miR-182-5p促進心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的機制研究

摘要目的：探究miR-182-5p對心肌細胞凋亡的影響，進而以更好的闡明miR-182-5p在心肌梗死中的作用和意義。方法：構建大鼠心肌梗死模型，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）法檢測心肌凋亡、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）及蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測miR-182-5p及凋亡相關分子的表達。使用miR-182-5p mimics及inhibitor轉染大鼠心肌細胞H9c2，構建缺氧模型，細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測心肌細胞活力，Western Blot法檢測凋亡相關指標表達水平，半胱氨酰蛋白酶3/7（Caspase-3/7）活性檢測試劑盒檢測Caspase-3/7的活性。使用pAAV9-CMV腺相關病毒構建miR-182-5p的過表達病毒，通過尾靜脈注射至心肌梗死模型小鼠體內，檢測AAV9-miR-182-5p對心肌梗死誘導的心肌凋亡水平的影響。結果：大鼠心肌梗死模型中miR-182-5p表達水平減少，且細胞凋亡水平增加。在H9c2心肌缺氧模型中，miR-182-5p可以加重缺氧對心肌細胞活力的抑制，并減少抗凋亡分子B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、增加促凋亡分子Bcl-2相關X蛋白（Bax）的表達，同時對Caspase-3/7的活性有明顯的促進作用。而AAV9-miR-182-5p的注射可以顯著加重小鼠心肌梗死模型中心肌細胞的凋亡水平。結論：miR-182-5p可以加重心肌梗死下的心肌損傷，其途徑是通過促進凋亡來實現的。

關鍵詞心肌梗死；miR-182-5p；心肌缺氧；細胞凋亡；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.011

Mechanism of miR-182-5p Promoting Myocardial Cell Apoptosis in Rats with Myocardial Infarction

PEI Yajun， WANG Yanhong

Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi， China; Third Hospital of Shanxi Medical University（Shanxi Bethune Hospital， Shanxi Academy of Medical Sciences， Tongji Shanxi Hospital）， Taiyuan 030032， Shanxi， China

Corresponding AuthorWANG Yanhong， E-mail： wangyanhongmail@126.com

AbstractObjective：To investigate the mechanism of miR-182-5p promoting myocardial cell apoptosis in rats with myocardial infarction.Methods：Myocardial infarction model of rats was constructed.Myocardial apoptosis was detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.The expression of miR-182-5p and apoptosis-related molecules were detected by real-time quantitative fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot.miR-182-5p mimics and inhibitor transfected rat cardiomyocytes H9c2 to construct hypoxia model.Cell count Kit 8（CCK-8） was used to detect cardiomyocyte cell viability.The expression levels of apoptosis-related factor were detected by Western Blot.Caspase-3/7 activity detection kit was used to detect the activity of Caspase-3/7.The overexpression virus of miR-182-5p was constructed using pAAV9-CMV adeno-associated virus and injected into the mouse model of myocardial infarction through the tail vein to detect the effect of AAV9-miR-182-5p on the level of myocardial apoptosis induced by myocardial infarction.Results：The expression level of miR-182-5p decreased and the apoptosis level increased in the rat model of myocardial infarction.In H9c2 myocardial hypoxia model，miR-182-5p could aggravate the inhibition of hypoxia on cardiomyocyte viability，reduce the anti-apoptotic molecule B-cell lymphoma 2（Bcl-2），and increase the expression of pro-apoptotic molecule Bcl-2 associated X protein（Bax）.At the same time，the activity of Caspase-3/7 was significantly promoted.The injection of AAV9-miR-182-5p significantly increased the level of apoptosis of cardiomyocytes in mouse myocardial infarction models.Conclusion：miR-182-5p can aggravate myocardial damage after myocardial infarction by promoting apoptosis.

Keywords myocardial infarction; miR-182-5p; myocardial hypoxia; cell apoptosis; experimental study

心血管疾病是全球三大死亡疾病之一，其中，心肌缺血導致的心肌梗死是其主要因素，心肌梗死已成為最常見的單一死亡病因［1-2］。目前，針對心肌梗死的治療主要是通過冠狀動脈搭橋、溶栓等恢復心肌血流供應的再灌注療法，但是由缺血再灌注造成的心率失常發作、心肌功能失常及心肌梗死面積的增加等又成為治療過程中新的難題［3-5］。因此，探究心肌梗死的發病機制，對于心肌梗死的診治非常重要。

miR-182-5p是一種內源性短鏈非編碼的RNA分子，在轉錄水平通過抑制翻譯或誘導降解靶mRNA的功能。研究表明，miR-182-5p在動脈粥樣硬化、心肌梗死、心室重塑等心血管疾病方面具有重要作用［6-8］。miR-182-5p可作為慢性心力衰竭病人預后良好的預測因素，為心肌疾病的診斷、治療以及預后提供新的策略［9-11］。在心肌梗死的體內外模型中發現，抑制miR-182-5p可顯著減少缺血缺氧造成的心肌損害［12-13］。而促進miR-182-5p的表達，可緩解心肌梗死、提高心肌存活，體現miR-182-5p對心肌功能的保護作用［14］。然而miR-182-5p在心肌梗死中的確切作用機制尚不明確。

由缺血缺氧引起的心肌細胞死亡最主要的表現形式之一為細胞凋亡，是心肌梗死后心肌細胞持續丟失，從而造成心室重構、心力衰竭、心源性猝死的重要原因［15-17］。減少心肌細胞凋亡的發生是改善梗死心肌損傷的重要研究方向，并成為判斷分子/藥物/處理因素等對心肌梗死影響的重要參考指標［18-19］。本研究擬觀察心肌梗死及缺氧前后，miR-182-5p對心肌凋亡的影響，為闡明miR-182-5p對心肌梗死的分子病理機制研究提供更為確切的理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

無特定病原體（SPF）級8～10周齡成年健康雄性SD大鼠36只，實驗大鼠心肌梗死模型用于檢測心肌細胞凋亡、miR-182-5p及凋亡相關分子的表達水平。體質量220～280 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供。SD大鼠自購回后保持自由飲水、進食，溫度23～25 ℃，適應性喂養1周后分為假手術（Sham）組和心肌梗死組。

SPF級8周齡C57BL/6雄性小鼠60只，實驗小鼠心肌梗死模型主要用于驗證miR-182-5p在體內對心肌梗死的影響。體質量20 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司。

所有動物飼養于北京邁德康納動物實驗中心，分籠飼養，環境溫度為20～25 ℃，相對濕度60%，采用明暗各12 h交替的動物照明光循環照明，動物飲用水及籠具經高壓滅菌鍋滅菌處理，飼料及墊料均經輻照處理，自由飲水，每天更換1次墊料。動物在動物房中適應性喂養7 d后進行實驗造模。

1.2主要試劑

DMEM（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）培養基和胎牛血清購自Gibco公司，胰酶和Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司，RNA反轉錄試劑盒購自北京生東科技有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，Lipofectamine3000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，細胞計數試劑盒-8（CCK-8）和活性氧（ROS）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司等。

1.3心肌梗死模型的構建

大鼠心肌梗死模型的構建：將大鼠分為實驗組與假手術組，每組3只。實驗組采用苯巴比妥鈉麻醉大鼠（用量為100 mg/kg），無菌環境下切開氣管并插管，連接呼吸機，調整頻率為60次/min。左側胸部去毛碘伏消毒，于第3、第4肋間開胸，撕開心包，暴露心臟，擠出心臟在左心耳的右緣下1～2 mm處、肺動脈圓錐左緣處用圓針穿過左冠狀動脈前降支下方的心肌表層，用5-0線結扎，結扎成功后，可觀察到結扎血管以下心室壁稍變白，立即將心臟放入胸腔并縫合胸腔，用注射器將胸腔內空氣抽出，確定無開放性氣胸后依次縫合胸壁各層組織。對于假手術組，僅穿線不結扎，其他同實驗組。

小鼠心肌梗死模型的構建：將小鼠分為空載體組與miR-182過表達組，每組3只。其中，空載體組只注射空載體腺相關病毒，miR-182過表達組注射miR-182-5p的腺相關病毒，兩組均進行心肌梗死模型的構建。麻醉小鼠，用帶6-0不可吸收絲線的小圓針在左心耳下緣2～3 mm處結扎左冠狀動脈前降支（LAD），結扎成功后心尖瞬間變白，立即用止血鉗撐開切口將心臟送回胸腔，收緊荷包關閉胸腔。

1.4大鼠心肌細胞的培養

H9c2大鼠胚胎心肌細胞購自上海中科院細胞庫，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養細胞，在95%空氣＋5%CO2環境下進行常氧培養。在細胞匯合度為80%時使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶消化并傳代，待細胞匯合度為60%～80%時進行實驗。

1.5大鼠心肌細胞缺氧模型的建立

缺氧實驗的前1 d，按照2.5×106個細胞傳代至60 mm的細胞培養皿，在37 ℃培養箱中貼壁過夜。第2天，預先使用缺氧操作臺將氧氣濃度降低到1%以下，在缺氧操作臺中使用氮氣預處理完全培養基以除去氧氣，然后將細胞放置在缺氧操作臺進行換液，更換完液體，使用缺氧轉移倉將細胞放置在1%氧氣濃度的三氣培養箱中，37 ℃培養。在0、6、12、24、48 h后分別取樣后，將細胞轉移至缺氧操作臺進行實驗。

1.6腺相關病毒的構建與注射

使用pAAV9-CMV_bGI-EGFP-3xFlag-mmu構建miR-182-5p的腺相關病毒，病毒構建相關過程委托天津舍維斯生物進行。病毒收集后保存至－80 ℃冰箱備用。然后進行病毒尾靜脈的注射，將小鼠放置在固定槽中，固定槽背部有數個可將尾巴穿過的小孔，將尾巴從小孔中穿出后，暴露尾靜脈，75%乙醇擦拭，使尾靜脈充分擴張，使用4號針頭，將純化后的腺相關病毒按照3×1011 PFU的病毒滴度，每只注射50 μL，適應性飼養2周后，觀察小鼠活動、進食、飲水等生命體征，取生長狀況良好的小鼠，取心肌組織后，觀察綠色熒光以及miR-182-5p的表達水平。將鑒定成功的小鼠用于之后的心肌梗死實驗。

1.7末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測心肌細胞凋亡

取材后，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定。將組織浸泡乙醇脫水10 min。將脫水后的組織分別浸泡在二甲苯中透明10 min。將透明處理過的組織浸泡于融化的石蠟中3 h后，包埋，用切片機將石蠟塊中的組織切成5 μm厚的薄片，并平鋪于防脫玻片上。將切片放置于55 ℃烤片機上，使組織片緊貼于防脫玻片上，然后進行石蠟切片脫蠟復水后，加入50 μL TUNEL反應混合液于樣本上，放入濕盒，恒溫培養箱（37 ℃）中孵育60 min；用1×PBS洗滌樣本3次，每次3 min；再使用蘇木素染色液進行細胞核染色。最后，PBS洗滌3次，用中性樹脂封固，光鏡下檢查。

1.8實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 miR-182-5p的表達水平

超凈工作臺中備好去除RNA酶的實驗用品，將不同實驗組細胞棄掉細胞培養液，預冷PBS沖洗2遍，TRIzol法提取細胞內總RNA。超微量分光光度計測定RNA濃度和純度，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA。qRT-PCR反應體系：cDNA模板1 μL，正向、反向引物（10 mmol/L）各0.5 μL，PCR混合液10 μL，過氧化氫溶液8 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，引物退火34 s，72 ℃ 30 s，40個循環；熔解溫度95 ℃ 1 min，55 ℃ 1min，95 ℃ 15 s。以U6為內參對照，每組3個重復，計算機系統自動分析各樣本Ct值，使用公式2－ΔΔCt計算基因相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見表1）。

1.9蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測蛋白質表達水平

配制含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，裂解液成分為：50 mmol/L氯化氫三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCL），150 mmol/L氯化鈉（sodium chloride，NaCl），1%曲拉通 X-100（Triton X-100，Triton X），1%去氧膽酸鈉（sodium deoxycholate），0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）。蛋白酶抑制劑成分為：2 μg/mL抑肽酶（aprotinin）、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、1 μg/mL亮肽素（Leupeptin）的蛋白酶抑制劑。以上試劑均購自Sigma-Aldrich公司。所有實驗操作均在冰上進行。裂解蛋白后，雙縮脲蛋白定量法（bicinchoninic acid assay，BCA）法定量，取30 ng的總蛋白上樣。電泳條件為：120 V 15 min，150 V 55 min，轉膜條件為：恒流300 mA 2 h。使用含有5%脫脂奶粉的含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with tween-20，PBS-T）封閉1 h，抗體孵育過夜，使用的抗體稀釋條件為：缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α，NB100-105，1∶1 000；Novus Biologicals），β-肌動蛋白（Beta-actin，β-actin，ab49900，1∶10 000，HRP-conjugated；Abcam），B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）（26593-1-ap，1∶1 000；proteintech），Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax，ab32503，1∶2 000；Abcam），Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa蛋白相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3，Bnip3，ab109362，1∶1 000；Abcam），腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，P53，ab26，1∶1 000；Abcam），半胱氨酸蛋白酶3（Cysteine-aspartic protease 3，Caspase-3，19677-1-AP，1∶500；proteintech），半胱氨酸蛋白酶7（cleaved Caspase-7）（＃8438，1∶500；CST），裂解多聚ADP核糖聚合酶［cleaved Poly（ADP-ribose）polymerase，cleaved PARP］（#9542，1∶500；CST）。次日，洗膜后，加入山羊抗兔（1∶25000，Bioss Antibodies）、山羊抗小鼠（1∶25 000，Bioss Antibodies）的抗體孵育4 h。使用ChemiDoc MP Imaging System（Bio-Rad Laboratories）進行蛋白成像。

1.10miR-182 mimics和inhibitor的轉染

miR-182模擬物（mimics）、抑制物（inhibitor）以及對照物（control）購自北京梓熙生物，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）將其轉染至H9c2細胞，所有操作按照說明書進行。轉染完成后，使用無血清培養基孵育細胞過夜，次日更換培養基，24～48 h后驗證轉染效率，驗證成功后進行后續實驗。

1.11流式細胞術檢測細胞凋亡

新鮮心肌組織用眼科剪剪成肉糜狀，磷酸緩沖液反復清洗去除血細胞，胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶1∶1比例消化，消化完全后300目網篩過濾，添加胎牛血清終止消化。160 g/min離心10 min，棄上清，磷酸緩沖液反復吹打、清洗細胞，制成心肌細胞單細胞懸濁液。5×106個/mL細胞取100μL，加 5 μLAnnexinV-PE、1 μL 7-氨基放線菌素D（7-aminoactinomycin D，7AAD）溶液，避光冰上孵育10 min，加400 μL冰的Binding Buffer，30 min內流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡情況。

1.12CCK-8法檢測細胞活力

檢測前，計數細胞，將細胞濃度調整至2×104個/mL的濃度，接種于96孔板，每組設置5個復孔。然后在37 ℃細胞培養箱中培養過夜，于第2天，將細胞放置于1%O2、5%CO2、94%N2的三氣培養箱中培養48 h，同時設正常條件下培養的細胞為對照組。培養結束后每孔中加入10 μL CCK-8工作液，于培養箱中繼續培養3 h，酶標儀測定450 nm處光密度（OD）值，去掉最大值與最小值后，每組結果取平均值，細胞存活率按照以下公式計算。細胞存活率（%）＝（缺氧組OD值－空白組OD值）/（正常組OD值－空白孔OD值）×100。

1.13Caspase-3/7活性水平的檢測

使用Caspase-3/7細胞凋亡活性檢測試劑盒（Sangon Biotech）檢測Caspase-3/7的活性。準備兩個96孔板，每個96孔板中，將2×104個細胞接種于每孔中，每組設置三個復孔。過夜貼壁后，顯微鏡下觀察細胞狀態，然后將其中一個96孔板放置于1%O2、5%CO2、94%N2的培養箱中進行缺氧培養，另一個96孔板放置在5%CO2、95%空氣的正常條件下為對照組。培養結束后，更換Caspase-3/7檢測緩沖液，并在37 ℃，5%CO2培養箱中避光孵育1.5 h，檢測Ex/Em＝490/525 nm處的熒光強度。

1.14統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1心肌梗死誘導miR-182-5p降低伴心肌細胞凋亡發生

TUNEL結果顯示，與假手術組相比，實驗組大鼠梗死心肌組織凋亡細胞顯著增加（見圖1），miR-182-5p的表達水平降低（P＜0.05），詳見圖2，而凋亡相關分子Bcl-2在心肌梗死后降低，促凋亡分子Bax表達水平上調（P＜0.05），對凋亡具有多重影響的HIF-1α表達水平也上調（P＜0.05），詳見圖3。H9c2心肌細胞在缺氧下miR-182-5p的表達水平隨著缺氧時間的延長（0、6、12、24、48 h）逐漸下降（P＜0.05），展現出與心肌梗死較為一致的趨勢（見圖4）。表明缺血缺氧造成的心肌細胞損傷，會伴隨著凋亡事件的產生，并且會造成miR-182-5p的表達水平下降。

2.2抑制miR-182-5p促進缺氧心肌細胞的增殖

結果顯示，miR-182-5p mimics/inhibitor成功轉染至H9c2（見圖5）。在缺氧的不同時間下（0、24、48 h），miR-182-5p mimics可以抑制心肌細胞在缺氧48 h下的細胞活力，miR-182-5p inhibitor可以導致H9c2心肌細胞的活力升高（見圖6）。以上結果表明，miR-182-5p對心肌細胞增殖的抑制作用。

2.3miR-182-5p對缺氧心肌細胞H9c2凋亡水平的影響

結果顯示，miR-182-5p的過表達可以增加心肌細胞在缺氧下的Caspase-3活性水平，而其抑制可以顯著降低心肌細胞在缺氧下的Caspase-3活性水平（見圖7）。進一步分析發現，miR-182-5p的過表達可以顯著降低心肌細胞在缺氧下Bcl-2的表達、促進Bax的表達，而miR-182-5p inhibitor，可造成心肌細胞在缺氧下Bcl-2表達水平的增高以及Bax表達水平的降低（見圖8、圖9）。以上結果提示，miR-182-5p對缺氧心肌凋亡的促進作用。

2.4AAV9-miR-182-5p的注入可以加大小鼠心肌梗死的損傷

結果顯示，AAV9-miR-182-5p注射后，miR-182-5p過表達組小鼠心肌組織顯示了明亮的綠色熒光（見圖10），并且較空載體組明顯上升（見圖11），表明成功將AAV9-miR-182-5p感染到小鼠心肌細胞內。小鼠心肌梗死模型下，AAV9-miR-182-5p可以顯著降低抗凋亡分子Bcl-2的表達，增加促凋亡分子Bax表達以及凋亡執行分子Caspase-3的活性（見圖12）。流式細胞術結果顯示，miR-182-5p的表達可以顯著增加心肌組織凋亡率（見圖13）。以上結果表明，miR-182-5p是一個對梗死心肌有負面影響的分子，且對凋亡相關事件發揮重要的促進作用。

3討論

本研究結果顯示，在心肌梗死的體內外模型中發現，miR-182-5p顯著加重了心肌梗死后的心肌凋亡，并對心肌功能產生負面影響。miR-182在人和小鼠中具有相似的表達模式［20］，但在不同組織和細胞中的表達差異較大［21-23］，從而產生特定的調控作用。研究表明，血清miR-182的上調可能是慢性心力衰竭的標志性分子［6，9，11］，其抑制或表達增加會極大地影響心血管疾病的發展。表明miR-182-5p可能是心肌梗死基礎研究或未來診治相對較好的指標分子。

研究顯示，抑制miR-182-5p可以改善梗死心肌損傷［24］；而下調miR-182-5p在缺氧條件下可顯著抑制心肌細胞的損傷與凋亡［12］。提高miR-182-5p的表達在缺氧條件下可促進細胞增殖并抑制凋亡［25］。另有研究表明，通過外泌體導入miR-182-5p可靶向調控TLR4的表達，抑制多種炎癥通路，顯著提高心肌梗死小鼠的存活率并改善心功能［26］。本研究中，通過對H9c2心肌細胞進行不同缺氧梯度處理，以及使用AAV9病毒包裝以實現基因干預，觀察到miR-182-5p對心肌功能和心肌梗死的負面影響。

缺血性心肌病和一些先天性心臟病的發展與細胞凋亡密切相關。缺血缺氧引起的心肌細胞凋亡導致心肌細胞逐漸丟失、膠原支架斷裂、心室擴張和心室重塑，是多種心臟不良事件的重要原因［27-29］。目前，針對miR-182在心肌梗死中對凋亡途徑的影響，仍有很多不明確的地方。參與凋亡調控的Bcl家族蛋白，如Bcl-2、Bax等，在啟動與抑制凋亡方面起著重要作用。Bcl-2是經典的抗凋亡分子，在心肌梗死研究中顯示，其通過多種機制抑制凋亡［30-32］。Bax是主要的促凋亡基因，通過激活Caspase-9和調節內質網與線粒體介導的凋亡啟動［32-34］。Bax與Bcl-2的比例是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素［35-37］。本研究表明，miR-182-5p通過促進凋亡相關分子表達并抑制抗凋亡分子表達，增加心肌細胞在缺血缺氧條件下的凋亡，明確了其對心肌功能的影響。

綜上所述，miR-182-5p是一個促進心肌凋亡的重要指標，緩解由其引起的損傷具有重要的臨床意義。探究miR-182-5p在心肌梗死/缺氧條件下對凋亡分子的具體調控機制，尋找關鍵靶點，是未來研究的重點，并可能為基因治療心肌梗死提供新的理論依據。

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（收稿日期：2023-10-23）

（本文編輯鄒麗）