小果甜柿遺傳轉化體系建立及其抗凍性遺傳改良的初步研究

摘" " 要：【目的】建立小果甜柿（Diospyros kaki Thunb. ‘Xiaoguo Tianshi’）葉片再生和優(yōu)化其遺傳轉化體系，以期通過分子育種技術獲得抗凍性強的砧木新種質。【方法】以小果甜柿葉盤為外植體，首先通過不同生長素（IAA）質量濃度和細胞分裂素（ZT，TDZ）配比探討對其愈傷誘導和不定芽再生的影響；進而探討其葉片對不同抗生素質量濃度組合的敏感性；此外，利用根癌農桿菌介導的葉盤穩(wěn)定遺傳轉化體系，進一步探討超表達君遷子（D. lotus L.）抗寒基因DlCBF1對小果甜柿葉盤再生植株抗凍性的影響。【結果】葉圓片在MS（1/2N）+ ZT 2.0 mg·L-1+ TDZ 2.0 mg·L-1培養(yǎng)基中愈傷形成率最高（64.71%）；將愈傷組織接種到MS（1/2N）+ ZT 2.0 mg·L-1+ IAA 0.1mg·L-1生芽培養(yǎng)基中，不定芽再生率和不定芽數(shù)分別為31.11%和2.37個。頭孢霉素質量濃度為400 mg·L-1時可抑制農桿菌生長，且葉片愈傷形成率低（9.84%）；卡那霉素對葉片再生影響大，在質量濃度為20 mg·L-1時其愈傷誘導率為11.57%。小果甜柿葉片穩(wěn)定超表達君遷子DlCBF1基因，獲得再生植株73株，其中陽性植株5株，熒光定量結果分析，陽性植株#1和#47中DlCBF1基因表達量分別為野生型的13倍和11倍。經(jīng)過-4 ℃低溫處理8 h后，超表達株系與野生型株系相比，葉片受傷害程度更小，光合作用效率變化不明顯，電導率低，H2O2和O2-在組織中的積累少，陽性株系表現(xiàn)出比野生型株系更強的抗凍性。【結論】在優(yōu)化小果甜柿葉片外植體再生和穩(wěn)定遺傳轉化體系的基礎上，通過在小果甜柿葉片中超表達君遷子DlCBF1基因，獲得6.85%轉基因陽性再生植株，穩(wěn)定超表達DlCBF1基因可顯著增強小果甜柿再生植株的抗凍性。研究結果為培育抗凍性強的柿砧木新種質提供了科學依據(jù)。

關鍵詞：小果甜柿；穩(wěn)定遺傳轉化；CBF；抗凍性

中圖分類號：S665.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）08-1678-10

Establishment of genetic transformation system and genetic improvement of frost resistance of Xiaoguo Tianshi persimmon

QIU Meiyi， CHEN Wenxing， XU Liqing， GUO Dayong， ZHANG Qinglin*， LUO Zhengrong*

（National Key Laboratory for Germplasm Innovation amp; Utilization of Horticultural Crops， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： 【Objective】 Persimmon （Diospyros kaki Thunb.） is generally propagated by grafting. The sweet persimmon Fuyu is known for its excellent fruit quality. However， when grafted on the common rootstock Diospyros lotus L.， it has shown low survival rate， slow growth or incompatibility in later stage. This is particularly evident in traditional producing areas in China where D. lotus is commonly used as rootstock， so that Fuyu could not be produced on a large scale in our country. Xiaoguo Tianshi persimmon （D. kaki Thunb.） was collected from Dabie Mountain area of Hubei province. Through field observations， in vitro stem segment wedge grafting and callus tissue approach grafting experiments， it has been found that Xiaoguo Tianshi persimmon and Fuyu persimmon varieties presented graft affinity. Following its widespread planting and popularity throughout China， it is noted that the Xiaoguo Tianshi persimmon has showed inadequate resistance to frost， which results in a greater mortality rate when exposed to unfavorable weather circumstances. Compared to molecular breeding， traditional cross breeding is time-consuming. Introducing resistance traits via transgenic methods could enhance the frost resistance of Xiaoguo Tianshi persimmon. To date， a leaf regeneration system and a reliable stable genetic transformation system of Xiaoguo Tianshi persimmon have not been reported. This study aims to establish a reliable leaf regeneration system for Xiaoguo Tianshi persimmon and optimize its stable genetic transformation system， thereby facilitating genetic improvement of frost-resistant rootstock germplasm through molecular breeding technology. 【Methods】 Utilizing leaf discs from Xiaoguo Tianshi persimmon as explants， our initial investigations focused on the influence of varying concentrations of indoleacetic acid （IAA） and cytokinins [zeatin （ZT） or thidiazuron （TDZ）] on the induction of callus formation and the regeneration of adventitious buds. Subsequently， the sensitivity of Xiaoguo Tianshi persimmon leaf discs to various antibiotic concentration combinations was assessed. Moreover， by leveraging an Agrobacterium tumefaciens-mediated stable genetic transformation system facilitated through the aforementioned explants， we further examined the impact of overexpressing the cold resistance gene DlCBF1 from D. lotus on the frost resistance of regenerated plants derived from Xiaoguo Tianshi persimmon leaf discs. 【Results】 The highest callus formation rate （64.71%） in Xiaoguo Tianshi persimmon was achieved when leaf explants were cultured on the Murashige and Skoog medium containing half of the normal nitrogen concentration （1/2N） supplemented with 2.0 mg·L-1 zeatin （ZT） and 2.0 mg·L-1 thidiazuron （TDZ）. When these callus tissues were transferred to a germination medium of MS （1/2N） + ZT 2.0 mg·L-1 + IAA 0.1 mg·L-1， the rate of adventitious bud regeneration and the average number of buds generated were 31.11% and 2.37， respectively. During the optimization of stable genetic transformation conditions for Xiaoguo Tianshi persimmon， it was found that a concentration of 400 mg·L-1 cefotaxime could inhibit the growth of Agrobacterium tumefaciens， meanwhile this led to a low rate of callus induction （9.84%）. Kanamycin significantly affected the regeneration of Xiaoguo Tianshi persimmon leaf explants， with a concentration of 20 mg·L-1 reducing the induction rate of callus formation to just 11.57%. Concentration of 10 mg·L-1 kanamycin was found to be optimal for the stable genetic transformation of Xiaoguo Tianshi persimmon leaf explants， resulting in a callus induction rate of 62.28%. Following stable genetic transformation of Xiaoguo Tianshi persimmon to overexpress the DlCBF1 gene cloned from D. lotus， a total of 73 regenerated plants were obtained. DNA-PCR identification revealed 5 positive transgenic plants. Quantitative fluorescence PCR analysis showed that the expression levels of the DlCBF1 gene in transgenic plants #1 and #47 were higher， being 13 and 11 times than those of the wild-type plants， respectively. In frost resistance determination experiment， after treatment at -4 °C for 8 hours， the transgenic lines showed significantly weak damage compared to wild-type plants， which exhibited browned leaves and signs of dehydration. Weak chlorophyll fluorescence signal was observed in wild-type plants， thus indicating reduced photosynthetic efficiency in wild plants after low temperature treatment. After cold treatment， electrical conductivity increased in wild-type plants， implying that the leaf tissue membrane had been damaged. Staining with DAB and NBT after cold treatment showed that wild-type plants accumulated more H2O2 and O2- in their leaf tissues than transgenic lines. These results exhibited that， in comparison to plants of the wild type， cold tolerance was enhanced in the transgenic lines. 【Conclusion】 This study， building upon the optimization of a leaf explant regeneration and stable genetic transformation system for Xiaoguo Tianshi persimmon， has successfully achieved stable overexpression of D. lotus cold resistance gene DlCBF1 within leaf tissue of Xiaoguo Tianshi persimmon. There was 6.85% transgenic positive Xiaoguo Tianshi persimmon. Further experimental results had convincingly demonstrated that overexpression of the DlCBF1 gene significantly enhances the frost resistance of the regenerated Xiaoguo Tianshi persimmon plants. These findings provide a scientific basis for genetic improvement of novel persimmon rootstock germplasm with enhanced cold resistance.

Key words： Xiaoguo Tianshi; Stable genetic transformation; CBF; Frost resistance

柿（Diospyros kaki Thunb.）一般通過嫁接繁殖[1]。但果實品質優(yōu)良的富有系甜柿，如太秋、早秋等與中國傳統(tǒng)產區(qū)的常用砧木君遷子（D. lotus L.）嫁接后表現(xiàn)早期成活率低、生長慢或后期不親和的問題，導致該類品種未能在中國規(guī)模生產[2-4]。胡夢玨等[5]通過田間觀察、離體莖段劈接和愈傷組織的靠接試驗，發(fā)現(xiàn)小果甜柿（D. kaki Thunb. ‘Xiaoguo Tianshi’）與富有系品種嫁接親和，可望作為優(yōu)質甜柿的廣親和砧木。目前已經(jīng)開始在中國柿的主產區(qū)逐步推廣，但小果甜柿在北方產區(qū)表現(xiàn)出抗凍力較差[6]，亟待進行抗凍性遺傳改良。

1997年，Tao等[7]將蘇云金芽孢桿菌的cryIA（c）基因導入日本甜柿，獲得抗蟲的再生植株。2001年，Gao等[8]將蘋果的S6PDH基因超表達到次郎柿中，發(fā)現(xiàn)超表達株系的抗鹽性顯著增強。因此，利用穩(wěn)定遺傳轉化進行抗性分子育種可望縮短育種年限和提高育種效率。穩(wěn)定遺傳轉化的前提是建立外植體的再生體系，Tao等[9]以柿葉片誘導愈傷組織和不定芽。此后還陸續(xù)有君遷子（D. lotus L.）、油柿（D. oleifera Cheng）、磨盤柿（D. kaki Thunb.）等再生體系和穩(wěn)定遺傳轉化體系的報道[10-14]。

君遷子原產于中國黃河流域，在中國各地廣泛分布，對冬季低溫脅迫抵抗能力強，是栽培柿的重要砧木[2]。研究君遷子的抗寒機制對提高柿屬植物的抗寒性具有重要的意義。CBF（CRT/DRE-binding factor）是低溫響應途徑中重要的轉錄因子，CBF依賴的低溫信號通路在過去20 a（年）得到廣泛研究，在各物種中具有很高的同源性[15]。目前，CBF同源基因在許多物種中都進行了克隆，包括蘋果、大豆、水稻、番茄、小麥、大麥和玉米等，研究表明它們對植物低溫響應都具有重要功能[16-19]。小果甜柿再生體系和穩(wěn)定轉化體系技術尚未成熟，因此建立其葉片再生和穩(wěn)定遺傳轉化體系，并將君遷子抗寒基因DlCBF1在小果甜柿再生植株中超表達，可為培育與主栽品種嫁接親和性良好和環(huán)境適用性強的甜柿砧木新種質提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料、菌株和載體

以繼代培養(yǎng)2 a的小果甜柿無菌試管苗和君遷子實生苗為試驗材料；菌株為大腸桿菌菌株DH5α和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101；雙元表達載體pBI-121GN2。上述試材均由華中農業(yè)大學果蔬園藝作物種質創(chuàng)新與利用全國重點實驗室提供。

1.2 愈傷組織與不定芽誘導

取繼代苗齡30 d的組培苗，切下頂端分生組織前4～5枚葉片，保留葉脈，將其切為5 mm×5 mm大小葉盤，葉面朝上接種在愈傷培養(yǎng)基中，以MS（1/2N）為基礎培養(yǎng)基，含不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑ZT（1.0、2.0、4.0 mg·L-1）和TDZ（0.5、1.0、2.0 mg·L-1），分析不同質量濃度的ZT與TDZ組合對葉片愈傷組織誘導的影響。

將生長狀態(tài)基本一致的愈傷組織接種在不定芽誘導培養(yǎng)基中，以MS（1/2N）為基礎培養(yǎng)基，含不同質量濃度的植物生長調節(jié)劑ZT（1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1）和IAA（0.1 mg·L-1），分析不同質量濃度的ZT與IAA組合對不定芽誘導的影響。

所有培養(yǎng)基均含有PVP（0.6 g·L-1）、蔗糖（30.0 g·L-1）和瓊脂（6.5 g·L-1），每個處理接種20～35個外植體，每個試驗3次重復。葉片誘導愈傷組織暗培養(yǎng)20 d后，培養(yǎng)條件更換為光照時間12 h·d-1，其他培養(yǎng)條件為相對濕度70%、培養(yǎng)條件為（25±2） ℃，每20 d更換1次培養(yǎng)基，45 d后分別統(tǒng)計愈傷組織形成率、不定芽再生率和葉片平均不定芽數(shù)。

葉片存活率/%=存活葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100；愈傷形成率/%=形成愈傷葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100；不定芽再生率/%=不定芽再生葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100；葉片平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/再生葉片數(shù)；污染率/%=污染外植體個數(shù)/接種外植體個數(shù)×100。

1.3 穩(wěn)定遺傳轉化條件優(yōu)化

將用農桿菌侵染后的葉盤共培養(yǎng)后接種到含有不同質量濃度頭孢霉素（cefotaxime，Cef）的愈傷誘導培養(yǎng)基中，質量濃度分別為0、100、200、400、600 mg·L-1，45 d后觀察農桿菌生長情況并計算農桿菌生長率，試驗不同頭孢霉素質量濃度對農桿菌抑制效果。

將葉盤直接接種到含有不同質量濃度抗生素的愈傷誘導培養(yǎng)基中，頭孢霉素質量濃度分別為0、100、200、400、600 mg·L-1，卡那霉素（kanamycin，Kan）質量濃度分別為0、5、10、20、40 mg·L-1，每個處理接種40～60個外植體，每個試驗3次重復。每20 d更換1次培養(yǎng)基，葉盤接種45 d后統(tǒng)計葉片存活率、愈傷形成率。愈傷誘導培養(yǎng)基為MS（1/2N）含有ZT（2.0 mg·L-1）、TDZ（2.0 mg·L-1）、PVP（0.6 g·L-1）、蔗糖（30 g·L-1）和瓊脂（6.5 g·L-1）。

1.4 君遷子DlCBF1基因克隆和超表達載體構建

RNA提取方法參考Hipure HP Plant RNA Mini Kit試劑盒（Magen公司）說明，采集君遷子實生苗葉片提取RNA，參考PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司）反轉錄試劑盒進行cDNA反轉錄。利用Primer Premier 5.0軟件設計DlCBF1基因特異引物。由上海生工生物技術有限公司合成，濃度5 pmol·μL-1。

以君遷子基因組數(shù)據(jù)庫（http：//persimmon.kazusa.or.jp/blast.html）中Dio0206440.1（對應擬南芥AtCBF1基因同源基因）的序列為模板設計CDS克隆引物，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase高保真酶（TaKaRa，日本）進行擴增，以DlCBF1-F（5'-ATGGATGTGTCCTCTCACTTTTCCG-3'）和DlCBF1-R（5'-CTACATTGAGAAACTCCACAGTGGGA-3'）為引物，PCR擴增程序：預變性95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)，延伸72 ℃ 5 min，進行PCR擴增，克隆君遷子DlCBF1基因。以克隆獲得的君遷子DlCBF1基因為模板，以DlCBF1-XbaⅠ-F（5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGATGTGTCCTCTCACTT-3'）和DlCBF1-SmaⅠ-R（5'-CATAGGGACTGACCACCCGGGCATTGAGAAA-CTCCACAGTG-3'）為引物，PCR擴增程序：預變性95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)，延伸72 ℃ 5 min，進行PCR擴增，回收目的片段，連接至XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切后的pBI121GN2植物表達載體，獲得35S：： DlCBF1超表達載體。采用凍融法將pBI121GN2-DlCBF1載體導入根癌農桿菌菌株GV3101中。

1.5 DlCBF1遺傳轉化及轉基因陽性植株鑒定

小果甜柿葉片侵染流程參照前期報道[12]并對浸染液濃度、共培養(yǎng)時間等稍作修改。取繼代苗齡30 d的組培苗切下頂端分生組織前4～5枚葉片，去除葉邊緣，保留葉脈，在無菌的條件下，將其切為5 mm×5 mm的葉盤，葉背朝下接種于預培養(yǎng)培養(yǎng)基[（1/2N）MS+ZT 1.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1]中，黑暗預培養(yǎng)3 d。將根癌農桿菌菌液OD600值調至0.75，配置好的懸浮液于黑暗條件下靜置1 h后侵染預培養(yǎng)3 d后的葉片，侵染15 min，用無菌吸水紙吸干葉片上的菌液，葉背朝下置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基[（1/2N）MS+ZT 1.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+AS 20 mg·L-1]上暗培養(yǎng)3 d，將葉片用頭孢霉素水（400 mg·L-1）清洗3次，并用無菌水清洗3次，將葉片取出后置于無菌吸水紙中吸干葉片表面的水分，葉背朝下置于篩選愈傷誘導培養(yǎng)基[（1/2N）MS+ZT 2.0 mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1+Kan 10 mg·L-1+Cef 400 mg·L-1]中，25 ℃黑暗培養(yǎng)30 d，愈傷繼代于篩選不定芽再生培養(yǎng)基[（1/2N）MS+ZT 2.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+Kan 10 mg·L-1+Cef 400 mg·L-1]中，25 ℃光照培養(yǎng)20～30 d誘導不定芽再生，待抗性再生芽長到1 cm時，將再生芽切下，轉移到[DKW+ZT 1.0 mg·L-1+IAA 0.01 mg·L-1+ Cef 400 mg·L-1]的抗性繼代培養(yǎng)基上，經(jīng)PCR陽性鑒定后篩選陽性植株，以小果甜柿葉片DNA為模板，以35S-F（5'-GACGCACAATCCCACTATCC-3'）和DlCBF1-SmaⅠ-R為引物進行PCR分析，陽性植株擴繁保存用于下一步研究。陽性植株再生芽長至1.5 cm后，先在含1/2MS+NAA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.2 mg·L-1的生根培養(yǎng)基中25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d，之后轉入不含任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中25 ℃光照培養(yǎng)，30 d后可再生出不定根。

1.6 基因相對表達量

切取小果甜柿陽性苗葉片，提取其RNA后反轉錄，以其cDNA為模板，利用qRT-PCR檢測DlCBF1基因在轉錄水平上的表達，此操作在QuantStudio? 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）上完成，參考TB Green? Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa，日本）說明書，以QDlCBF1-F（5'-AGAAGTTCAGGGAGACGCGG-3'）和QDlCBF1-R（5'-TGCCCAGCCATATCCTCGAC-3'）為引物，PCR反應程序：95 ℃ 5 min；45個循環(huán)包括95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s。每個樣品3次重復，DkActin用作內參基因[20]。

1.7 低溫脅迫下表型觀察及理化指標的測定

將生長一致的小果甜柿DlCBF1超表達株系和野生型（WT）株系于低溫培養(yǎng)箱（HP400G-E型，瑞華公司，中國）中進行低溫處理，-4 ℃處理8 h后觀察其表型并拍照。使用葉綠素熒光成像系統(tǒng)（IMAGING-PAM）觀察整個植株的光合活性，根據(jù)其葉綠素成像來反映其生理狀態(tài)的異質性，利用Imaging WinGegE軟件（Walz，德國）進行Fv/Fm值的計算。使用DSS-307型電導率儀（SPSIC，中國）測量生物電導率；采集-4 ℃處理的小果甜柿葉片，采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法分析H2O2的含量，采用氯化硝基四氮唑藍（NTB）染色法分析O2-的含量，丙二醛（MDA）含量測定步驟具體參照南京建成試劑盒（A003-1）說明書。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有檢測3次重復。采用SPSS 18.0（SPSS，Chicago，USA）軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 小果甜柿葉片愈傷和不定芽的誘導

在葉片培養(yǎng)過程中，隨著接種時間增加，葉片面積逐漸長大，葉邊緣向中心卷曲，葉脈周圍長出致密黑色愈傷組織且體積迅速增大；接種8周左右，愈傷組織上出現(xiàn)芽點，芽點逐漸變綠伸長，待其長到2 cm時可切下不定芽進行繼代培養(yǎng)。

2.2 不同激素組合對小果甜柿葉片愈傷組織誘導的影響

由表1可知，最適合小果甜柿葉片愈傷誘導的激素組合為ZT 2.0 mg·L-1+ TDZ 2.0 mg·L-1，愈傷組織形成率達64.71%；其次為ZT 1.0 mg·L-1+ TDZ 0.5 mg·L-1，愈傷組織形成率達62.71%。當ZT質量濃度過高時，會抑制葉片愈傷組織形成。當TDZ質量濃度一定時，愈傷組織形成率會隨著ZT質量濃度增加先升高后降低。不同激素組合，愈傷生長狀態(tài)也不同，組合1、7、8的葉片大且綠，與培養(yǎng)基接觸生長的愈傷組織為黑色，與空氣接觸的為淺褐色，其余組合的葉片為淺綠色，愈傷組織小且不成形。

2.3 不同激素組合對小果甜柿不定芽再生的影響

由表2可知，最適合小果甜柿不定芽誘導的激素組合為ZT 2.0 mg·L-1+ IAA 0.1 mg·L-1，不定芽再生率和葉片平均不定芽數(shù)分別達到31.11%和2.37個。當IAA質量濃度一定時，不定芽再生率和平均不定芽再生數(shù)會隨著ZT質量濃度的增加而先升高后下降。ZT質量濃度太高會抑制不定芽再生且不定芽長勢差，ZT質量濃度為4.0 mg·L-1時，不定芽再生率僅為5.00%。在不定芽誘導過程中，葉片的酚類分泌物的釋放會抑制不定芽再生，需20 d更換一次培養(yǎng)基。

2.4 不同質量濃度的頭孢霉素對農桿菌的抑菌效果

為了確定能抑制農桿菌生長的最佳頭孢霉素質量濃度，試驗對比了不同質量濃度的頭孢霉素對農桿菌生長的抑制效果，200 mg·L-1及以下質量濃度的頭孢霉素均無法抑制農桿菌生長，農桿菌污染率為50%以上；頭孢霉素質量濃度400 mg·L-1和600 mg·L-1時，農桿菌污染率分別為23.74%和5.00%（圖1）。因此，400 mg·L-1及以上質量濃度的頭孢霉素可以抑制農桿菌污染，頭孢霉素質量濃度越高，抑制農桿菌污染效果越好。

2.5 不同質量濃度的頭孢霉素對小果甜柿葉片再生的影響

為確定適合小果甜柿遺傳轉化的頭孢霉素質量濃度，將葉盤接種到含有不同質量濃度頭孢霉素的再生培養(yǎng)基中。由表3可見，隨著頭孢霉素質量濃度的增加，葉片的存活率逐步降低，葉片黃化且不分化（圖2），愈傷組織形成率也隨之降低，當頭孢霉素質量濃度為400 mg·L-1時，愈傷組織形成率極低，為9.84%。因此結合頭孢霉素對農桿菌的抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，400 mg·L-1以下、200 mg·L-1以上質量濃度的頭孢霉素適合葉片穩(wěn)定遺傳轉化。

2.6 不同質量濃度的卡那霉素對小果甜柿葉片再生的影響

卡那霉素能夠顯著抑制葉片生長，為確定適合小果甜柿遺傳轉化的卡那霉素質量濃度，將葉盤直接接種到含有不同質量濃度卡那霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基中。由表4可知，隨著卡那霉素質量濃度的增加，葉片存活率顯著降低，葉片黃化并逐漸褐化死亡（圖3）。當卡那霉素質量濃度為20 mg·L-1時，葉片存活率為82.64%，愈傷組織形成率顯著降低，僅為11.57%。卡那霉素質量濃度為10 mg·L-1最適宜葉片遺傳轉化篩選，其愈傷組織誘導率為62.28%，且能在一定條件下抑制非陽性愈傷組織生長。

2.7 小果甜柿遺傳轉化DlCBF1及陽性鑒定

對小果甜柿進行超表達DlCBF1基因穩(wěn)定遺傳轉化（圖4），獲得再生植株73株，陽性植株5株（#1、#2、#3、#47和#49），經(jīng)過提取其葉片DNA，進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)陽性率為6.85%（圖5）；并且根據(jù)熒光定量結果分析，陽性植株#1和#47中DlCBF1基因表達量高，分別為WT的13倍和11倍（圖6）。

2.8 超表達DlCBF1增強小果甜柿再生植株抗凍性

將野生型株系（WT）和DlCBF1轉基因小果甜柿株系（#1、#3和#47）進行抗凍性分析，經(jīng)過低溫處理（-4 ℃，8 h）后，發(fā)現(xiàn)WT植株葉片變褐，出現(xiàn)失水萎蔫情況，超表達株系相較于WT株系受傷害程度小（圖7-A）。低溫處理后，WT株系葉綠素熒光信號微弱，超表達株系葉片有較強藍色熒光信號（圖7-B），與最大光合效率Fv/Fm值變化一致（圖7-E）。同時，采用DAB和NBT染色法對低溫處理后的小果甜柿植株葉片進行染色，兩者分別代表H2O2和O2-在組織中的積累，結果表明超表達DlCBF1株系相較于WT株系染色范圍少且染色程度淺（圖7-C）。相對電導率和MDA含量測定顯示，與WT株系相比，低溫處理后，超表達植株相對電導率和MDA含量較低（圖7-D、F）。以上結果表明，超表達DlCBF1基因能提高小果甜柿再生植株抗凍性。

3 討 論

柿屬植物不同基因型的再生條件差異大，君遷子（D. lotus L.）愈傷組織誘導率可達100%，平均不定芽數(shù)為4.26個[11]；油柿（D. oleifera Cheng）愈傷組織誘導率也可達88.90%，不定芽誘導率為（64.33±7.02）%，平均不定芽數(shù)為3.7個[10]；磨盤柿（D. kaki Thunb.）愈傷組織誘導率100%，不定芽誘導率達36.9%[14]。可見柿不同基因型愈傷組織和不定芽誘導能力不同。目前還沒有對小果甜柿（D. kaki Thunb.）葉片再生體系的研究，筆者在本研究中成功建立小果甜柿葉片再生體系和優(yōu)化根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系，為小果甜柿的進一步穩(wěn)定遺傳轉化和抗性分子育種奠定基礎。根據(jù)前人研究，可將根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌接種在柿外植體上以誘導植株再生。Tao等[21]研究發(fā)現(xiàn)以日本甜柿（D. kaki Thunb.）富有、次郎和西村為材料，發(fā)根農桿菌均能誘導愈傷形成。Tao等[22]發(fā)現(xiàn)也可利用根癌農桿菌對柿進行遺傳轉化，不同菌株如A281、C58和K12，接種后均能誘導出愈傷組織。

前人還對柿（D. kaki Thunb.）進行穩(wěn)定遺傳轉化條件的優(yōu)化，如不同部位、培養(yǎng)基類型、激素組合、預培養(yǎng)時間、暗培養(yǎng)時間、侵染時間和根癌農桿菌菌液OD600值[10-11，14]。以君遷子葉片為外植體，優(yōu)化不同遺傳轉化條件，發(fā)現(xiàn)預培養(yǎng)4 d，OD600為0.5，侵染10 min，君遷子葉片的遺傳轉化效率最高，達14.27%[11]；以恭城水柿葉片為外植體，通過對不同基本培養(yǎng)基和激素組合的優(yōu)化，建立了高效的轉化體系和離體再生體系，再生苗陽性率達17.9%[12]；以油柿的下胚軸和胚根為試材，確定愈傷組織的最佳誘導培養(yǎng)基和愈傷組織誘導不定芽的最適培養(yǎng)基，分別為1/2MS + 2.0 mg·L-1 TDZ + 1.5 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA和1/2MS + 2.0 mg·L-1 TDZ + 1.0 mg·L-1 2iP + 0.5 mg·L-1 NAA[10]。柿屬植物穩(wěn)定遺傳轉化體系正在逐步完善，不同品種和不同外植體部位誘導條件差異大。筆者在本研究中以小果甜柿葉片為外植體，研究不同激素配比對其愈傷誘導和叢生芽再生的影響，優(yōu)化了葉片再生體系；愈傷組織形成率達64.71%，不定芽再生率和不定芽數(shù)分別為31.11%和2.37個。再通過根癌農桿菌介導法進行穩(wěn)定遺傳轉化，200～400 mg·L-1的頭孢霉素和10 mg·L-1的卡那霉素適合小果甜柿葉片遺傳轉化；與其他柿穩(wěn)定遺傳轉化體系相比，本研究中使用更低的卡那霉素質量濃度（10 mg·L-1），但篩選陽性愈傷組織和陽性不定芽的效率較低，再生的不定芽極大可能為陰性。因小果甜柿穩(wěn)定遺傳轉化體系尚未得到完全優(yōu)化，可以通過根癌農桿菌介導法，研究適合其穩(wěn)定遺傳轉化的根癌農桿菌菌液質量濃度、侵染時間、預培養(yǎng)時間、暗培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮質量濃度等條件。

相較于傳統(tǒng)育種手段，通過轉基因手段，可明顯提高育種效率。因此，在特定潛在有益的基因已經(jīng)被鑒定的情況下，穩(wěn)定遺傳轉化技術為育種提供了最佳的替代方案。Tao等[23]和Tamura等[24]利用根癌農桿菌EHA101將編碼梨果實多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因轉化到日本甜柿次郎，轉化植株抗真菌能力顯著提高。將抗性基因轉化到柿植株的方法有效可行，小果甜柿抗寒性較弱，將君遷子抗性基因DlCBF1轉入小果甜柿中，有望提高其抗凍性并獲得抗凍能力強的廣親和砧木新種質。

4 結 論

培養(yǎng)基MS（1/2N）+ ZT（2.0 mg·L-1）+ TDZ（2.0 mg·L-1）和MS（1/2N）+ZT（2.0 mg·L-1）+IAA（0.1 mg·L-1）的二次誘導體系適宜小果甜柿葉片外植體再生；頭孢霉素質量濃度200 mg·L-1＜Cef＜400 mg·L-1和卡那霉素質量濃度10 mg·L-1適宜其葉片穩(wěn)定遺傳轉化篩選。在小果甜柿中超表達君遷子抗寒基因DlCBF1，可增強其對低溫脅迫的耐受性。研究結果可為柿抗性砧木新種質的創(chuàng)制提供科學依據(jù)。

參考文獻References：

[1] 羅正榮，蔡禮鴻，胡春根. 柿屬植物種質資源及其利用研究現(xiàn)狀[J]. 華中農業(yè)大學學報，1996，15（4）：381-388.

LUO Zhengrong，CAI Lihong，HU Chungen. Research development of germplasm resources of Diospyros and their utilization[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，1996，15（4）：381-388.

[2] 龔榜初，王勁風. 柿不同砧木生物學特性的研究[J]. 經(jīng)濟林研究，1997，15（1）：9-13.

GONG Bangchu，WANG Jinfeng. Biological characteristics of several persimmon rootstocks[J]. Economic Forest Researches，1997，15（1）：9-13.

[3] 王仁梓，楊勇. 甜柿推廣中的若干問題[J]. 果樹科學，1991，8（3）：187-190.

WANG Renzi，YANG Yong. Some issues in the popularization of sweet persimmon[J]. Journal of Fruit Science，1991，8（3）：187-190.

[4] 王元裕，李伯均，周碧英，柳國華，鄭顯明. 甜柿砧穗組合嫁接親和力研究[J]. 園藝學報，1996，23（2）：110-114.

WANG Yuanyu，LI Bojun，ZHOU Biying，LIU Guohua，ZHENG Xianming. The graft compatibility of different rootstock-scion combinations of sweet persimmons[J]. Acta Horticulturae Sinica，1996，23（2）：110-114.

[5] 胡夢玨，陳莉，劉一鳳，張青林，羅正榮. 小果甜柿和牛眼柿作為完全甜柿砧木的應用潛力研究[J]. 果樹學報，2017，34（1）：50-58.

HU Mengjue，CHEN Li，LIU Yifeng，ZHANG Qinglin，LUO Zhengrong. Potential of Xiaoguo Tianshi and Niuyanshi （Diospyros kaki Thunb.） as novel rootstocks for PCNA persimmon[J]. Journal of Fruit Science，2017，34（1）：50-58.

[6] 劉一鳳. 完全甜柿砧木小果甜柿繁殖技術研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2017.

LIU Yifeng. Establishment of propagation technology for PCNA rootstock Xiaoguo Tianshi[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University，2017.

[7] TAO R，DANDEKAR A M，URATSU S L，VAIL P V，TEBBETS J S. Engineering genetic resistance against insects in Japanese persimmon using the cryIA（c） gene of Bacillus thuringiensis[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，1997，122（6）：764-771.

[8] GAO M，TAO R，MIURA K，DANDEKAR A M，SUGIURA A. Transformation of Japanese persimmon （Diospyros kaki Thunb.） with apple cDNA encoding NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase[J]. Plant Science，2001，160（5）：837-845.

[9] TAO R，SUGIURA A. Adventitious bud formation from callus cultures of Japanese persimmon[J]. HortScience，1992，27（3）：259-261.

[10] MAI Y N，LIU Y，YUAN J Y，YE L S，ZHANG Y，DIAO S F，HAN W J，SUO Y J，LI H W，HU R Y，SUN P，LI Z，F(xiàn)U J M. Establishment of an efficient genetic transformation system：A case study of RNAi-induced silencing of the transcription factor MeGI in Diospyros oleifera Cheng seedlings[J]. Scientia Horticulturae，2023，308：111560.

[11] LI X H，JIANG Z Y，SHEN Y Y，LI F H，YU X Y，QU S C. In vitro regeneration and Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of D. lotus （Diospyros lotus L.）[J]. Scientia Horticulturae，2018，236：229-237.

[12] ZHANG M，YANG S C，CHEN W X，XU L Q，GUO D Y，LUO Z R，ZHANG Q L. An efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation system for persimmon （Diospyros kaki Thunb.）[J]. Horticulturae，2022，8（5）：422.

[13] 李晶，羅玉潔，張青林，羅正榮，劉繼紅. 君遷子休眠芽及葉片離體培養(yǎng)體系優(yōu)化及植株再生[J]. 華中農業(yè)大學學報，2016，35（4）：14-19.

LI Jing，LUO Yujie，ZHANG Qinglin，LUO Zhengrong，LIU Jihong. In vitro culture system optimization and regeneration of date plum （Diospyros lotus Linn.） dormant buds and leaves[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，2016，35（4）：14-19.

[14] 師校欣，杜國強，馬俊蓮，高儀，王蕾. 磨盤柿離體葉片愈傷組織發(fā)生及不定芽誘導[J]. 果樹學報，2004，21（4）：376-378.

SHI Xiaoxin，DU Guoqiang，MA Junlian，GAO Yi，WANG Lei. Callus formation and adventitious bud regeneration from leaves in vitro in persimmon （Diospyros kaki）[J]. Journal of Fruit Science，2004，21（4）：376-378.

[15] RITONGA F N，CHEN S. Physiological and molecular mechanism involved in cold stress tolerance in plants[J]. Plants，2020，9（5）：560.

[16] CANELLA D，GILMOUR S J，KUHN L A，THOMASHOW M F. DNA binding by the Arabidopsis CBF1 transcription factor requires the PKKP/RAGRxKFxETRHP signature sequence[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2010，1799（5/6）：454-462.

[17] CARVALLO M A，PINO M T，JEKNIC Z，ZOU C，DOHERTY C J，SHIU S H，CHEN T H H，THOMASHOW M F. A comparison of the low temperature transcriptomes and CBF regulons of three plant species that differ in freezing tolerance：Solanum commersonii，Solanum tuberosum，and Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（11）：3807-3819.

[18] HELLENS R P，ALLAN A C，F(xiàn)RIEL E N，BOLITHO K，GRAFTON K，TEMPLETON M D，KARUNAIRETNAM S，GLEAVE A P，LAING W A. Transient expression vectors for functional genomics，quantification of promoter activity and RNA silencing in plants[J]. Plant Methods，2005，1：13.

[19] HU Z，BAN Q Y，HAO J，ZHU X X，CHENG Y H，MAO J L，LIN M L，XIA E H，LI Y Y. Genome-wide characterization of the C-repeat binding factor （CBF） gene family involved in the response to abiotic stresses in tea plant （Camellia sinensis）[J]. Frontiers in Plant Science，2020，11：921.

[20] YANG X Y，WANG R，JING H H，CHEN Q Y，BAO X L，ZHAO J T，HU G B，LIU C M，F(xiàn)U J X. Three novel C-repeat binding factor genes of Dimocarpus longan regulate cold stress response in Arabidopsis[J]. Frontiers in Plant Science，2020，11：1026.

[21] TAO R，HANDA T，TAMURA M，SUGIURA A. Genetic transformation of Japanese persimmon （Diospyros kaki L.） by Agrobacterium rhizogenes wild type strain A4[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1994，63（2）：283-289.

[22] TAO R，URATSU S L，DANDEKAR A M. Relative virulence of Agrobacterium strains on persimmon （Diospyros kaki L.）[J]. Acta Horticulturae，1995，392：171-178.

[23] TAO R. Agrobacterium-mediated genetic transformation in Japanese persimmon[J]. Acta Horticulturae，2003，601：57-63.

[24] TAMURA M，GAO M，TAO R，LABAVITCH J M，DANDEKAR A M. Transformation of persimmon with a pear fruit polygalacturonase inhibiting protein （PGIP） gene[J]. Scientia Horticulturae，2004，103（1）：19-30.

收稿日期：2024-04-19 接受日期：2024-06-06

作者簡介：邱梅逸，女，在讀碩士研究生，研究方向為果樹生物技術與遺傳育種。Tel：027-87282677，E-mail：qiumeiyi@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：zhangqinglin@mail.hzau.edu.cn；E-mail：luozhr@mail.hzau.edu.cn