利用InDel標記鑒定不同橘柚品種

摘" " 要：【目的】橘柚（tangelo）是一類含有橘（mandarin，Citrus reticulata Blanco）和柚[pummelo，C. maxima （Burm.） Merr.]血統的雜種柑橘。旨在挖掘能快速有效區分和鑒定不同橘柚品種的插入缺失（InDel）分子標記。【方法】利用第二代測序技術對兩種橘柚（陽光1號和陽光2號）及其親本（愛媛28號和春香）進行全基因組重測序，通過生物信息學分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測，挖掘、篩選和確定大于30 bp或小于-30 bp的InDel標記，使用這些標記鑒定和區分10個不同橘柚品種，并對共51份種質資源進行基因分型及遺傳多樣性分析。【結果】在4個柑橘品種的基因組共鑒定到607 376個InDel位點，產生657 414種變異方式，并進一步篩選出48個大于30 bp或小于-30 bp的InDel標記。他們適用于普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，操作簡單，省力省時，成本低。這些InDel標記能夠對10個橘柚品種進行基因分型，區別和鑒定不同橘柚品種，在51份種質資源中具有遺傳多樣性，其中I3_744、I7_170、I8_516、I8_533、I9_669等InDel標記具有高多態信息含量（PIC）和期望雜合度（He）及低最大等位基因頻率（MAF）的特點。基于這48個InDel標記基因分型的主坐標分析（PCoA）展示了51份種質資源的遺傳距離，他們在PCoA二維散點圖中的分布與已知的柑橘類型劃分總體一致。【結論】發掘的48個適合普通瓊脂糖電泳檢測的InDel標記能準確快速區分和鑒定不同橘柚品種，也有助于對柑橘作物的遺傳多樣性和群體進行分類分析。

關鍵詞：柑橘；橘柚；InDel；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）08-1477-13

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20240033

利用InDel標記鑒定不同橘柚品種

余 歆1，郭 意2，劉小豐1，萬潤楚1，江 東1，曹 立1*

（1西南大學柑桔研究所，重慶" 400712； 2四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川眉山" 620036）

摘" " 要：【目的】橘柚（tangelo）是一類含有橘（mandarin，Citrus reticulata Blanco）和柚[pummelo，C. maxima （Burm.） Merr.]血統的雜種柑橘。旨在挖掘能快速有效區分和鑒定不同橘柚品種的插入缺失（InDel）分子標記。【方法】利用第二代測序技術對兩種橘柚（陽光1號和陽光2號）及其親本（愛媛28號和春香）進行全基因組重測序，通過生物信息學分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測，挖掘、篩選和確定大于30 bp或小于-30 bp的InDel標記，使用這些標記鑒定和區分10個不同橘柚品種，并對共51份種質資源進行基因分型及遺傳多樣性分析。【結果】在4個柑橘品種的基因組共鑒定到607 376個InDel位點，產生657 414種變異方式，并進一步篩選出48個大于30 bp或小于-30 bp的InDel標記。他們適用于普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，操作簡單，省力省時，成本低。這些InDel標記能夠對10個橘柚品種進行基因分型，區別和鑒定不同橘柚品種，在51份種質資源中具有遺傳多樣性，其中I3_744、I7_170、I8_516、I8_533、I9_669等InDel標記具有高多態信息含量（PIC）和期望雜合度（He）及低最大等位基因頻率（MAF）的特點。基于這48個InDel標記基因分型的主坐標分析（PCoA）展示了51份種質資源的遺傳距離，他們在PCoA二維散點圖中的分布與已知的柑橘類型劃分總體一致。【結論】發掘的48個適合普通瓊脂糖電泳檢測的InDel標記能準確快速區分和鑒定不同橘柚品種，也有助于對柑橘作物的遺傳多樣性和群體進行分類分析。

關鍵詞：柑橘；橘柚；InDel；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）08-1477-13

柑橘是我國和世界的第一大果樹作物，屬蕓香科（Rutaceae）真正柑橘果樹組（true citrus fruit tree group）[1]。常見的柑橘作物分布于柑橘屬（Citrus）、枳屬（Poncirus）和金柑屬（Fortunella）[2]。柑橘是蜜源植物，缺乏種間甚至屬間的生殖隔離，通過自然或人工授粉易產生種間甚至屬間雜交種。橘柚（tangelo）屬于一類雜種寬皮柑橘。一些橘柚是葡萄柚（C. paradisi Macf.）或柚[C. maxima （Burm.） Merr.]和橘（C. reticulata Blanco）的雜種[3]，例如奧蘭多（Orlando）和明尼奧拉（Minneola）橘柚就是鄧肯（Duncan）葡萄柚和丹西（Dancy）紅橘的雜種后代。廣義上，具有橘柚風味特征的橘柚雜種后代，例如費爾柴爾德[Fairchild，奧蘭多橘柚與克里曼丁橘（Clementine）的雜種]，都可被認為是橘柚。此外，日本雜柑春香（Haruka）也被認為是橘柚，這是因為春香是日向夏（Yuganatsu，C. tamurana Hort. ex Tanaka）和夏蜜柑（Natsudaidai，C. natsudaidai Hayata）的雜種后代[4]，其父本夏蜜柑在柑橘斯文格（Swingle）分類系統中屬于柚類。由于橘柚兼具橘和柚的特征，風味獨特，較易剝皮，近年來越來越受到消費者的歡迎和柑橘育種工作者的重視。

中國的橘柚育種工作起步晚，但目前已有所突破。筆者所在的研究團隊在愛媛28號[Ehime Kashi No. 28，為南香（Nanko）與天草（Amakusa）橘橙的雜交后代]與春香橘柚的雜交后代中，篩選出了兩個性狀優良、具有商業價值的株系，分別命名為陽光1號和陽光2號橘柚，其中陽光1號已獲得植物新品種權，目前在中國的栽培面積約為3300 hm2，并正在迅速推廣。

分子標記（molecular marker）是植物基因分型（genotyping）、品種鑒定、遺傳多樣性分析和輔助育種的重要工具[5-8]。在柑橘研究中，除了廣泛應用的SSR（simple sequence repeats）[9-24]和SNP（single nucleotide polymorphism）[18，24-30]標記之外，InDel（insertion-deletion）因含量豐富且具共顯性的特點，也受到了人們的關注。在較早的研究中，Garcia-Lor等[24]對45種真正柑橘果樹組植物的27個基因進行桑格（Sanger）測序，獲得了50個InDel標記，結合SSR和SNP，他們可有效應用于對真正柑橘果樹組植物的系統發育和種間遺傳結構分析。Fang等[31]根據已公布的多種柑橘的全基因組測序數據，共挖掘到1958個InDel標記，其中268個為30～200 bp的大片段InDel，這些標記可區分柑橘屬、枳屬和金柑屬植物。日本學者Noda等[32]利用119個適用于瓊脂糖凝膠電泳檢測的InDel，成功地將溫州蜜柑（satsuma）的合子胚從珠心胚群體中篩選出來；后又從中篩選了28個標記，成功地區分了31種雜種柑橘[33]。湯雨晴等[34]鑒定了金蘭柚的全基因組InDel，并篩選出2個能將金蘭柚與其他47種柚類區分的InDel標記。

筆者首先對陽光1號和陽光2號橘柚及其親本愛媛28號和春香進行全基因重測序，從中發掘出48個適用于普通瓊脂糖電泳檢測的InDel標記，并進一步評價了這些InDel在51份種質資源的遺傳多樣性，用主坐標分析（PCoA）展示了他們的遺傳距離。基于這48個InDel標記的基因分型是區分和鑒定橘柚品種的有效簡易方法，也可應用于真正柑橘果樹組植物的遺傳多樣性和群體分類分析。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料枸櫞（C. medica L.）為普通枸櫞和佛手；金柑（Fortunella spp.）為寧波羅浮和四季橘；橘類為立花橘、汕頭酸橘、武隆酸橘、克里曼丁橘、尾張、宮川早生、粗皮狗屎柑、莽山野橘、蘆柑、椪柑、大紅袍、清見、春見、砂糖橘、中柑所5號、無核紀州柑、本地早、伊予柑、藥香柑和愛媛28號；橘柚（C. reticulata Blanco）為春香、陽光1號、陽光2號、奧蘭多、明尼奧拉、甜春、科肯、諾瓦、費爾柴爾德和清峰；檸檬[C. limon （L.） Burm. f.]為里斯本、尤力克和北京檸檬；葡萄柚為馬敘和胡柚；甜橙[C. sinensis （L.） Osbeck]為塔羅科、北碚447、紐荷爾、哈姆林和伏令夏橙；香橙（C. junos Siebold. ex Tanaka）為資陽香橙和蟹橙；柚為強得勒和琯溪蜜柚；枳（P. trifoliata Raf.）為孝感枳、湖北早實枳和飛龍枳，共51份種質資源，其中陽光1號和陽光2號橘柚來自重慶奔象果業有限公司，其他種質資源來自國家柑橘種質資源圃。

1.2 基因組DNA提取

使用RaPure Plant DNA Kit（美基生物，廣州）提取健康成熟葉片的基因組DNA。使用Nanodrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測所提取DNA濃度和質量。當DNA質量濃度大于10 ng·μL-1且OD260/280和OD260/230在1.8～2.1時，可用于后續試驗的建庫測序和PCR擴增。

1.3 全基因組重測序及InDel挖掘

用Bioruptor Pico系統（Diagenode，比利時）對所提基因組DNA進行剪切，形成約350 bp的片段。使用TrueLib DNA Library Rapid Prep Kit（依科賽生物，深圳）建庫，用NovaSeq 6000 Sequencer（Illumina，美國）進行平均深度為10×的雙端測序。濾去低質量（N比例大于10%或Phred＜10的比例小于50%）的讀長（read）后，用BWA[35]與克里曼丁橘的基因組序列（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）比對，用GATK[36]獲取和過濾InDel。過濾標準：（1）濾去10 bp內的相鄰InDel；（2）變異位點的質量值（QUAL）大于30；（3）變異質量值與覆蓋深度得到的比值（QD）大于2.0；（4）比對質量值的均方根（MQ）大于40；（5）費舍爾精確檢驗（Fisher’s exact test）正負鏈偏差（FS）小于60；（6）其他GATK設定的默認值。所得變異用SnpEff[37]進行注釋。

1.4 引物設計和PCR擴增

使用BatchPrimer3[38]，對變異長度大于30 bp或小于-30 bp的InDel的兩端設計引物，PCR產物長度約為200 bp，引物信息見表1。用MonAmp? 2× Taq Mix（莫奈生物，上海）進行PCR，反應程序為94 ℃ 3 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，最后72 ℃反應2 min。PCR產物用含1/10 000 AidRed（艾得萊，北京）的2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下拍照記錄。

1.5 遺傳多樣性分析和主坐標分析（PCoA）

使用PowerMarker（V3.25）計算群體遺傳學參數，包括基因型數量（Ng）、等位基因數量（Na）、有效等位位點數量（Ne）、最大等位基因頻率（MAF）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）和多態信息含量（PIC）。主坐標分析基于51份種質資源的歐氏遺傳距離，使用R語言ade4程序包，用ggplot2程序包繪制散點圖。

2 結果與分析

2.1 全基因組InDel的挖掘

陽光1號、陽光2號、愛媛28號和春香的基因組重測序原始數據（fastq格式）已上傳至中國國家基因庫（https：//db.cngb.org，項目號CNP0001863）。每一個品種都產生了超過1000萬個高質量讀長（read）和30億個堿基，Q20和Q30均分別大于96%和92%，正確定位到克里曼丁橘參考基因組的讀長比例均大于85%，1×基因組覆蓋度均超過89.9%，5×基因組覆蓋度超過67.95%，平均深度超過7×。以上結果表明，測序數據質量良好，可用于后續的變異檢測及相關分析。

通過與克里曼丁橘的基因組對比以及GATK軟件對變異的提取和過濾，筆者在4個品種的基因組中分別獲得了285 757（愛媛28號）、338 510（春香）、320 991（陽光1號）和296 648個（陽光2號）InDel位點（圖1-A）。作為雜交后代，陽光1號和陽光2號的InDel位點數目介于兩個親本之間。愛媛28號的InDel數目明顯低于春香，這是因為愛媛28號是南香（Nanko）和天草（Amakusa）的雜交后代，而南香的母本正是克里曼丁橘，即與春香相比，愛媛28號與克里曼丁橘有更近的親緣關系。在剔除4個品種共有的相同InDel后，鑒定到607 376個InDel位點，共有657 414種變異方式。絕大多數（92.5%，561 914個）位點只有一種變異方式，其余41 112、4127、220和3個位點則存在2、3、4、5種變異。19.6%（119 007個）的InDel位點位于基因內，80.4%（488 369個）的InDel位點位于基因間。前者有83 983個（70.6%）位于內含子，其余35 024個（29.4%，占總InDel位點的5.77%）與基因編碼相關，包括編碼區（1.64%，9986個）、剪切相關區（0.36%，2169個）、5'-UTR（1.49%，9021個）、3'-UTR（2.25%，13 640個）；后者有192 203和133 980個分別處于基因上游和下游5 kb以內（圖1-B）。變異長度為1或2的InDel最為豐富，而大片段的InDel較少（圖1-C），其中有2.1%～2.3%（5312～6402個）的InDel片段大于30 bp或小于-30 bp。這些大片段的InDel有潛力適用于瓊脂糖凝膠電泳檢測的分子標記的開發。位于非編碼區以及變異長度短的InDel數量比例低，反映這些InDel對基因功能的影響較小，承受較小的選擇壓力。

2.2 適用于瓊脂糖凝膠電泳檢測的InDel分子標記的開發

根據上述大于30 bp或小于-30 bp的InDel位點的旁鄰序列，筆者共設計60對InDel引物，分散在基因組的9個片段框架（scaffold）中，其中有48對引物可對這10個橘柚品種和愛媛28號的基因組擴增出97條清晰條帶。其中多數標記只產生兩條帶，說明只有一種變異方式，其條帶位置與通過重測序數據和引物位置計算的理論值一致；而I9_459在明尼奧拉和清峰[清見（Kiyomi）橘橙×明尼奧拉]中出現了第3條帶，說明很可能產生除理論值之外的第2種InDel變異方式。圖2展示了I3_744、I7_170、I8_516、I8_533、I9_669和I9_459的PCR擴增電泳圖譜，擴增條帶清晰可見，多態性明顯。圖3概括了由所有48個標記所產生的基因型，能有效地對這10個橘柚品種以及愛媛28號進行區分和鑒定。其中奧蘭多和明尼奧拉最為接近，在12個位點上有15條帶的差異；陽光1號和陽光2號差別最大，在42個位點上有47條帶的差異。奧蘭多和明尼奧拉皆為鄧肯葡萄柚和丹西紅橘的雜種姐妹系，遺傳關系近，基因型較為接近。雖然陽光1號和陽光2號也是姐妹系，但是筆者對InDel位點的選擇并非完全隨機，偏向選擇在陽光1號、陽光2號、愛媛28號和春香相互之間具有差異的位點，因而差異較大的基因型并不能反映陽光1號和陽光2號之間真實的遺傳距離。

2.3 對48個InDel標記在51份種質資源中的遺傳多樣性分析

鑒于這些InDel標記可有效地對上述10個橘柚品種和愛媛28號進行基因分型和區分鑒定的事實，筆者將研究范圍擴大到51份種質資源。InDel標記在這51份種質資源中遺傳多樣性分析結果可參見表2。其PIC介于0.055（I1_639、I1_767和I7_449）和0.450（I8_516）之間，平均0.281；MAF介于0.510（I6_401）和0.971（I1_639）之間，平均0.739；Ho介于0.039（I1_184、I5_445、I6_502和I6_681）和0.647（I1_846）之間，平均0.306；He介于0.059（I1_767、I1_639和I7_449）和0.546 （I8_516）之間，平均0.350。一些標記（例如I3_744、I7_170、I8_516、I8_533和I9_669）具有較高的He/PIC和低MAF，表明他們在群體中有較高的遺傳多樣性，對柑橘作物的遺傳多樣性分析較為重要。

此外，基于這些InDel標記的基因分型，筆者進一步用PCoA分析這51份種質資源的遺傳距離。PCoA第一坐標和第二坐標可分別解釋18.29%和15.72%的總變異。在PCoA二維散點圖中（圖4），相同類型的柑橘聚集在一起，其中5個甜橙品種或3個枳品種只呈現出單點，說明這些甜橙或枳品種的基因型完全一致，不同類型的柑橘則距離較遠。兩種柚類（強得勒和琯溪蜜柚）第一坐標方向遠離其他柑橘，說明他們有較少的來自其他柑橘類型的基因滲入。枸櫞、枳、金柑、檸檬分布于散點圖的偏右下側。金柑（四季橘和寧波羅浮）相距較遠，這是因為四季橘是有寬皮柑橘血統的金柑。相比于寧波羅浮，四季橘在散點圖中更靠近橘類。橘類總體位于左下側，但分布較為離散，這是由于一些橘類滲入其他類型柑橘的血統，例如伊予柑（酸橙×丹西紅橘[4]）、中柑所5號（愛媛28號×砂糖橘）、清見（溫州蜜柑×甜橙[4]），導致在第二坐標方向上與橘柚和甜橙類靠近。橘柚主要分布于散點圖的左側中上部，在第一坐標方向上與橘類一致，第二坐標方向上則與柚和葡萄柚接近。總體上，基于這48個InDel標記的PCoA清楚地展示了這51份種質資源的遺傳距離，他們在二維散點圖的分布結果與已知的柑橘類型劃分總體一致。

3 討 論

橘柚風味獨特，日益受到消費者歡迎，已經得到柑橘育種工作者的重視。準確的品種鑒定不僅是新品種保護的前提，也有利于苗木真實性鑒別。基于形態特征的DUS[特異性（distinctness）、一致性（uniformity）、穩定性（stability）]測試仍然是新品種鑒定的公認方法[39]，但在果樹作物中存在周期長、近似品種難篩選的挑戰。分子標記技術能準確確定品種的遺傳特征，是品種鑒定的重要手段[5-8]。InDel標記有密度大、多態性豐富、準確性高、變異穩定性高和檢測簡便等優點，已經在柑橘中有所發掘。現有的柑橘InDel標記主要應用于真正柑橘果樹組植物的整體系統發育和遺傳多樣性分析[25，31]，或僅針對柚類[34]、溫州蜜柑[32]和某些特定雜柑[33]的品種鑒定，很難直接應用于對橘柚品種的區別和鑒定。筆者通過對兩個新橘柚品種及其親本的全基因組重測序，針對性地發掘和篩選適合瓊脂糖電泳凝膠檢測的大片段InDel標記。基于這些InDel標記的基因型不僅能有效區分和鑒定橘柚，而且操作簡單，辨識度高，成本低。此外，如果將這些InDel標記聯合形態特征鑒定，不僅能提高鑒定的精確度，也可適用于其他柑橘的鑒定。筆者利用其中33個InDel標記，結合部分DUS測試，成功地把5個未知品種鑒定為無核金諾[40]。

早期的InDel挖掘來自于對部分基因的低通量測序，通過對45種真正柑橘組植物的27個基因的桑格測序，Garcia-Lor等[24]獲得了50個InDel標記。第二代測序技術的發展使得高密度、全基因組范圍的InDel發掘成為可能。植物基因組中的InDel含量豐富，僅次于SNP。筆者在4種柑橘基因組中共發掘到20萬～30萬的InDel位點，其總量與金蘭柚[33]、茶葉[41]和鷹嘴豆[42]相似，其密度為1.7～2.4個/kb，遠遠高于水稻的15.8～21.2個/Mb[43]和茶葉的84.5個/Mb[41]。InDel的產生頻率、測試品種與參考基因組品種的親緣關系、測序深度和數據過濾標準都直接影響所挖掘的InDel密度。本研究較大的InDel密度可能反映了這4種柑橘與參考物種克林曼丁橘有相對較遠的血緣關系。陽光1號和陽光2號的母本愛媛28號（天草×清見）具有葡萄柚和甜橙的血緣，而其父本春香為日向夏和夏蜜柑的雜種后代[4]，他們與克林曼丁橘都屬不同物種。

在主坐標分析中，不同類型的柑橘總體分布于不同區間。然而，他們的遺傳距離并不完全符合主流的柑橘分類觀點[1]，例如金柑和枳分別屬于金柑屬和枳屬，在主坐標分析中，兩者卻與柑橘屬的枸櫞靠近，但又與柑橘屬的柚類和葡萄柚相距較遠，即并未呈現出與其他柑橘異屬的特征。其主要原因可能有：（1）筆者選擇的InDel標記需要優先區別和鑒定陽光1號、陽光2號、春香和愛媛28號，具有偏向性；（2）考慮到真正柑橘果樹組植物復雜的遺傳背景（跨屬、多物種、存在種間和屬間雜種），48個InDel標記在數量上不足以分析精確的遺傳關系。在多種類型的柑橘基因組中隨機挖掘數量充足的大片段InDel標記將有助于更加精確地分析柑橘的分類和遺傳進化。

4 結 論

通過全基因組重測序數據，筆者發掘了48個適合普通瓊脂糖電泳檢測的InDel標記，能清晰地對10個橘柚品種進行基因分型，可準確快速區分和鑒定不同橘柚品種，且操作簡單，辨識度高，成本低。在51份種質資源中，一些高PIC和He、低MAF的InDel標記（例如I3_744、I7_170、I8_516、I8_533、I9-669）具有較豐富的遺傳多樣性。基于這48個InDel的基因分型，主坐標分析展示了不同柑橘品種的遺傳距離，其結果總體符合已知的不同類型的柑橘分類，但不足以分析其精確的遺傳關系。

致謝：感謝袁高鵬博士對本文的修改提出的寶貴意見。

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收稿日期：2024-01-16 接受日期：2024-04-26

基金項目：柑橘種質資源精準鑒定項目（19230691）；撫州市“揭榜掛帥”項目（XMBH00091）

作者簡介：余歆，副研究員，博士，主要從事柑橘種質資源研究。E-mail：xin@cric.cn

*通信作者Author for correspondence. E-mail：caoli@cric.cn