEC細胞中。轉染的細胞在37 ℃下孵育48 h后進行功能分析。

1.11統計學處理

采用GraphPad Prism（7.01版）軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，根據定量分析后的平均值選擇每組的代表圖像。多組比較使用單向或雙向方差分析，對正態分布數據使用Bonferroni或Dunnett多重比較檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.17，8-DHF減少I/R誘導的微血管損傷

HE結果提示，I/R＋PBS組中紅細胞在I/R損傷后聚集成塊，I/R＋7，8-DHF組則維持了紅細胞的線性形態并阻止了其在微血管中的會聚，表明7，8-DHF降低了I/R損傷期間微血栓形成的風險。與Sham＋PBS組相比，I/R＋ PBS組小鼠I/R損傷后心臟組織中血管舒張劑p-eNOS下調（P＜0.05），而內皮血管收縮劑ET-1上調（P＜0.05）。與I/R＋PBS組相比，I/R＋7，8-DHF組p-eNOS的水平上調（P＜0.05），同時ET-1表達下調（P＜0.05）。此外，與Sham＋PBS組相比，ICAM-1在I/R＋PBS組中上調（P＜0.05）。與I/R＋PBS組相比，I/R＋7，8-DHF組ICAM-1下調（P＜0.05）。詳見圖1～圖3、表1。

2.27，8-DHF改善I/R誘導的心臟功能損傷

為了了解微血管結構和內皮功能的改善是否與心臟功能的增加有關，使用超聲心動圖分析心臟功能的改變。與Sham＋PBS組相比，I/R＋PBS組小鼠心臟質量、心臟質量指數、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑增加（P＜0.05），室間隔厚度、左心室短軸縮短分數、左心室射血分數降低（P＜0.05）。與I/R＋PBS組相比，I/R＋7，8-DHF組小鼠心臟質量、心臟質量指數、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑降低（P＜0.05），室間隔厚度、左心室短軸縮短分數、左心室射血分數增加（P＜0.05）。詳見表2。

2.37，8-DHF在I/R損傷中誘導線粒體自噬

線粒體自噬標志物的蛋白質印跡分析表明，I/R＋PBS組中微管相關蛋白mito-LC3Ⅱ的線粒體水平較Sham＋PBS組降低（P＜0.05），而I/R＋7，8-DHF組mito-LC3Ⅱ水平較I/R＋PBS組增加（P＜0.05）。在I/R處理的CMEC中，將mt-Kemia檢測酸性線粒體作為溶酶體吞噬線粒體的標志物，結果表明，I/R＋PBS組CMEC中酸性自溶酶體形成較Sham＋PBS組減少（P＜0.05），而I/R＋7，8-DHF組CMEC中酸性自溶酶體形成較I/R＋PBS組增加（P＜0.05）。表明7，8-DHF可在心臟微血管I/R損傷中誘導線粒體自噬。詳見圖4、圖5、表3。

2.4BDNF/TrkB信號通路激活FUNDC1依賴性線粒體自噬

蛋白質印跡分析顯示，I/R＋PBS組CMEC中BDNF、TrkB、FUNDC1蛋白表達較Sham＋PBS組降低（P＜0.05），而I/R＋7，8-DHF組BDNF、TrkB、FUNDC1蛋白表達較I/R＋PBS組增加（P＜0.05）。當在7，8-DHF存在的情況下施用si-TrkB以抑制CMEC中的TrkB活化時，FUNDC1的表達被抑制（P＜0.05），并且mito-LC3Ⅱ的線粒體水平和酸性自溶酶體形成減少（P＜0.05）。表明BDNF/TrkB/FUNDC1通路激活I/R處理的CMEC中的線粒體自噬。詳見圖6、表4。

3討論

本研究表明，BDNF/TrkB/FUNDC1介導的線粒體自噬在微血管I/R損傷期間有重要價值，其有助于維持內皮細胞穩態和微血管完整性；BDNF模擬物7，8-DHF可以作為一種內皮特異性保護藥物，通過維持內皮功能和結構來幫助心臟微血管對抗I/R損傷；7，8-DHF通過增加線粒體自噬來預防I/R誘導的微血管功能障礙。

研究表明，在橫向主動脈縮窄引起的心力衰竭中，7，8-DHF可通過蛋白激酶B（AKT）/心肌組織eNOS/一氧化氮途徑抑制內皮細胞凋亡并維持毛細血管化，從而提高心臟功能［13］。7，8-DHF通過抑制炎性細胞因子的產生來抑制實驗性腦出血期間白細胞-內皮細胞的相互作用［14］。這些研究表明，7，8-DHF激活特定的信號級聯以改善線粒體抗氧化活性，增強抗炎能力并誘導內皮細胞的促存活程序。本研究結果表明，7，8-DHF對內皮功能和結構具有多效性，7，8-DHF在心臟I/R損傷的情況下增強了內皮完整性、屏障功能和松弛因子的產生。另一方面，7，8-DHF顯著抑制內皮黏附蛋白表達，使局部流體力學正常化，維持組織良好的血管壁并改善微血管灌注。

線粒體除了執行葡萄糖代謝和能量產生的經典功能外，還可充當細胞適應環境壓力的傳感器［15］。線粒體損傷會導致內皮功能障礙和心臟微血管I/R損傷［16］。心肌再灌注迅速增強線粒體裂變因子誘導的線粒體裂變，導致mtDNA損傷和內皮氧化應激［16］。此外，再灌注通過誘導線粒體膜高滲透性、mPTP開放和細胞色素c滲漏來激活線粒體凋亡［17］。線粒體自噬被認為是通過維持線粒體裂變/融合正常化來修復受損和功能失調的線粒體［18］。增加的線粒體裂變和/或減少的線粒體融合會促進碎片線粒體的形成，促進細胞氧化應激或將促凋亡因子（如細胞色素C）釋放到細胞質中，從而誘導線粒體依賴性細胞凋亡［19］。線粒體自噬通過去除碎片化線粒體在內皮細胞中發揮抗氧化和/或抗凋亡作用［20］。然而，在心肌再灌注階段，線粒體自噬受到抑制［21］。本研究發現，7，8-DHF在I/R損傷期間通過誘導BDNF/TrkB/FUNDC1信號通路恢復線粒體自噬，從而減少CMEC中的線粒體損傷。TrkB的基因消融可逆轉7，8-DHF誘導線粒體自噬。這些發現表明，7，8-DHF主要通過在I/R損傷下保持線粒體自噬來維持內皮線粒體的性能。

綜上所述，本研究揭示了激活BDNF/TrkB/FUNDC1信號通路通過恢復線粒體自噬來改善I/R損傷小鼠的內皮功能和微血管結構，BDNF/TrkB/FUNDC1/線粒體自噬軸和內皮保護之間的聯系，將有助于探索心臟微血管I/R損傷的新治療靶點和藥物。

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（收稿日期：2022-10-06）

（本文編輯鄒麗）