套袋對油桃果皮葉綠素降解及相關基因表達的影響

摘" " "要：【目的】葉綠素含量是影響果皮底色及果實外觀的關鍵因素，以兩個成熟期接近的桃品種為材料，初步探究了套袋對油桃果皮葉綠素降解規律及葉綠素降解相關基因表達的影響，以期為桃果實成熟期判定及底色差異確定依據。【方法】以中油18號和中油19號兩個油桃品種為研究對象，測量成熟前套袋與不套袋油桃果皮色差、葉綠素含量等指標，用熒光定量PCR檢測套袋對葉綠素降解相關基因的影響，通過分析葉綠素含量與相關基因表達的關系，確定套袋對油桃果皮葉綠素降解的影響。【結果】套袋處理增加了油桃果皮的亮度（L*值），提高了黃肉品種中油19號的果實b*值，套袋也使果皮葉綠素降解提前。熒光定量結果顯示，PpCLH1在套袋果實成熟前23 d和12 d的表達量均高于不套袋，PpPAO在中油19號果實成熟過程中表達量升高。PpSGR基因在中油18號和中油19號果實完全成熟時相較于不套袋材料顯著高表達，而經過套袋處理后在成熟前23 d會提前表達，且表達量顯著升高。【結論】套袋會導致果皮葉綠素降解基因PpCLH1、PpSGR提前高表達，葉綠素提前降解，說明PpCLH1、PpSGR是桃果實成熟前果皮葉綠素降解的關鍵基因，這對進一步解析桃果實發育過程中果皮葉綠素降解提供了一種新的思路，也為探索桃果實發育過程中葉綠素降解的分子機制提供參考。

關鍵詞：油桃；套袋；果皮；葉綠素降解；葉綠素降解基因

中圖分類號：S662.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）08-1513-11

Effect of fruit bagging on chlorophyll degradation and related gene expression in nectarine peel

LIU Xin1， ZHANG Xiaoyu1， MENG Junren1， LI Ang1， DUAN Wenyi1， 2， SUN Shihang1， 2， PAN Lei1， 2， ZENG Wenfang1， 2， WANG Zhiqiang1， 2， NIU Liang1， 2*

（1Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Peach amp; Grape Improvement Center， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang， 453004， Henan， China）

Abstract： 【Objective】 The peach （Prunus persica L.） is a stone fruit crop with high economic value， favored by consumers worldwide for its rich flavor and nutritional value， and is one of the main fruits consumed in many countries. Currently， fruit quality has become a key factor influencing consumers’ choice. Among fruit quality attributes， skin color is one of the most intuitive factors that consumers consider when selecting fruits. Chlorophyll content is a crucial factor affecting the base color of the fruit skin and the overall appearance of the fruit， as it is closely related to fruit ripening. However， there has been no report about the impact of bagging on the degradation of chlorophyll genes in peaches. In this study， two nectarine varieties with similar ripening periods were used as materials to preliminarily explore the effects of bagging on the degradation pattern of chlorophyll in nectarine skin and the expression of genes related to chlorophyll degradation， with the aim of providing a basis for determining the ripening period of nectarine fruits and the differences in base color. 【Methods】 Using two nectarine varieties Zhongyou No. 18 and Zhongyou No. 19 as subjects of the study， the color changes of fruit peels before ripening were quantified using a colorimeter， and the chlorophyll contents were measured using a UV spectrophotometer. There has been no report on the expression of chlorophyll degradation genes in bagged peach fruits to date. To fill this gap， the expression of genes related to chlorophyll degradation was detected using real-time quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR）， and the coding sequences （CDS） of the relevant genes were sourced from genomic databases. By establishing the correlation between chlorophyll degradation and gene expression through statistical analysis， the impact of bagging on the chlorophyll degradation in nectarine fruit skin was determined. 【Results】 The L* values （indicating the lightness or darkness of color） of the fruit skin for the bagged Zhongyou No. 18 and Zhongyou No. 19 nectarine varieties showed a significant increase compared to the control， which suggested that bagging could enhance the brightness of the fruit and improve its color. For both Zhongyou No. 18 and Zhongyou No. 19， the a* values （representing the red-green color axis） of the fruit skin rose rapidly from 44 to 12 days before full maturity （DBM）， with the bagged fruits exhibiting a more rapid increase in a* values than the control. Bagging accelerated the increase in a* values during this period， leading to lighter coloring and a cleaner base color of the fruit skin compared to the control. Bagging resulted in a decrease in the b* values （indicating the yellow-blue color axis） for white-fleshed peaches， whereas in yellow-fleshed peaches， bagging led to an increase in b* values. From 44 to 12 DBM， the chlorophyll content in bagged fruits significantly decreased compared to the control. Therefore， bagging treatment accelerated the degradation of chlorophyll in the fruit skin. After bagging， the chlorophyll content in the varieties reached the harvest level approximately one week earlier than the control. The fluorescence quantitative results indicated that the expression levels of PpCLH1 in bagged fruits at 23 and 12 DBM were higher than those in the control. The expression of PpPAO increased during the ripening process of Zhongyou No. 19 fruits. The PpSGR gene was significantly and more highly expressed in fully mature fruits of both Zhongyou No. 18 and Zhongyou No. 19 compared to the control， and its expression was advanced and markedly higher after bagging treatment at 23 DBM. 【Conclusion】 This study investigated the impact of bagging on the expression of chlorophyll degradation genes and analyzed its relationship with color difference and chlorophyll content. It was found that bagging led to the premature high expression of chlorophyll degradation genes PpCLH1， PpPAO and PpSGR， indicating that PpCLH1， PpPAO and PpSGR were key genes in the degradation of chlorophyll in the skin of nectarine fruits before ripening. This provides a new perspective for further elucidating the degradation of chlorophyll in the skin during the development of peach fruits and also offers a reference for exploring the molecular mechanisms of chlorophyll degradation during peach fruit development.

Key words： Nectarine; Bagging; Peel; Chlorophyll degradation; Chlorophyll degradation gene

桃（Prunus persica L.）是經濟價值較高的核果類果樹，由于其風味豐富，營養價值較高，而深受世界各國消費者的喜愛，是世界上許多國家的主要消費水果之一。桃起源于中國西部地區，栽培歷史可追溯到4000多年前[1]。但目前中國桃產業整體質量水平不高，與發達國家存在差距，正處于數量型向質量型轉變的關鍵時期[2]。目前果實品質已成為影響消費者選擇的關鍵因素[3]。果皮色澤是果實外觀品質的重要組成部分，也是消費者在選擇水果時最直觀的評價因素之一，包括兩個方面：果皮著色與果皮底色。有關果皮著色的研究很多，但關于果皮底色的研究則相對較少，其中葉綠素含量對果皮底色有重要影響。

近年來，關于植物中葉綠素主要降解途徑的研究結果已經被公認[4]。在葉綠素降解這一途徑中葉綠素b首先被還原生成7-羥甲基葉綠素a，該產物由NON-YELLOW COLORING1（NYC1）和NYC1-LIKE（NOL）編碼的葉綠素b還原酶催化。隨后，7-羥甲基葉綠素a被7-羥甲基葉綠素a還原酶（7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase，HCAR）還原為葉綠素a[5]。葉綠素a可以通過兩條不同的途徑轉化為脫鎂葉綠酸a（Pheophorbide a，pheide a）。（1）葉綠素a經葉綠素酶（Chlorophyllase，CLH）和脫鎂螯合酶（Mg-dechelatase，MDCase）催化生成脫鎂葉綠酸a[6]。（2）葉綠素a在脫鎂螯合酶和脫鎂葉綠素酶（Pheophytinase，PPH）作用下生成脫鎂葉綠酸a[7]。在這兩個途徑中，脫鎂葉綠酸a是共同的中間產物。在脫鎂葉綠酸a氧化酶（Pheophorbide a Oxygenase，PAO）和紅色葉綠素降解產物還原酶（Red Chlorophyll Catabolites Reductase，RCCR）的催化下降解[4]。PAO是代謝通路上控制葉綠素降解的重要基因，PAO催化的卟啉環氧化開環是葉綠素降解的關鍵步驟。因而葉綠素的這條降解途徑被稱為PAO降解途徑[8]。SGR（Stay-green）、SGRL基因的鑒定是近年來葉綠素降解調控研究中的一個里程碑[9]。SGR與SGRL基因與葉綠素的降解途徑相關，可以通過招募葉綠素降解基因形成復合體，結合到光系統Ⅱ上，形成SGR-CCE-LHC Ⅱ復合體，從而導致葉綠素降解[10]。

在春性品種小麥花后旗葉不斷衰老的過程中，TaCLH1的表達量下降、升高再下降[11]。PAO基因會隨著衰老表達上調；在西藍花采后衰老過程中BoPAO的表達上調[12]；在擬南芥衰老過程中AtPAO表達逐漸升高，并在自然衰老時達到最高峰[13]。在桃果實發育的前期果肉呈現明顯綠色時，PpSGR轉錄水平較低。隨著果實逐步成熟，果肉褪綠，表達量不斷升高[14]。

套袋是一項被廣泛認可的農業技術，通過人工方式干預果實的光照條件，以改善果實的外觀色澤。目前在全球范圍內被廣泛應用于果樹生產。研究顯示，套袋能夠提升果實表面的光潔度，從而改善果實的整體外觀品質[15]。套袋（遮光）通過改變果皮中葉綠素含量來影響果皮底色。在對番石榴、荔枝、獼猴桃的研究中發現，套袋抑制果實葉綠素合成，降低果皮中的葉綠素含量[16-18]。但目前對桃果實套袋后果皮葉綠素降解基因表達等方面還未見相關報道。因此，筆者在本研究中以兩個成熟期接近的中油18號和中油19號桃品種為材料，研究套袋對油桃果皮葉綠素降解及葉綠素降解基因表達的影響，對葉綠素降解相關基因的表達進行分析，篩選關鍵基因，以期探討套袋影響桃果皮葉綠素降解的機制，尋找果皮底色形成的基礎及改進的栽培措施，為深入研究桃果實底色的調控機制提供理論依據，進一步為桃產業套袋生產提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料來自中國農業科學院鄭州果樹研究所桃品種圃內，株行距為1.0 m×4.0 m，2017年定植，常規管理。以成熟期接近的2個桃品種中油18號（CN18）、中油19號（CN19）為研究材料（圖1），均于6月中上旬成熟。2023年5—6月，于果實成熟前44 d（花后45 d）開始使用外黃內黑雙層袋套袋并取樣，不套袋為對照。之后在果實成熟前30 d采摘樹體外圍中上部大小均勻、無病蟲害、成熟度一致的果實30個，帶回實驗室使用尼康700 D相機于自然光下以黑色植絨布為背景拍照。以10個果實為1個樣本，取樣進行3次重復，取樣間隔7 d，在果實轉色期每隔4 d取樣1次，削取表皮進行液氮速凍，保存至-80 ℃冰箱備用。

1.2 色差檢測

用色差儀（美能達CR-400，柯尼卡美能達）評價果皮底色，顏色用CIE L*、a*、b*標尺表示。隨機選取果實赤道區域的四個不同點取平均值，記錄L*、a*和b*值[19-20]。

1.3 葉綠素含量測定

桃果皮葉綠素含量采用紫外分光光度法測定[21-22]。

1.4 RNA提取

根據多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根生化科技有限公司，北京，中國）說明書提取桃總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量和純度，取1 μL RNA利用微量紫外分光光度計NanoDrop2000（Thermo Scientific，麻省）測定濃度。取1 μg RNA參照FastKing cDNA第1鏈合成試劑盒說明書（天根生化科技有限公司，北京，中國）進行反轉錄，放置在-20 ℃冰箱保存進行后續的實時熒光定量PCR。

1.5 實時熒光定量檢測

從基因組數據庫（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）下載相關基因的CDS（Coding sequence，編碼序列）；利用Primer5.0設計特異性熒光定量引物，引物長度在20 bp左右，GC含量在40%～60%，引物Tm值在58～62 ℃，擴增片段大小為85～145 bp。選取Actin（ppa007228mg）為桃內參基因[23]（表1），最后按照2-ΔΔCT方法計算結果[24]。

1.6 數據分析

使用SPSS軟件對數據進行分析，用Excel 2003軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 套袋對桃果實發育后期果皮色差的影響

2.1.1 L*值的變化 由圖2可知，隨著果實生長發育，中油18號不套袋和中油19號不套袋的果皮色差L*值在成熟前44～16 d呈逐漸上升趨勢，中油18號不套袋的L*值從65.1變化為69.5，提高6.75%；中油19號不套袋的L*值從63.0變化為68.1，提高8.09%，表明中油18號不套袋和中油19號不套袋果皮亮度逐漸升高，且中油19號不套袋亮度比中油18號不套袋升高更快；在成熟前16～0 d，中油18號不套袋和中油19號不套袋的果皮色差L*值均逐漸降低。

中油18號套袋的果皮色差L*值在成熟前44～16 d逐漸上升，中油18號套袋的L*值從65.1變化為76.6，提高18.6%；中油19號套袋的果皮色差L*值在成熟前44～23 d也呈逐漸上升趨勢，中油19號套袋的L*值從63.0變化為74.1，提高17.6%，可見套袋會明顯提高果實的亮度。在成熟前16～0 d，中油18號套袋的L*值逐漸降低，在成熟前23～0 d中油19號套袋的L*值逐漸降低。套袋會提升果實亮度，改善果實色澤。

2.1.2 a*值的變化 由圖3可知，中油18號不套袋、中油18號套袋、中油19號不套袋和中油19號套袋在成熟前44～12 d的果皮a*值（紅綠色差）快速上升，在成熟前12 d進入轉色期，套袋比不套袋的a*值上升更快，所以套袋會加速果實成熟前44～12 d的a*值上升。在成熟前12～0 d，相比于套袋，不套袋的a*值上升更快。相較于不套袋，套袋果實的著色更淺。

2.1.3 b*值的變化 由圖4可知，中油18號不套袋和中油18號套袋果皮在成熟前44～0 d的果皮b*值（黃藍色差）呈快速下降趨勢，中油18號不套袋的b*值在成熟前44～12 d期間下降了43.9%；中油18號套袋的b*值在成熟前44～12 d期間下降趨勢最快，下降了48.7%；并且中油18號套袋比中油18號不套袋的b*值下降的更早，可見套袋會加快白肉桃b*值下降。中油19號不套袋果皮在成熟前44～0 d的b*值（黃藍色差）呈緩慢下降趨勢，但中油19號套袋的b*值（黃藍色差）在成熟前44～0 d呈先緩慢上升后逐漸下降趨勢。中油19號不套袋的b*值在成熟前44～12 d期間變化并不明顯，但在成熟前12～0 d下降了37.2%；中油19號套袋的b*值在成熟前44～12 d期間有緩慢升高，升高了11.1%，之后緩慢下降；可見套袋會導致黃肉桃b*值升高。

2.2 套袋對桃果實發育后期果皮葉綠素含量的影響

中油18號套袋的外觀表型比中油18號不套袋提早由綠轉白；中油19號套袋的外觀表型比中油19號不套袋提早由綠轉黃，如圖5所示，從成熟前44～12 d，套袋相較于不套袋的葉綠素含量顯著減少，在成熟前12～0 d時，套袋的葉綠素有緩慢降低。

2.3 套袋對桃果實發育后期葉綠素降解相關基因表達的影響

通過分析套袋處理2個桃品種中與葉綠素降解相關的10個基因（PpNYC1、PpNOL、PpHCAR、PpCLH1、PpCLH2、PpPPH、PpPAO、PpRCCR、PpSGR、PpSGRL）的相對轉錄水平，結果顯示（圖6），PpHCAR、PpCLH1、PpPPH、PpPAO、PpSGR在套袋果實中的表達量明顯高于不套袋。PpNYC1在中油19號套袋的成熟前16～12 d有明顯升高，PpNOL、PpHCAR在中油19號套袋的成熟前23～16 d表達量明顯上調。PpCLH2在中油18號套袋表達相比較于不套袋有升高，但在中油19號套袋卻被抑制。PpCLH1在套袋果實的成熟前23 d和成熟前12 d表達量均高于不套袋，中油18號不套袋和中油19號不套袋只在成熟前12 d表達量升高，但在果實成熟時PpCLH1表達量下降。PpPAO、PpRCCR在套袋的成熟前30～16 d表達量高于不套袋。PpPPH在2個品種套袋遮光后有顯著升高，并且PpPPH在中油19號套袋的成熟前23 d時顯著上調。PpSGRL基因在套袋中顯著被抑制，但在中油19號套袋的成熟前16 d時表達明顯升高，說明PpSGRL有可能與光照有關。PpSGR基因在中油18號套袋和中油19號套袋的成熟前23 d的表達量有所升高，隨著果實發育，果皮葉綠素降解，果實完全成熟，中油18號不套袋、中油18號套袋、中油19號不套袋和中油19號套袋中PpSGR顯著高表達。因此推測可能是光引起PpSGR提前表達。

聚類分析（圖7）顯示在中油18號不套袋中PpCLH1、PpPAO和PpSGR能聚到一類，中油18號套袋中PpCLH1、PpPPH、PpPAO和PpSGR能聚到一類。在中油19號不套袋和中油19號套袋中PpCLH1、PpPAO、PpPPH和PpSGR能聚到一類。在中油18號不套袋、中油18號套袋、中油19號不套袋和中油19號套袋中，PpNYC1、PpCLH2、PpRCCR、PpSGRL能聚到一類。說明在兩個品種葉綠素降解過程中PpCLH1、PpPAO、PpSGR的表達模式相似。

對葉綠素含量與其降解基因進行相關性分析（表2），發現PpCLH2基因表達與中油18號不套袋、中油18號套袋、中油19號不套袋、中油19號套袋中葉綠素含量呈顯著正相關，PpNYC1、PpNOL、PpHCAR與中油18號不套袋、中油18號套袋的葉綠素含量呈顯著正相關，PpSGR與中油18號套袋的葉綠素含量呈顯著負相關。

qRT-PCR結果表明，PpCLH1在套袋果實成熟前23 d和12 d的表達量均高于不套袋，PpPAO在中油19號果實成熟過程中表達量升高。PpSGR基因在中油18號和中油19號套袋果實完全成熟時相較于不套袋的顯著高表達，而經過套袋處理后在成熟前23 d表達量顯著升高。聚類分析顯示在中油18號不套袋中PpCLH1、PpPAO和PpSGR能聚到一類，中油18號套袋中PpCLH1、PpPPH、PpPAO和PpSGR能聚到一類。在中油19號不套袋和中油19號套袋中PpCLH1、PpPAO、PpPPH和PpSGR能聚到一類。在中油18號不套袋、中油18號套袋、中油19號不套袋和中油19號套袋中，PpNYC1、PpCLH2、PpRCCR、PpSGRL能聚到一類。相關性分析顯示PpSGR與中油18號套袋的葉綠素含量呈顯著負相關。初步表明PpCLH1、PpSGR基因是果實成熟前果皮葉綠素降解的關鍵基因。

3 討 論

果實的褪綠過程是一個復雜的生物學現象，它涉及果實成熟過程中葉綠素的降解過程。這個過程不僅受到果實內部遺傳的調控，還受到外部環境的影響。特定的基因和轉錄因子參與調控葉綠素合成和降解的途徑，決定了果實成熟過程中顏色變化的模式[25-27]。外部環境因子，如光照、溫度等，也會影響葉綠素的穩定性和降解速率，進而影響果皮的褪綠過程和最終色澤[28-30]。馮靜涵等[31]對翠冠梨果實進行套袋，與不套袋相比，套袋后果實的葉綠素含量下降，果面顏色變淺，L*值上升，外觀品質提高。桃果實套袋可改變果實生長發育的微環境，使果面潔凈，有效防止病蟲害對果實的侵害，改善外觀品質和內在品質，提高商品價值[32-33]。對隴蜜9號桃果實進行套袋處理發現，套袋會提高果實的L*值，不套袋的果實L*值最低[34]。筆者在本試驗中也發現套袋處理對油桃果實外觀的亮度影響較大，套袋會極大地提高果實的亮度，果實成熟時中油18號套袋和中油19號套袋亮度分別上升了19.2%和31.8%，這與蘋果中報道的研究結果相似[35-36]。李秋利等[37]以映霜紅為材料進行套袋處理，發現相比于不套袋處理，套袋會提高果實b*值。筆者在本試驗中發現套袋會讓油桃果實色差a*值在轉色期前快速升高，在黃肉品種中油19中套袋會提高果實b*值，果實成熟時中油19號套袋的b*值相較于中油19號不套袋（對照）上升了36.9%。該結果也與前人的研究相符[38-39]。馬瑞娟等[40]對油桃進行套袋試驗，結果顯示，與不套袋相比，果實的L*值提高，色素顯著降低，其中果實色素葉綠素a/b顯著降低。姜新等[41]對秋蜜桃1號進行套袋處理，結果表明外黃內黑雙層果袋套袋的果皮色素含量低、果實外觀較美觀。筆者在本研究中發現，套袋處理均能顯著降低中油18號和中油19號果實的葉綠素含量。馬英桃等[42]對春艷和春蜜2個桃品種進行套袋處理，結果表明套袋果實中葉綠素含量低于不套袋。

雖然前人對桃套袋后果皮褪綠機制已從生理角度有所探索，但對葉綠素降解基因的表達情況并未進行更深一步的研究，因此，筆者課題組對桃果實成熟過程中葉綠素降解基因的表達情況進行了分析。PpCLH1在套袋果實成熟前23 d和12 d的表達量均高于不套袋，在中油18號不套袋和中油19號不套袋中PpCLH1在成熟前12 d表達量升高，但在果實成熟時PpCLH1表達量下降。楊林先等[43]對蘋果梨進行套袋處理，發現盛花后90～120 d，即果實成熟前一個月，葉綠素酶（CLH）的活性明顯升高。PpPPH在套袋遮光后有顯著升高，并且PpPPH在中油19號套袋的成熟前23 d時顯著上調。陳成等[44]以海沃德獼猴桃為材料進行套袋發現套袋處理后AdPPH的表達豐富有顯著升高。這說明套袋可能會誘導葉綠素酶（CLH）和脫鎂葉綠素酶（PPH）的表達。PpSGR基因在中油18號和中油19號果實完全成熟時顯著高表達，但在套袋果實中成熟前23 d的表達量有所升高，并且表達提前。因此推測可能是套袋遮光引起PpCLH1、PpSGR提前表達。

4 結 論

筆者在本試驗中選取中油18號和中油19號進行套袋處理，發現套袋處理極大地提高了桃果實外觀的亮度（L*值）。在黃肉品種中油19號中套袋會提高果實b*值。熒光定量結果顯示，PpCLH1在套袋果實成熟前23 d和12 d的表達量均高于不套袋，PpPAO在中油19號果實成熟過程中表達量升高。PpSGR基因在中油18號和中油19號果實完全成熟時相較于不套袋的顯著高表達，而經過套袋處理后在成熟前23 d會提前表達，且表達量顯著升高。表明PpCLH1、PpPAO、PpSGR的表達導致果皮中葉綠素含量下降。

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收稿日期：2024-04-25 接受日期：2024-05-24

基金項目：國家桃產業技術體系（CARS-30）；中國農業科學院科技創新工程專項經費項目（CAAS-ASTIP-2023-ZFRI）；河南省重大公益科技專項（201300110500）

作者簡介：劉鑫，男，在讀碩士研究生，研究方向為果樹遺傳育種。E-mail：82101212241@caas.cn

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：niuliang@caas.cn