川西高原釀酒葡萄根癌病病原菌的鑒定及防治藥劑篩選

摘" " 要：【目的】明確川西高原釀酒葡萄根癌病的致病菌種類，評價不同藥劑對病原菌的抑制及對根癌病的防治效果。【方法】采集川西高原釀酒葡萄根瘤組織進(jìn)行病原菌的分離純化，通過形態(tài)觀察、生理生化鑒定、PCR檢測及16s rDNA測序分析確定分離菌株種類，并對分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（極大似然法maximum-likelihood）、生長特性分析及致病性檢測。利用皿內(nèi)抑菌圈法初步研究不同藥劑對病原菌的抑制作用，并通過葡萄苗接種試驗明確藥劑對根癌病的防治效果。【結(jié)果】成功由葡萄根瘤組織中分離得到9株菌株，經(jīng)鑒定為生物Ⅲ型葡萄土壤桿菌（Agrobacterium vitis），進(jìn)化分析表明，9株菌株聚類在同一分支。雖然9株菌株生長特性略有差異，但均能使胡蘿卜及葡萄形成癭瘤，有致病性。進(jìn)一步研究11種商品化藥劑對分離菌株的抑制效果，發(fā)現(xiàn)中生菌素、福美雙、多菌靈、春雷霉素、枯草芽孢桿菌和氫氧化銅對分離菌株抑制效果微弱或無效果，對分離菌株抑制效果較好的依次為四霉素、百菌清、喹啉銅、解淀粉芽孢桿菌KN-527及乙蒜素。進(jìn)一步驗證這5種效果較好的藥劑對葡萄根癌病的防治效果，其中乙蒜素對葡萄根癌病的防治效果最好，發(fā)病率僅為6%，防治效果高達(dá)48.05%；其次，喹啉銅及四霉素對葡萄根癌病有防治效果；在所試藥劑中，百菌清及解淀粉芽孢桿菌KN-527的防治效果較差。【結(jié)論】川西高原釀酒葡萄根癌病的致病菌為葡萄土壤桿菌，對釀酒葡萄根癌病防治效果最好的為乙蒜素，然后依次為喹啉銅、四霉素、百菌清及解淀粉芽孢桿菌KN-527。其中乙蒜素在根癌病田間防治可能具有較廣闊的應(yīng)用前景，生防菌株解淀粉芽孢桿菌KN-527對早期葡萄根癌病的發(fā)生有抑制作用。

關(guān)鍵詞：葡萄；根癌病；葡萄土壤桿菌；殺菌劑；病害防治

中圖分類號：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）08-1636-13

Identification of pathogenic bacteria and screening of control agents for wine grape crown gall disease in the Western Sichuan Plateau

GE Qing1， XU Huanduo1， WANG Jiale1， YU Chuwei1， LIU Wei2， LIU Xu1*

（1College of Enology， Northwest A amp; F University/Shaanxi Provincial Key Laboratory of Viti-Viniculture， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2Horticulture Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， Sichuan， China）

Abstract： 【Objective】 The Western Sichuan Plateau in China is considered as a high-quality wine grape producing area in China， due to its climatic characteristics such as sufficient sunlight， large temperature difference between day and night， little rainfall and large evaporation. However， the crown gall disease of grape frequently occurs in this region， directly threatening plant health and grape production and causing huge economic losses. Therefore， the premier objective of this study is to identify the pathogen species that cause grape crown gall disease specifically in the Western Sichuan Plateau for better clarifying the disease-controlling agents. Recent studies on grape crown gall disease are mainly carried out in the northern China， and the causes and pathogens causing grape crown gall disease in the Western Sichuan Plateau region have barely been investigated. Moreover， the limited control measures and unclear efficacy of commercial microbicides on grape crown gall disease have impeded the prevention and control in the field. Therefore， this study also aimed to find out the suitable disease managements by evaluating the controlling effect of 11 types of commercial microbicides on pathogenic bacteria. 【Methods】 Fresh grape crown galls were collected from the Western Sichuan Plateau for tissue grinding with the pathogen isolation by using MW selection medium， followed by yeast extract mannitol broth （YEB） medium. The isolated strains were then identified by morphological observation. The 16s rDNA was amplified with 27F （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） /1492R （5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'） for sequencing and phylogenetic analysis （Maximum-Likelihood） for each isolates. To better character the isolates and define their opine type， genes in T-DNA of Agrobacterium producing arginine， including octopine type and nopaline type， were amplified with primers AP-F/AP-R， OP-F/OP-R and NP-F/NP-R， respectively. The growth curve of the isolates was drawn by measuring optical density at 600 nm （OD600nm）. The biovar types of the isolates were applied to conduct physiological and biochemical analysis of bacterial identification. The pathogenicity detection was carried out by carrots and grapevine infection of the isolated strains. Then， the in vitro experiment was undertaken to study the inhibitory effect of different microbicides on isolated pathogenic bacteria by using in-dish bacteriostatic zone method. The bacteriostatic zone formed with different dilutions of 11 types of microbicides was measured. To further confirm the control effect of the microbicides agents on grape crown gall disease， the in vivo experiment of grape seedling inoculation was carried out for selecting the best agents. 【Results】 From the grape crown galls， 48 isolates were purified with characteristic of milky white， smooth and rounded colony with neat edges. In total， 9 strains were selected by PCR analysis and further confirmed with their 16s rDNA sequencing results. All of the 9 strains isolated from grape crown galls were identified as Agrobacterium vitis （A. vitis）. Phylogenetic analysis showed that 9 strains were clustered in the same branch， which included A. vitis S4 （CP000633.1）. Furthermore， the physiological and biochemical analysis was carried out for the 9 isolates， showing tested positive for the growth in 2% NaCl and alkaline reaction of litmus milk test， and tested negative for the 3-ketolactose production test， reaction to ferric ammonium citrate， citrate utilization test and reaction to acid from ethanol， followed by the characteristic of Agrobacterium biovar 3. The growth curve of the 9 strains was slightly different， indicating different growth characteristics. All of them could induce tumorigenic growth in carrots， and A10 strain could cause crown galls in Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and Vitis vinifera ‘Marselan’. In vitro study on the control effect of 11 commercial microbicides on the isolated strains indicated that zhongshengmycin， thiram， carbendazim， kasugamycin and copper hydroxide had weak or no effect on the isolated strains. The tetramycin， chlorothalonil， oxine-copper and ethylicin could inhibit pathogen growth. As for the biocontrol agents Bacillus amyloliquefaciens （B. amyloliquefaciens）， KN-527 presented a better inhibition effect on pathogen growth compared with B. subtilis. In vivo experiment was carried out in Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ to analyze the control effect of 5 agents on grape crown gall disease. The control effect of ethylicin was the best， with the incidence being only 6%， and the control effect was as high as 48.05%. The control effect of oxine-copper and tetramycin was acceptable as the incidences were 19% and 12%， respectively. Their control effects were 37.5% and 29.69%， respectively. The control efficacy of chlorothalonil and B. amyloliquefaciens KN-527 was very limited as the control effects were only 25.78% and 21.88%， respectively. 【Conclusion】 The pathogenic bacteria causing grape crown gall disease in the Western Sichuan Plateau were identified as Agrobacterium vitis. The isolated strains were slightly different in growth characteristics， but all of them showed tumorigenic and pathogenic. Phylogenetic analysis indicated that 9 strains were closely related to A. vitis S4 （CP000633.1）. Moreover， our results indicated the agents with the best control effect were ethylicin， followed by oxine-copper， tetramycin， chlorothalonil and B. amyloliquefaciens KN-527. Among them， ethylicin has a great prospect to be used in field application. The commercial biocontrol agents B. amyloliquefaciens KN-527 has an inhibitory effect on the early stage of grape crown gall disease development.

Key words： Grapevine; Crown gall; Agrobacterium vitis; Microbicide; Disease control

川西高原位于四川省西部橫斷山脈地區(qū)，因其具有光照充足、晝夜溫差大、夏季涼爽、降雨少而蒸發(fā)量大等氣候特點，非常適宜釀酒葡萄的生長，是中國釀酒葡萄優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)。然而，該地區(qū)葡萄園管理技術(shù)普遍落后，病害管理松散，導(dǎo)致個別地塊葡萄根癌病頻發(fā)，難以有效控制。葡萄根癌病能導(dǎo)致樹勢減弱、葉片脫落、結(jié)果能力差、嚴(yán)重時整株枯死，川西高原部分發(fā)病園區(qū)內(nèi)葡萄植株死亡率達(dá)40%，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，明確川西高原地區(qū)釀酒葡萄根癌病病原菌類型，篩選具有針對性的防治藥劑，能為當(dāng)?shù)仄咸迅┎〉姆乐渭搬劸破咸呀】瞪a(chǎn)提供依據(jù)。葡萄根癌病是一種由土壤桿菌引起的嚴(yán)重植物病害，病原菌進(jìn)入根莖組織導(dǎo)致細(xì)胞大量增生，從而形成癭瘤[1]。癭瘤可在葡萄根莖、主枝、側(cè)枝和結(jié)果母枝等部位形成，且癭瘤內(nèi)部木質(zhì)化嚴(yán)重阻礙植株水分及營養(yǎng)物質(zhì)運輸，導(dǎo)致植株生長發(fā)育受限，最終干枯死亡[2-3]。根癌病在世界范圍均有發(fā)生，在中國主要集中在北方地區(qū)，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[4-6]。引起根癌病的病原菌屬于土壤桿菌屬（Agrobacterium spp.），包括根癌土壤桿菌（A. tumefaciens）、發(fā)根農(nóng)桿菌（A. rhizogenes，亦命名為Rhizobium rhizogenes）、懸鉤子土壤桿菌（A. rubi）和葡萄土壤桿菌（A. vitis，亦命名為Allorhizobium vitis）[7-9]。根癌土壤桿菌和葡萄土壤桿菌均能侵染葡萄引起根癌病，其中以葡萄土壤桿菌為主要致病菌[10-14]。此外，土壤桿菌屬可依據(jù)生理生化性狀分為3種生物型：生物Ⅰ型，以根癌土壤桿菌為主；生物Ⅱ型，以懸鉤子土壤桿菌及發(fā)根農(nóng)桿菌為主；生物Ⅲ型，以葡萄土壤桿菌為主[7-10，15-19]。研究發(fā)現(xiàn)，不同生物型土壤桿菌的寄主范圍不同，在植物中表現(xiàn)出的致病力存在差異[16-19]，且殺菌劑及抗生素對其抑制效果不盡相同，乙蒜素和四霉素對分離自櫻桃及歐李的生物Ⅰ型土壤桿菌有較強(qiáng)抑制效果[20-21]，而福美雙、青霉素、硫酸鏈霉素對生物Ⅲ型根瘤菌有較強(qiáng)抑制效果[22-23]。對不同地區(qū)病原菌菌株類型進(jìn)行鑒定，可為篩選針對性藥劑提供理論依據(jù)。現(xiàn)階段根癌病的防治主要依賴于田間管理、化學(xué)藥劑及生物防治，其中田間管理著重在加強(qiáng)栽培管理，增強(qiáng)樹勢，阻止病原引入及傳播[24-25]；化學(xué)藥劑以硫酸銅液、石硫合劑、波爾多液等廣譜殺菌劑的使用為主[24，26-27]。此外，生物防治中，非致病菌A. radiobacter K84、A. vitis E26、A. vitis VAR031，A. vitis ARK-1和A. vitis F2/5等可抑制土壤桿菌生長及根瘤的形成 [28-33]。目前對中國川西高原地區(qū)葡萄根癌病的發(fā)生原因及主要致病菌情況不明，且現(xiàn)階段針對葡萄根癌病防治措施的研究十分有限，商品化藥劑對葡萄根癌病的防治效果尚不清晰，不利于生產(chǎn)上該病害的防治。筆者在本研究中以調(diào)查四川省甘孜州葡萄根癌病發(fā)生原因為切入點，通過明確川西高原地區(qū)葡萄根癌病致病菌類型及特征，探究商品化藥劑對病原菌的抑制作用及對葡萄根癌病的防治效果，為研究出行之有效的葡萄根癌病防治措施提供理論依據(jù)及技術(shù)指導(dǎo)，為該地區(qū)釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 病原菌的分離和培養(yǎng) 于四川省甘孜州鄉(xiāng)城縣釀酒葡萄園采集帶有新生癭瘤的赤霞珠葡萄根莖組織，清理癭瘤表面的老化組織并用無菌水沖洗，以8%次氯酸鈉溶液及75%乙醇先后進(jìn)行3 min和30 s的表面消毒，并以無菌水充分漂洗3次。切取癭瘤內(nèi)部新鮮組織并進(jìn)行低溫研磨，研磨后加入YEB培養(yǎng)基28 ℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后，靜置取上清液，按10、100、1000、10 000倍梯度稀釋，涂布于MW篩選培養(yǎng)基板上，于28 ℃條件下培養(yǎng)5～8 d。觀察并記錄分離菌落的形態(tài)特征。選取表面光滑微凸、乳白色到白色、圓形的典型土壤芽孢桿菌菌落劃線于YEB平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

供試陽性對照為葡萄土壤桿菌（Agrobacterium vitis）L3菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院杜國強(qiáng)教授惠贈。

1.1.2 葡萄品種、培養(yǎng)基及供試藥劑 葡萄品種：赤霞珠（Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’）及馬瑟蘭（V. vinifera ‘Marselan’）1年生盆栽幼苗。

培養(yǎng)基：MW培養(yǎng)基（甘露醇15 g；NaNO3 7.5 g；KH2PO4 0.45 g；NaCl 0.3 g；MgSO4·7H2O 0.15 g；0.1%生物素0.15 mL；0.1% 結(jié)晶紫3 mL；0.1% Fe-EDTA 3 mL 加蒸餾水至1.5 L）；YEB培養(yǎng)基（牛肉膏5 g；胰蛋白胨5 g；蔗糖5 g；酵母提取物1 g；MgSO4 0.5 g，加水至1 L，調(diào)pH為7.2～7.5。固體培養(yǎng)基加10～12 g瓊脂粉）。

供試藥劑：0.3%四霉素水劑（遼寧微科生物工程有限公司，登記證號：PD20160345）、 80%乙蒜素乳油（開封大地農(nóng)化生物科技有限公司，登記證號：PD20101285）、50%福美雙可濕性粉劑（河北冠龍農(nóng)化有限公司，登記證號：PD85122-13）、50%多菌靈可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司，登記證號：PD85150-35）、75%百菌清可濕性粉劑（上海惠光環(huán)境科技有限公司，登記證號：PD20060203）、46%氫氧化銅水分散粒劑（美國杜邦公司，登記證號：PD85122-13）、33.5%喹啉銅懸浮劑（興農(nóng)藥業(yè)有限公司，登記證號：PD20150445）、20%春雷霉素可濕性粉劑（乳山韓威生物科技有限公司，登記證號：PD20183246）、3%中生菌素可濕性粉劑（福建凱立生物制品有限公司，登記證號：PD20110113）、100億活菌/克解淀粉芽孢桿菌KN-527液體（武漢科諾生物科技股份有限公司，登記證號：微生物肥（2018）準(zhǔn)字（3342）號）、100億芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（德強(qiáng)生物股份有限公司，登記證號：PD20140340）。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離菌株的DNA提取 將分離純化得到的各個菌株的單一菌落接種至YEB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，參照Hi-DNAsecure Plant Kit高效植物基因組DNA提取試劑盒（天根，北京）說明書進(jìn)行各菌株的DNA提取。

1.2.2 分離菌株的16s rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 以上述提取得到各菌株的DNA為模板，使用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）/1492R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）進(jìn)行16s rDNA序列的擴(kuò)增。擴(kuò)增后利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（簡石生物，北京）回收長度1500 bp左右的目的條帶，并送至北京擎科生物科技股份有限公司（Beijing Tsingke Biotech Co.，Ltd.）進(jìn)行測序。將測序所得序列在National Center for Biotechnology Information（NCBI）網(wǎng)站中使用The Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）工具進(jìn)行比對，篩選出相似度高于98%的16s rDNA序列，并利用MEGA（Version 11.0.13）軟件構(gòu)建分離菌株與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹（最大似然法maximum-likelihood）。

1.2.3 分離菌株的PCR鑒定 以各菌株的DNA為模板，利用下述引物完成PCR鑒定，用于擴(kuò)增章魚堿型和胭脂堿型土壤桿菌T-DNA上的iaaH基因的引物iaaH-F（5'-CATGCATGAGTTATCGTTTGGAAT-3'）/iaaH-R（5'-GCATCAGGTCATCGTAAAAGTAGGT-3'）[22]；用于擴(kuò)增葡萄土壤桿菌含精氨酸型質(zhì)粒（arginine plasmid，AP）T-DNA上的iaaM基因的引物AP-F（5'-CGCGTCCCCGTTTACACTA-3'）/AP-R（5'-CGAGATCGCGCTTCAAGAT-3'）[22]；用以擴(kuò)增章魚堿型質(zhì)粒（octopine plasmid，OP）OP-F（5'-ATGGCTAAAGTGGCAATTTTGGG-3'）/OP-R（5'-TCAGATTGAATTCGCCAACTCG-3'）；用以擴(kuò)增胭脂堿型質(zhì)粒（nopaline plasmid，NP）NP-F（5'-TGACAGGATATATTGGCGGGTAA-3'）/NP-R（5'-TGCTCCGTCGTCAGGCTTTCCGA-3'）[18，34]。

1.2.4 分離菌株的生物型鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[35]和《植物病原細(xì)菌鑒定實驗指導(dǎo)》[36]中的不同試驗的表現(xiàn)指標(biāo)來對分離出的具有致病性的菌株進(jìn)行生物型的鑒定，具體包括3-酮基乳糖檢測、石蕊牛乳產(chǎn)堿、耐鹽性生長、35 ℃生長、乙醇產(chǎn)酸、檸檬酸鹽利用、檸檬酸鐵銨產(chǎn)褐色表膜和Kerr培養(yǎng)基生長。

1.2.5 分離菌株的生長曲線的測定 將各菌株分別在YEB培養(yǎng)基上活化，將活化后OD600值為0.8的菌液接種20 μL至2 mL YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，每隔3 h測1次OD600值，每個菌株做3管重復(fù)，試驗3次重復(fù)。

1.2.6 分離菌株的致病性分析 將活化后的各分離菌株懸于PBS緩沖液中（OD600=0.8），取200 μL涂抹于胡蘿卜圓盤上，對照組接種等量PBS緩沖液，將接種后胡蘿卜圓盤放在用無菌水浸濕的濾紙培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃光照條件下培養(yǎng)并隨時觀察是否有增生組織形成。于日光溫室中培養(yǎng)葡萄盆栽苗，待葡萄盆栽幼苗長至5枚葉片時進(jìn)行劃傷接種，用無菌針頭輕輕劃傷幼嫩主莖，迅速將100 μL懸于PBS緩沖液中（OD600=0.8）的A10菌液接種在劃傷處，對照組劃傷接種等量PBS緩沖液，每組接種8盆植株。接種后每隔3 d觀察接種部位是否有腫大或突起形成。

1.2.7 不同藥劑的皿內(nèi)抑制試驗 在直徑為6 mm的圓形無菌濾紙滴加7 μL不同濃度的藥劑，于超凈臺中吹干制成含藥濾紙備用。于YEB培養(yǎng)基上活化葡萄土壤桿菌A10菌株，吸取200 μL OD600=0.1的菌液均勻涂布于 YEB平板上，在培養(yǎng)基表面均勻放上2片含藥濾紙，對照組放入滴加無菌水的濾紙片。將培養(yǎng)皿正置放入4 °C條件下6～8 h，再倒置放入28 °C培養(yǎng)2～5 d，觀察到抑菌圈的出現(xiàn)后，采用十字交叉法測量濾紙的抑菌圈直徑，試驗3次重復(fù)。

1.2.8 不同藥劑的盆栽苗抑制試驗 將生長水平基本一致的盆栽赤霞珠葡萄苗用劃傷接種法接種等量A10菌株（OD600=0.8），置于日光溫室內(nèi)培養(yǎng)，每個處理接種30株。接種后1 d，在葡萄莖部接種部位涂抹200 μL 500倍稀釋藥劑，每周涂抹兩次，對照組以等量清水處理，于藥后第一周開始，觀察結(jié)瘤情況，從第一次觀察到細(xì)小突起開始，每隔3 d記錄接種部位的發(fā)病情況，發(fā)病率/%=發(fā)病植株/總接種植株×100；同時記錄接種部位出現(xiàn)突起或瘤狀物的個數(shù)，根據(jù)癭瘤數(shù)量及大小對病害嚴(yán)重度進(jìn)行分級并賦分，0級：植物健康，未出現(xiàn)癭瘤，賦0分；1級：出現(xiàn)癭瘤，癭瘤小，觸摸有細(xì)微凸起，賦1分；2級：癭瘤可清楚觀測，隆起明顯，賦2分；3級：癭瘤占著生部位截面直徑1/3，觀察到組織明顯增生，賦3分；4級：癭瘤占著生部位截面直徑2/3，著生部位出現(xiàn)壞死，賦4分；5級：癭瘤超過著生部位截面直徑，周邊組織大范圍壞死，賦5分。對于每個處理，病害嚴(yán)重度以該處理下所有接種部位病害嚴(yán)重度的平均值表示：病害嚴(yán)重度=Σ（各級病瘤的數(shù)量×各級分值）/總接種數(shù)量；病情指數(shù)=Σ（各級病害部位數(shù)量×相對級數(shù)值）/（總接種數(shù)量×5）×100；防治效果/%=（對照病情指數(shù)?處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SigmaPlot 14.0 軟件作圖和統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用Duncan氏新復(fù)極差法，p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄根癌病的危害及田間癥狀

對2020—2022年川西高原地區(qū)釀酒葡萄根癌病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)病葡萄園中平均植株病死率為20%～35%，嚴(yán)重地塊的病死率為50%～80%。冬季時期帶病葡萄植株的根莖部位能觀察到表面粗糙、木質(zhì)化、呈深褐色的癭瘤，且癭瘤多呈單側(cè)分布（圖1-A）。新生癭瘤由春季開始形成，于6—7月時表現(xiàn)為明顯瘤狀突起（圖1-B），新生癭瘤內(nèi)部為黃白色或黃綠色，且尚未木質(zhì)化。于7月上旬在兩處葡萄園內(nèi)不同地塊中采集帶有新生癭瘤的赤霞珠葡萄根莖組織（圖1-C～D），進(jìn)行葡萄根癌病的病原菌分離及鑒定。

2.2 病原菌的分離、鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對新鮮根瘤進(jìn)行表面消毒、研磨、涂板等操作，于MW篩選培養(yǎng)基上初步分離得到471個單菌落。觀察記錄菌落形態(tài)特征后，篩選出乳白色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落共130個，分別挑取于YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，對YEB培養(yǎng)基上生長并符合土壤桿菌典型特征的菌株進(jìn)一步分離純化。最終挑選出48株符合土壤桿菌形態(tài)的菌株，分別提取DNA并利用混合引物PCR擴(kuò)增土壤桿菌T-DNA上iaaH及iaaM基因進(jìn)行菌株的篩選，PCR初篩后得到9株陽性疑似菌株。對這9個菌株進(jìn)行16s rDNA片段的擴(kuò)增，并成功獲得長度約1500 bp的目的片段（圖2-A）。片段純化測序后進(jìn)行序列比對。結(jié)果表明，這9個菌株與Genebank中葡萄土壤桿菌（Agrobacterium vitis）相似度均大于98%。利用最大似然法（maximum-likelihood）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖2-B），發(fā)現(xiàn)分離所得9個菌株均聚類在一個分支上，且與數(shù)據(jù)庫中A. vitis CG78（CP056047.1）、A. vitis CG678（CP056042.1）及A. vitis S4（CP000633.1）聚為一支，與根癌土壤桿菌（A. tumefaciens）ATCC13332（HQ735085.1）和懸鉤子土壤桿菌（A. rubi）LMG294（FR828342.1）親緣關(guān)系較近，與發(fā)根農(nóng)桿菌（A. rhizogenes）K599（CP019702.1）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過上述形態(tài)學(xué)及序列分析，確定分離所得9個菌株均為葡萄土壤桿菌（A. vitis），分別命名為A10、A11、A18、A28、A30、A33、A38、A51和A53。然后通過PCR技術(shù)鑒定分離菌株是否屬于含精氨酸型質(zhì)粒（AP）、胭脂堿型質(zhì)粒（NP）或章魚堿型質(zhì)粒（OP）的土壤桿菌，結(jié)果（圖2-C）表明，9個菌株及正對照菌株L3在精氨酸引物（AP-F/AP-R）的擴(kuò)增下均獲得約750 bp的片段，而負(fù)對照并未出現(xiàn)條帶，9個菌株在胭脂堿引物（NP-F/NP-R）和章魚堿（OP-F/OP-R）擴(kuò)增下均無條帶，僅章魚堿類型的正對照菌株L3在OP-F/OP-R擴(kuò)增下出現(xiàn)約300 bp片段。因此， PCR鑒定結(jié)果表明，分離所得9個菌株均為精氨酸類型的葡萄土壤桿菌。

2.3 分離病原菌生長特性分析

為了明確各分離菌株的生長特性，通過測定9個菌株及對照菌株L3在YEB液體培養(yǎng)基中OD600的數(shù)值繪制各菌株生長曲線（圖3）。結(jié)果表明，菌株A11、A28、A30、A38及A51在3～6 h進(jìn)入對數(shù)生長期，12 h后進(jìn)入平臺期，這5個菌株比L3菌株生長繁殖更快。A10、A18、A33、A53的生長適應(yīng)期較長，3～6 h時這些細(xì)菌的培養(yǎng)液仍然比較清澈，從9 h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，其中A10生長最為緩慢，這4個菌株比L3菌株生長繁殖更慢。分離所得9個菌株表現(xiàn)出不同的生長繁殖速度。

2.4 分離病原菌生理生化鑒定

對分離菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括生成3-酮基乳糖檢測、石蕊牛乳產(chǎn)堿、耐鹽性生長、35 ℃生長、乙醇產(chǎn)酸、檸檬酸鹽利用、檸檬酸鐵銨產(chǎn)褐色表膜和Kerr培養(yǎng)基生長檢測，檢測結(jié)果如表1所示，根據(jù)根癌農(nóng)桿菌生物型鑒定指標(biāo)判斷[35，37]，其中A10、A11、A18、A28、A30、A33、A38、A51、A53菌株與生物Ⅲ型菌株生理生化反應(yīng)一致。分離所得菌株為生物Ⅲ型土壤桿菌。

2.5 分離病原菌的致病性測定

為了明確分離出菌株的致病性，將9個菌株分別接種于胡蘿卜圓盤中心位置，并以接種PBS緩沖液作為對照處理（CK）（圖4）。分別接種9個菌株的胡蘿卜圓盤在7 d后出現(xiàn)明顯綠色增生組織，而CK組胡蘿卜圓盤無增生組織出現(xiàn)，證明分離得到9個菌株均具有致瘤性。為了進(jìn)一步驗證分離菌株在葡萄上的致病性，通過劃傷接種法將A10菌液（懸于PBS緩沖液）分別接種在1年生赤霞珠幼苗及馬瑟蘭幼苗的莖部，以接種等量PBS緩沖液的葡萄幼苗為對照處理（CK）。接種后約1個月，觀察到赤霞珠及馬瑟蘭幼苗莖部接種部位出現(xiàn)明顯乳白色瘤狀突起，而CK組葡萄僅有劃傷后的細(xì)線狀愈合痕跡，無任何增生或突起組織。這說明分離出的菌株能夠在葡萄上形成癭瘤，具有致病性。

2.6 分離病原菌的皿內(nèi)藥劑防治研究

為了明確商品化藥劑對分離所得葡萄土壤桿菌A10菌株的抑制效果，選取商品化乙蒜素、四霉素、氫氧化銅、福美雙、多菌靈、春雷霉素、百菌清、中生菌素、喹啉銅、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌KN-527這11種藥劑，采用濾紙片抑菌圈法分析不同稀釋倍數(shù)下11種藥劑對A10菌株的皿內(nèi)抑制效果，觀察各藥劑形成的抑菌圈，并測量直徑（表2）。結(jié)果表明，除氫氧化銅外，其余10種供試藥劑對葡萄土壤桿菌均有抑制作用，但抑制效果有明顯差別。其中多菌靈和春雷霉素較弱，僅在250倍有抑制效果；福美雙在500倍稀釋范圍內(nèi)有抑制效果；中生菌素在750倍稀釋范圍內(nèi)有抑制效果；四霉素、百菌清及喹啉銅在1000倍范圍內(nèi)均有抑制效果；乙蒜素在1500范圍內(nèi)有抑制效果。通過對比各藥劑的作用濃度及其產(chǎn)生的抑菌圈大小，發(fā)現(xiàn)9種化學(xué)殺菌劑中，四霉素、百菌清、乙蒜素和喹啉銅對分離病原菌A10菌株的抑制效果較好。對比兩種商品化生防菌劑的抑制效果，發(fā)現(xiàn)相同稀釋倍數(shù)下，解淀粉芽孢桿菌KN-527的抑菌圈直徑遠(yuǎn)大于枯草芽孢桿菌，因此商品化解淀粉芽孢桿菌KN-527對病原菌的抑制效果優(yōu)于商品化枯草芽孢桿菌。

2.7 分離病原菌的盆栽苗藥劑防治研究

選取皿內(nèi)抑制效果較好的5種藥劑（四霉素、乙蒜素、百菌清、喹啉銅和解淀粉芽孢桿菌KN-527）進(jìn)行盆栽苗葡萄根癌病防治試驗。將A10菌株采用劃傷接種法接種在1年生赤霞珠幼苗莖部，接種后進(jìn)行藥劑處理并以清水處理為對照。處理后約3周觀察到接種部位開始形成細(xì)小突起，然后觀察葡萄幼苗發(fā)病情況，記錄發(fā)病率，依據(jù)癭瘤數(shù)量及大小對病害嚴(yán)重度進(jìn)行分級及賦值，并計算不同時間點各處理下植株病害嚴(yán)重度的平均值。結(jié)果（圖5）表明，相比于對照處理，藥劑處理均能夠降低葡萄根癌病的發(fā)病率（圖5-A），其中四霉素、乙蒜素、喹啉銅和解淀粉芽孢桿菌KN-527處理后幼苗的發(fā)病率顯著低于對照，乙蒜素處理將發(fā)病率控制在6%以內(nèi)，四霉素處理下發(fā)病率約為12%，解淀粉芽孢桿菌KN-527處理下發(fā)病率約為12.5%，喹啉銅處理下發(fā)病率約為19%。百菌清處理雖然能將發(fā)病率控制在40%左右，但與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)顯著差異。對不同藥劑處理下病害嚴(yán)重度隨時間的變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)四霉素、乙蒜素、百菌清、喹啉銅和解淀粉芽孢桿菌KN-527的病害嚴(yán)重度均低于對照組，且在后期差距更大（圖5-B）。同時發(fā)現(xiàn)各藥劑處理下病害嚴(yán)重度的變化趨勢并不完全一致，喹啉銅處理下前期的病害嚴(yán)重度較高，但增加較為緩慢，而四霉素處理下前期的病害嚴(yán)重度較低，之后急劇增加，乙蒜素處理下的病害嚴(yán)重度較低，且上升趨勢較為緩和。

對各藥劑處理后的病情指數(shù)及防治效果進(jìn)行分析（表3），發(fā)現(xiàn)乙蒜素處理下病情指數(shù)為26.6，防治效果達(dá)48.05%；喹啉銅和四霉素略高于乙蒜素，但二者處理后病情指數(shù)分別為32和36，防治效果分別為37.50%和29.69%；百菌清和解淀粉芽孢桿菌KN-527是相對效果較差的兩種藥劑，二者處理后病情指數(shù)分別為38和40，防治效果分別達(dá)25.78%和21.88%。綜上，對葡萄幼苗根癌病防治效果最好的藥劑為乙蒜素，然后依次為四霉素、喹啉銅、百菌清及解淀粉芽孢桿菌KN-527。

3 討 論

土壤桿菌（Agrobacterium spp.）能侵染向日葵、櫻桃、桃、歐李、葡萄等多種重要的經(jīng)濟(jì)作物并產(chǎn)生癭瘤，研究認(rèn)為，侵染不同植物的根癌病病原菌在生物型上存在差異[16-18]，且造成同種植物根癌病的主要致病菌也會因地區(qū)或品種差異而不同[21-22，36]。盡管國內(nèi)外研究認(rèn)為葡萄根癌病主要由生物Ⅲ型土壤桿菌的侵染造成[10，14]，但是引起不同地區(qū)或不同品種葡萄根癌病的主要病原菌并不一致。馬德欽等[10]發(fā)現(xiàn)生物Ⅲ型土壤桿菌為玫瑰香葡萄的主要致病菌，生物Ⅰ型及Ⅱ型僅能導(dǎo)致部分植株發(fā)病。Genov等[38]由不同品種葡萄根瘤分離得到生物Ⅲ型及生物Ⅰ型土壤桿菌，均在葡萄植株上具有致瘤性。尹向田等[18]發(fā)現(xiàn)濟(jì)南南部山區(qū)赤霞珠葡萄根癌病主要由生物Ⅰ型土壤桿菌引起。在本研究中，由川西高原地區(qū)赤霞珠葡萄發(fā)病植株中分離所得9個菌株均符合生物Ⅲ型土壤桿菌的生理生化特征，且系統(tǒng)進(jìn)化分析指出分離菌株均與生物Ⅲ型A. vitis S4（CP000633.1）菌株的親緣關(guān)系較近，因此，可以明確川西高原地區(qū)赤霞珠葡萄根癌病的主要病原菌為生物Ⅲ型葡萄土壤桿菌，這一發(fā)現(xiàn)為該地區(qū)根癌病的針對性防治提供了理論基礎(chǔ)。

為了明確市售商品化藥劑對川西高原地區(qū)葡萄根癌病的防治效果，針對11種商品化藥劑對分離菌株的抑制作用及對葡萄根癌病的防治效果進(jìn)行研究，綜合得出針對葡萄根癌病防治效果較好的藥劑依次為乙蒜素、四霉素、喹啉銅、百菌清及解淀粉芽孢桿菌KN-527。其中，乙蒜素作為一種能抑制多種真菌及細(xì)菌的生物源農(nóng)藥，對歐李和櫻桃根癌病病原菌有一定的抑制生長作用[21-20]。在本研究中，乙蒜素在稀釋250～1500倍的條件下對分離葡萄土壤桿菌有明顯抑制效果，乙蒜素500倍液處理下葡萄幼苗病害嚴(yán)重度最低，且發(fā)病率僅為6%，防治效果達(dá)48.05%，為抑制效果最好的藥劑。盡管在本研究中乙蒜素對病原菌的抑制效果不是最好的，但其在葡萄幼苗中防治效果突出，在田間使用中可能具有更大的潛力。此外，研究發(fā)現(xiàn)200～800倍乙蒜素對巨峰葡萄根癌病病原菌僅具有輕微的抑制作用[22]，這與本研究皿內(nèi)試驗結(jié)果略有不同，因此，乙蒜素針對釀酒葡萄及鮮食葡萄根癌病的防治效果是否一致，仍有待探索。值得注意的是，趙巖等[21]發(fā)現(xiàn)乙蒜素400～1000倍液對向日葵幼苗有藥害，然而本研究中使用乙蒜素500倍涂抹葡萄幼莖，并未觀察到藥害現(xiàn)象，有效濃度乙蒜素在葡萄上的使用并不會引起植物損傷。四霉素對分離病原菌及葡萄幼苗根癌病有較好的抑制作用和防治效果，雖然四霉素對釀酒葡萄根癌病的防治效果鮮少報道，但四霉素對櫻桃及歐李根癌病的病原菌具有抑制作用[20-21]。喹啉銅在葡萄根癌病的防治試驗中與四霉素表現(xiàn)相似，均具有一定的防治效果。盡管百菌清、多菌靈及福美雙等殺真菌劑對細(xì)菌性病害并不具有針對性，但這類藥劑在葡萄園中的廣泛使用對根癌病的防治是否有協(xié)同效果值得討論。本研究結(jié)果表明，百菌清對分離病原菌有較好的抑制效果，對葡萄幼苗根癌病有防治效果，但相比其他待試藥劑，防治效果欠佳，這一結(jié)論與前人研究[20，22]基本相符。盡管百菌清對細(xì)菌性病害不具有針對性，但其對根癌病病原菌有抑制作用，葡萄園中殺真菌劑的使用對根癌病的抑制存在一定的協(xié)同效果。由于分離菌株的特性差異，同種藥劑對不同品種植物根癌病的防治效果并不一致，針對性地尋找釀酒葡萄根癌病的防治措施非常必要。此外，藥劑對病原菌的抑制作用與其對葡萄根癌病的防治效果并不等同，藥劑的選擇不應(yīng)單單以對病原菌的抑制效果做標(biāo)準(zhǔn)，更應(yīng)該充分考慮在植物中的防治效果以及對植株的生長影響及藥害情況。

在果樹根癌病的防治中，生防菌因具有較好的針對性及防治效果，一直以來是研究的重點[39]。有研究表明，商品化枯草芽孢桿菌SR63可以有效抑制葡萄根癌病[5]，然而本研究中使用的商品化枯草芽孢桿菌抑制效果并不明顯。本研究中商品化解淀粉芽孢桿菌KN-527在皿內(nèi)抑制試驗中能夠形成抑制圈，對分離病原菌有抑制作用，且將葡萄幼苗根癌病的發(fā)病率控制在12.5%以下。盡管解淀粉芽孢桿菌KN-527作為一種菌肥在病程后期的防治效果并不明顯，但其對早期葡萄根癌病的發(fā)生有一定的抑制作用，因此推測商品化解淀粉芽孢桿菌KN-527可能通過占據(jù)生態(tài)位影響病原菌的生長，從而起到抑制病害早期發(fā)生的作用。另有研究表明，解淀粉芽孢桿菌JK10菌株對藍(lán)莓根癌土壤桿菌有良好的拮抗效果，其發(fā)酵液的田間防病效果明顯，能有效抑制癭瘤的形成[40]。因此，解淀粉芽孢桿菌是一種潛在可用于葡萄根癌病的生物防治菌株，但其針對釀酒葡萄根癌病的生防菌株篩選及商業(yè)化應(yīng)用研究仍需加強(qiáng)，且解淀粉芽孢桿菌在大田防治中的效果有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

川西高原釀酒葡萄根癌病的病原菌經(jīng)鑒定為生物Ⅲ型葡萄土壤桿菌（Agrobacterium vitis），分離得到的9株菌株生長特性略有差異，但均能致瘤，且在葡萄幼苗上有致病性，分離菌株與生物Ⅲ型A. vitis S4（CP000633.1）菌株的親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步研究11種商品化的藥劑對葡萄根癌病的防治效果，發(fā)現(xiàn)中生菌素、福美雙、多菌靈、春雷霉素、枯草芽孢桿菌和氫氧化銅對分離菌株抑制效果微弱或無效果，四霉素、百菌清、喹啉銅、乙蒜素及解淀粉芽孢桿菌KN-527對分離菌株抑制效果較好。綜合對比發(fā)現(xiàn)，對釀酒葡萄根癌病防治效果較好的藥劑依次為乙蒜素、喹啉銅、四霉素、百菌清及解淀粉芽孢桿菌KN-527。其中乙蒜素在根癌病田間防治中可能具有較廣闊的應(yīng)用前景，生防菌株解淀粉芽孢桿菌KN-527對早期葡萄根癌病的發(fā)生有抑制作用。

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收稿日期：2024-03-15 接受日期：2024-05-24

基金項目：陜西省重點研發(fā)計劃項目（2022NY-118、2023-ZDLNY-21）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目（023-JC-QN-0225）；秦創(chuàng)原引用高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才項目（QCYRCXM-2022-309）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（2452022013）

作者簡介：葛青，女，青年副教授，博士，研究方向為葡萄病害及抗逆機(jī)制。E-mail：geqing@nwafu.edu.cn

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：liuxu@nwafu.edu.cn