基于PINK1/Parkin通路探討丹紅注射液對冠心病大鼠心肌線粒體損傷的保護作用及機制

摘要 目的：探討丹紅注射液（DHI）對冠心病（CHD）大鼠心肌線粒體的保護作用，以及其對同源性磷酸酶張力蛋白誘導激酶1（PINK1）/E3泛素連接酶（Parkin）信號通路的調控機制。方法：采用高脂飼料、自由飲水持續(xù)喂養(yǎng)大鼠8周構建大鼠CHD模型，以丹紅注射液低（DHI-L）、丹紅注射液高（DHI-H）劑量進行干預，以過表達PINK1的pcDNA3.1-PINK1（pc）進行功能挽救實驗；電鏡檢測各組大鼠心肌組織中完整線粒體的比例；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記試劑盒（TUNEL）檢測大鼠心肌組織的細胞凋亡；超氧化物陰離子二氫乙啶（DHE）檢測大鼠心肌組織中活性氧（ROS）的含量；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）儀檢測各組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、線粒體融合蛋白2（MNF2）、線粒體分裂基因動態(tài)相關蛋白1（DRP1）、B細胞淋巴瘤-2相互作用蛋白1（Beclin1）、自噬相關基因5（ATG5），微管相關蛋白1輕鏈3（LC-3）的mRNA表達；蛋白免疫印跡法（Western Blot）實驗檢測大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）表達。結果：與CHD模型大鼠比較，DHI-L、DHI-H能明顯升高CHD大鼠心肌組織中完整線粒體的比例，抑制心肌細胞凋亡，下調心肌組織ROS含量，降低心肌組織PINK1、Parkin、DRP1、Beclin1、ATG5和LC-3的mRNA表達，升高心肌組織中MNF2的mRNA表達；下調PINK1、Parkin和Bax表達，上調心肌組織中Bcl-2表達；pcDNA3.1-PINK1可部分逆轉DHI對心肌線粒體的保護作用，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：丹紅注射液能明顯抑制CHD大鼠心肌組織的氧化應激，降低心肌線粒體的自噬水平，下調心肌組織中的細胞的凋亡率，改善實驗動物的心功能，這可能與抑制PINK1/Parkin信號的傳導有關。

關鍵詞 冠心病；線粒體損傷；丹紅注射液；同源性磷酸酶張力蛋白誘導激酶1/E3泛素連接酶；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.21.006

Protective Effect of Danhong Injection on Myocardial Mitochondrial Damage in Rats with Coronary Heart Disease Based on PINK1/Parkin Pathway

XU Liping

Science City Hospital of Sichuan Province， Mianyang 621900， Sichuan， China， E-mail： 582403463@qq.com

Abstract Objective：To investigate the protective effect of Danhong injection（DHI） on myocardial mitochondria in rats with coronary heart disease（CHD） and its regulation mechanism in homologous phosphatase tensin induced kinase 1（PINK1） /E3 ubiquitin ligase（Parkin） signaling pathway.Methods：The rat CHD model was constructed by continuous feeding of high-fat diet and free drinking water for 8 weeks.The intervention was performed with the low dose of Danhong injection（DHI-L） and high dose of Danhong injection（DHI-H）.The function rescue experiment was performed with pcDNA3.1-PINK1（pc） which overexpressed PINK1.The proportion of intact mitochondria in myocardium of each group were detected by electron microscopy.T erminal-deoxynucleoitidyl transferase-mediated nick end labeling（TUNEL） was used to detect apoptosis in rat myocardial tissue.The content of reactive oxygen species（ROS） in rat myocardium was detected by superoxide anion dihydroethidine（DHE）.The quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect the mRNA expression of PINK1，Parkin，mitochondrial fusion protein 2（MNF2），mitochondrial division gene dynamic associated protein 1（DRP1），B-cell lymphoma-2 interaction protein 1（Beclin1），autophagy related gene 5（ATG5），and microtubule associated protein 1 light chain 3（LC-3） in myocardial tissue of rats in each group.The expressions of PINK1，Parkin，B-lymphoblastoma-2（Bcl-2），and Bcl-2 associated X protein（Bax） in rat myocardial tissue were detected by Western Blot.Results：DHI-L and DHI-H could significantly increase the proportion of intact mitochondria in myocardial tissue of CHD rats，inhibit the apoptosis of cardiomyocyte，down-regulate the content of ROS in myocardial tissue，and decrease the mRNA expression of PINK1，Parkin，DRP1，Beclin1，ATG5，and LC-3 in myocardial tissue，increase the mRNA expression of MNF2 in myocardial tissue，down-regulate the expression of PINK1，Parkin and Bax in myocardial tissue，and up-regulate the expression of Bcl-2 in myocardial tissue，pc DNA3.1-PINK1 could partially reverse the protective effect of DHI on myocardial mitochondria，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Danhong injection can significantly inhibit oxidative stress in myocardial tissue of CHD rats，reduce the autophagy level of myocardial mitochondria，downregulate the apoptosis rate of cells in myocardial tissue，and improve the cardiac function of experimental animals，which may be related to the inhibition of PINK1/Parkin signal transmission.

Keywords coronary heart disease; mitochondrial damage; Danhong injection; phosphatase and tensin homologue-induced putative kinase 1/E3 ubiquitin ligases; experimental study

作者單位 四川省科學城醫(yī)院（四川綿陽 621900），E-mail：582403463@qq.com

引用信息 徐麗萍.基于PINK1/Parkin通路探討丹紅注射液對冠心病大鼠心肌線粒體損傷的保護作用及機制［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（21）：3878-3891.

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種臨床上常見的心血管基礎疾病之一，該病以發(fā)作性胸痛、嘔吐、心悸、惡心等為主要臨床表現，增加病人心源性猝死的風險，給病人和其家庭帶來沉重負擔。研究顯示，CHD發(fā)生后，其冠狀動脈呈現明顯的粥樣硬化，以致臟器微血管管腔狹窄導致心肌組織因血供或氧供出現短暫性的不足，引起心肌組織中抗凋亡B淋巴細胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）與促凋亡Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）表達失衡，以致凋亡的細胞驟增，心肌組織結構隨之改變，由此病人出現一定的心功能障礙，影響其日常生活^［1］。目前，CHD的發(fā)生、發(fā)展機制尚未完全闡明，尚無根治性的治療措施或藥物。因此，深入揭示疾病的分子進展機制，尋求可靠的干預靶點，積極地開展個體化靶向治療，具有重要臨床意義。Booth等^［2］研究顯示，在CHD等心血管疾病中，心肌細胞中的線粒體結構和功能障礙是疾病趨于惡性進展的關鍵事件之一。線粒體是心肌細胞進行能量和物質代謝的場所。正常生理狀態(tài)下，線粒體處于融合與分裂的動態(tài)平衡中；但在病理狀態(tài)下，線粒體分裂基因動態(tài)相關蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）的轉錄與翻譯水平升高，線粒體融合蛋白2（mitofusin2，MNF2）的轉錄與翻譯水平不足，線粒體的完整性受損^［3］；另外，DRP1表達的升高直接激活線粒體的自噬，Bcl-2相互作用蛋白1（Bcl-2 interacting protein 1，Beclin1）、自噬相關基因5（autophagy-related gene 5，ATG5），微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC-3）等相關基因的表達升高，推動線粒體的自噬，線粒體的數量銳減^［4］；而線粒體結構與功能的不足致使在線粒體雙側膜上進行活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的清除反應受限，ROS異常集聚，心肌組織中的氧化應激加劇，進一步加劇心肌組織的病理損傷^［5］。而同源性磷酸酶張力蛋白誘導激酶1（phosphatase and tensin homologue-induced putative kinase 1，PINK1）/E3泛素連接酶（E3 ubiquitin ligases，Parkin）信號是一條與線粒體功能密切相關的重要通路。Huang等^［6］研究顯示，在代謝性障礙誘導的心肌病小鼠中，抑制PINK1/Parkin信號的傳導能明顯抑制心肌組織中的線粒體自噬，改善動物的心功能。但是有關該通路在CHD中的作用的報道較少。

丹紅注射液（danhong injection，DHI）是臨床上用于治療冠狀動脈病變心臟病、慢性心力衰竭以及糖尿病性心肌病等疾病的一線藥物。本研究通過構建大鼠CHD模型，基于PINK1/Parkin信號，以過表達PINK1的pcDNA3.1-PINK1（pc）進行功能挽救，探討DHI對CHD中線粒體的保護作用，以期為臨床上藥物的推廣提供可靠的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級7～8周齡Wistar大鼠50只，體質量220～250 g，飼養(yǎng)于我院SPF級基礎動物房中，設定溫度（25±2）℃，濕度（45±5）%，12 h/12 h交替光暗循環(huán)周期，飲水與攝食自由，基礎飼料，進行適應性喂養(yǎng)。大鼠購買于武漢華美生物工程有限公司。本研究經醫(yī)院倫理委員會審批通過，編號：動倫07156號。

1.2 實驗試劑

丹紅注射液（山東丹紅制藥有限公司，國藥準字Z20026866）；過表達PINK1的pcDNA3.1-PINK1（pc）及其陰性對照pcDNA3.1-PINK1-NC（pc-NC）均由北京諾克奧基因工程技術有限公司設計完成。高脂飼料含10%蛋黃粉，2%膽固醇，10%豬油，0.2%丙硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉，購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。多聚甲醛、麻醉劑、磷酸鹽溶液（北京索萊寶生物科技有限公司），兔抗大鼠PINK1、Parkin、DRP1、Beclin-1、ATG-5、LC-3、三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、MFN2和DRP1單克隆抗體（上海碧云天生物科技有限公司），Trizol試劑盒、Prime Scrip TM試劑盒（武漢博士德生生物公司），脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法試劑盒（terminal-deoxynucleoitidyl transferase-mediated nick end labeling，TUNEL）、免疫熒光染色試劑盒、超氧化物陰離子二氫乙啶（dihydroethidine，DHE）試劑盒（上海臥宏生物科技有限公司），免疫組化、蛋白質免疫印跡（Western Blot）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（南京建成生物技術有限公司）。

1.3 實驗儀器

Tundra冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）（荷蘭賽默飛世爾科技有限公司），Vevo 3100LT高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司），REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid顯微鏡（美國Discover ECHO公司），ZF-288全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（美國PE公司），Nano Drop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）、ML136 POWERLAB多導生理記錄儀（澳大利亞ADInstruments 公司）。

1.4 CHD大鼠模型的復制及分組

1.4.1 CHD大鼠的造模術

參考文獻［7］進行CHD大鼠造模，以高脂飼料，自由飲水持續(xù)喂養(yǎng)大鼠8周；通過ML136 POWERLAB 多導生理記錄儀檢測實驗動物的Ⅱ聯(lián)心電圖，如果大鼠出現心律失常，T波抬高，ST段抬高＞0.1 mV的情況視為造模成功^［8］。

1.4.2 實驗分組^［9］

將已經適應性喂養(yǎng)的大鼠分為正常對照（Normal）組、模型（CHD）組、丹紅注射液低劑量（DHI-L）組、丹紅注射液高劑量（DHI-H）組、丹紅注射液高劑量＋過表達PINK1（DHI-H＋pc）組，每組10只。Normal組大鼠在造模過程中以基礎標準飼料進行喂養(yǎng)；在造模成功后，DHI-L組大鼠每日尾靜脈注射0.35 mL/kg的DHI，同時皮下注射2 μg/kg的pcDNA3.1-PINK1-NC；DHI-H組大鼠每日尾靜脈注射1.4 mL/kg的DHI，同時皮下注射2 μg/kg的pcDNA3.1-PINK1-NC；DHI-H＋pc組大鼠每日尾靜脈注射1.4 mL/kg的DHI，同時皮下注射2 μg/kg的pcDNA3.1-PINK1；Normal組和CHD組大鼠每日尾靜脈注射等劑量的生理鹽水，同時皮下注射2 μg/kg的pcDNA3.1-PINK1-NC，連續(xù)干預7 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 各組大鼠心電圖參數變化

在實驗過程中觀察大鼠的一般狀態(tài)，末次給藥結束后，大鼠禁食不禁水4 h，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，連接ML136 POWERLAB多導生理記錄儀，記錄1 min心電圖，統(tǒng)計分析各組大鼠心電圖ST段和T波段的變化。

1.5.2 各組大鼠心功能檢測^［10］

在進行心功能檢測時，將大鼠麻醉后，以仰臥位固定后，Vevo 3100LT高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)檢測各組大鼠心臟的左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）以及左心室收縮末期內徑（left ventrieular end-systolic diameter，LVESD）和左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）。

1.5.3 HE染色

待檢測大鼠的心功能后，腹主動脈取血2 mL，離心，留取上清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測^［11］大鼠血清中心肌損傷標志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）活性，以及丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平；處死大鼠，取部分大鼠的心肌組織，經石蠟包埋后，依次制成3 μm切片，經脫蠟，HE染色，脫水，清洗，透明，封片，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理損傷情況。

1.5.4 電鏡實驗

取部分大鼠的心肌組織，經石蠟包埋后，梯度濃度乙醇（30%，50%，70%，90%，100%）脫水，丙酮與環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片（約50 nm），鈾、鉛雙染色，電鏡下觀察。

1.5.5 TUNEL染色實驗^［11］

取部分大鼠的心肌組織，預處理后，切片，微波修復，封閉，TUNEL工作液避光染色，脫水，清洗，封片，顯微鏡下觀察。

1.5.6 DHE染色實驗

取部分大鼠的心肌組織，制備切片，切片經脫蠟后，滴加適量的DHE染色液，4 ℃避光過夜，次日磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后，共聚焦顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析各組大鼠心肌組織中DHE的熒光強度^［12］。

1.5.7 qRT-PCR

將Trizol裂解液加入大鼠的心肌組織中，按Trizol試劑盒要求提取總的RNA，Nano Drop 2000分光光度計測定其濃度后，Prime Scrip TM試劑盒合成cDNA，進行qRT-PCR擴增，預變性：95 ℃，5 s；變性：95 ℃，5 s；退火：60 ℃，60 s，40個循環(huán)，通過2^－△△CT來表示各目的基因的相對表達量^［13］。引物序列見表1。

1.5.8 免疫熒光實驗

取部分大鼠的心肌組織，多聚甲醛固定，BSA封閉，加入一抗（MFN2和DRP1的稀釋比例均為1∶100），在4 ℃下避光孵育過夜，充分清洗后，加入抗熒光二抗，防淬滅劑封片，鏡下觀察。

1.5.9 免疫組化實驗

取部分大鼠的心肌組織，常規(guī)切片，脫蠟，經3%過氧化氫（H₂O₂）溶液孵育，磷酸鹽緩沖液充分漂洗，微波加熱進行抗原修復，以山羊血清封閉20 min，滴加預先稀釋的一抗（1∶100），二抗（1∶800），緩沖液漂洗后，顯色，蘇木素復染，封片，顯微鏡下觀察，視野中出現棕黃色顆粒視為目標蛋白表達^［14］，結果判定：1）按陽性細胞百分數評分，0分為陽性細胞數≤5%；1分為陽性細胞數6%～25%；2分為陽性細胞數26%～75%；3分為陽性細胞數＞76%。2）按細胞著色強度評分，0分為無著色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。將兩項評分的乘積作為總評分。

1.5.10 Western Blot實驗

取部分大鼠的心肌組織，常規(guī)裂解法提取樣本中的總蛋白，BCA法測定其濃度，取50 μg進行電泳分離，結束后，轉膜，封閉，加入一抗（PINK1、Parkin、Bcl-2和Bax均1∶200），4 ℃避光孵育過夜，次日，清洗，加入二抗（稀釋比例均為1∶1 500），孵育，顯色后，GAPDH作為內參^［15］，進行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行數據分析，采用Graphpad8.0進行作圖。符合正態(tài)分布的定量資料以均數±標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)及心電圖指標比較

在實驗過程中，各組大鼠均未出現死亡；Normal組大鼠反應靈敏，活潑好動，行動迅捷，皮毛濃密、柔軟而有光澤，攝食與飲水未見異常，大小便正常；CHD組大鼠精神萎靡，活動量明顯減少，反應遲鈍，喜好臥在角落，大鼠的皮毛稀松，無光澤，飲水與攝食意愿不強烈，形體消瘦，四肢爪均無力，大便稀溏，尿量減少；DHI-L組、DHI-H組大鼠精神狀態(tài)明顯緩解，反應略微欠機警，活動量較Normal組減少，毛發(fā)欠光澤，尤其以DHI-H＋pc組大鼠的改善較為明顯；而DHI-H＋pc組大鼠，精神狀態(tài)一般，活動量較DHI-H組明顯減少，毛發(fā)欠規(guī)整，飲水以及攝食量較DHI-H組明顯減少。

2.2 各組大鼠心功能比較

高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)檢測結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組LVEF和LVFS降低，LVEDD和LVESD升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組LVEF和LVFS升高，LVEDD和LVESD降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組LVEF和LVFS升高，LVEDD和LVESD降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組LVEF和LVFS降低，LVEDD和LVESD升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3 各組大鼠血清心肌損傷標志物含量、心肌組織病理損傷和超微結構損傷比較

試劑盒檢測結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組血清CK-MB和LDH水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組血清CK-MB和LDH水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組血清CK-MB和LDH水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組血清CK-MB和LDH水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖3。

顯微鏡下觀察結果顯示，Normal組大鼠心肌組織中的心肌細胞的排列整齊、規(guī)整，呈束帶狀，心肌紋理清晰，未出現斷裂、缺失等現象，心肌細胞的胞核性狀穩(wěn)定，胞質、核質界限分明，無水腫，變性現象。CHD組線束心肌組織的心肌細胞出現不同程度的損傷，核膜缺失明顯，胞膜或消失或溶液，部分細胞出現片狀灶點壞死，心肌纖維瓶排列紊亂，心肌細胞的間隙增寬嚴重，炎性介質浸潤明顯；與CHD組大鼠比較，DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組大鼠心肌組織的病理損傷明顯緩解，炎性浸潤趨于明顯下降，心肌纖維的排列趨于整齊，細胞的腫脹程度明顯減輕，尤以DHI-H組的改善程度最為明顯，而DHI-H＋pc組大鼠心肌損傷程度較DHI-H組明顯加重。詳見圖4。

電鏡觀察結果顯示，Normal組心肌組織中的心肌纖維排列致密，胞漿中核糖體、線粒體、內質網、高爾基體性狀未見異常，線粒體的數量豐富，雙層膜結構完整，嵴結構清晰可辨，細胞未出現明顯的肥大或擴張現象；CHD組心肌組織中的心肌纖維排列松散，心肌細胞腫脹明顯，線粒體數量明顯減少，雙側膜呈現明顯的擴張態(tài)勢，出現空泡樣變性，嵴結構模糊難辨；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織的超微結構損傷明顯緩解，心肌纖維排列趨于有序，線粒體數量明顯回升，尤以DHI-H組心肌組織中線粒體數量回升明顯，雙側膜結構趨于清晰，嵴結構數量增加明顯；而DHI-H＋pc組較DHI-H組超微結構損傷明顯加重，線粒體出現一定腫脹，心肌纖維排列欠整齊。與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織中完整線粒體的比例下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織中完整線粒體的比例上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織中完整線粒體的比例上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織中完整線粒體的比例下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖5、圖6。

2.4 各組大鼠心肌組織細胞凋亡比較

對心肌組織進行TUNEL染色細胞凋亡檢測結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織的細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織的細胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織的細胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織的細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖7、圖8。

2.5 各組大鼠心肌組織中氧化還原水平比較

DHE熒光染色結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織中DHE的熒光強度升高，ROS含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織中DHE的熒光強度降低，ROS含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織中DHE的熒光強度降低，ROS含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織中DHE的熒光強度升高，ROS含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖9、圖10。

試劑盒檢測結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組血清中MDA水平升高，SOD水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組血清中MDA水平下降，SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組血清中MDA水平下降，SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組血清中MDA水平升高，SOD水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖11。

2.6 各組大鼠心肌組織中相關基因表達比較

qRT-PCR結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織中PINK1、Parkin、DRP1、Beclin-1、ATG-5、LC-3 mRNA表達升高，MFN2的mRNA表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織中PINK1、Parkin、DRP1、Beclin-1、ATG-5、LC-3 mRNA表達下降，MFN2 mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織中PINK1、Parkin、DRP1、Beclin-1、ATG-5、LC-3 mRNA表達下降，MFN2 mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織中PINK1、Parkin、DRP1、Beclin-1、ATG-5、LC-3 mRNA表達升高，MFN2 mRNA表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖12。

2.7 各組大鼠心肌組織中DRP1和MFN2表達比較

免疫熒光染色結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織中DRP1與MFN2熒光強度的比值升高，DRP1表達升高，MFN2表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織中DRP1與MFN2熒光強度的比值下降，DRP1表達下降，MFN2表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織中DRP1與MFN2熒光強度的比值下降，DRP1的表達下降，MFN2表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織中DRP1與MFN2熒光強度的比值升高，DRP1表達升高，MFN2表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖13、圖14。

2.8 各組大鼠心肌組織中自噬相關基因表達比較

免疫組化結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織中Beclin-1、ATG-5、LC-3的表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織中Beclin-1、ATG-5、LC-3的表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織中Beclin-1、ATG-5、LC-3下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織中Beclin-1、ATG-5、LC-3的表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖15、圖16。

2.9 各組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Bcl-2、Bax表達比較

Western Blot結果顯示，與Normal組比較，CHD組、DHI-L組、DHI-H組、DHI-H＋pc組心肌組織中PINK1、Parkin、Bax的表達升高，Bcl-2表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CHD組比較，DHI-L組、DHI-H＋pc組心肌組織中PINK1、Parkin、Bax表達下降，Bcl-2表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-L組比較，DHI-H組心肌組織中PINK1、Parkin、Bax表達下降，Bcl-2表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與DHI-H組比較，DHI-H＋pc組心肌組織中PINK1、Parkin、Bax表達升高，Bcl-2表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖17、圖18。

2.10 丹紅注射液對CHD大鼠線粒體損傷的保護作用

當大鼠發(fā)生CHD后，大鼠心肌組織中PINK1/Parkin信號被激活，PINK1、Parkin的表達升高，一方面，隨著PINK1、Parkin的表達升高直接導致心肌組織中氧化應激被激活，抗氧化SOD的表達與釋放明顯下降，氧化產物MDA的表達與釋放明顯升高，心肌組織中的ROS的含量隨之升高，ROS的清除依賴于線粒體功能的正常，因此線粒體功能出現障礙；另一方面，心肌組織中PINK1、Parkin的表達升高，直接誘發(fā)細胞線粒體自噬的過度激活，心肌組織中自噬相關基因Beclin-1、ATG-5和LC-3的轉錄與翻譯明顯升高，導致線粒體的結構損傷加劇；同時，隨著心肌組織中PINK1、Parkin的表達升高，心肌線粒體融合基因MFN2的表達明顯下降，心肌線粒體分裂基因DRP1的表達明顯升高，心肌組織中線粒體的數量明顯下降，線粒體功能受限，細胞凋亡率升高，心肌組織的病理損傷和超微結構損傷加劇，實驗動物出現明顯的心功能障礙；當以丹紅注射液干預，可抑制PINK1/Parkin信號的激活，下調PINK1、Parkin表達，部分解除PINK1、Parkin高表達導致的心肌損傷，但以pcDNA3.1-PINK1進行功能挽救實驗，結果顯示，pcDNA3.1-PINK1可部分逆轉丹紅注射液對心肌線粒體的保護作用。詳見圖19。

3 討 論

隨著當代生活方式、生活習慣和飲食結構的改變，人口結構的老齡化，心血管疾病尤其是CHD的發(fā)病率呈現日益升高的趨勢，由于臨床上特效藥的缺乏，疾病的發(fā)病機制以及分子進展機制成為此領域研究的熱點、重點之一。線粒體是心肌細胞中最為重要的細胞器之一，線粒體結構以及功能的穩(wěn)定，一方面，對于維系心肌細胞的收縮與舒張、電平衡、生長與增殖、衰老與凋亡等生物學行為至關重要；另一方面，高度特異性的線粒體自噬可及時的更新線粒體，在維系線粒體形態(tài)與數量平衡的同時，還在氧化應激、心肌細胞的損傷與修復中發(fā)揮重要的調控作用^［16］。因此，積極研究CHD中心肌線粒體損傷的分子機制，對于闡明疾病的分子進展機制，尋求可靠的分子治療靶點，具有重要的臨床意義。

針對CHD的治療，中醫(yī)學在漫長的歷史進展中積累了豐富的經驗，CHD可歸屬于中醫(yī)學“胸痹”“心痛”范疇，主要病機為血行不暢，血瘀脈阻，引發(fā)氣滯，內熱痰滯，中醫(yī)名家在“清熱解毒，活血益氣，宣發(fā)瘀熱”等理論指導下，創(chuàng)立了活血清熱益氣方、益氣活血方劑、通脈化濁湯、安神補心六味丸、活絡效靈丹、丹紅注射液等一系列的方劑、中成藥用于CHD的治療^［17］。其中，丹紅注射液為丹參和紅花組成的中藥注射劑，丹參以通血散瘀為主，而紅花發(fā)揮化瘀通絡效用；兩種藥物相輔，共奏活血通絡、祛瘀生新之效，主要干預“胸痹”等疾病的進展^［18］。現代藥理學研究顯示，丹紅注射液具有抗炎、降脂、抗氧化、改善微循環(huán)以及心血管保護的作用^［19］。劉旭等^［20］研究顯示，在急性血瘀大鼠模型中，丹紅注射液能明顯抑制實驗動物心肌組織中的氧化應激，降低心肌組織中的細胞凋亡率，減輕動物臟器的病理損傷。衛(wèi)國等^［21］研究顯示，在急性心肌梗死大鼠模型中，丹紅注射液能明顯促進缺血區(qū)域的血管新生，改善實驗動物的心功能，緩解大鼠心肌組織的病理損傷。李東等^［22］研究顯示，在CHD心絞痛并糖尿病的臨床治療中，丹紅注射液的應用能有效改善病人的糖脂代謝功能，控制病人心絞痛的發(fā)作，安全性較高，不良反應少，具有較高的臨床推廣價值。本研究中以丹紅注射液干預CHD大鼠后，大鼠心肌組織的氧化應激水平明顯降低，細胞凋亡率明顯下降，心功能明顯改善，心肌組織的病理損傷以及超微結構損傷明顯減輕，證實了丹紅注射液能明顯干預CHD疾病的進展。

更深入地揭示藥物的作用靶點，不僅有助于闡明疾病進展的分子機制，更有助于藥物的臨床推廣。PINK1/Parkin信號不僅在細胞的生長、分化、運動、衰老、凋亡以及物質代謝等生物學進程中發(fā)揮重要作用，更能通過影響自噬基因的轉錄與翻譯，激活線粒體的自噬，引發(fā)更為激烈的細胞應激行為^［23］。研究顯示，PINK1/Parkin信號參與包括CHD在內的心血管疾病的進展^［24］。Guan等^［25］研究顯示，在慢性心力衰竭小鼠模型中，抑制PINK1/Parkin信號傳導能明顯下調心肌組織中ROS含量，降低氧化應激水平，改善線粒體的物質代謝障礙。本研究結果顯示，當以丹紅注射液干預CHD大鼠后，可抑制PINK1/Parkin信號的激活，下調PINK1、Parkin表達，部分解除PINK1、Parkin高表達導致的心肌損傷，但以pcDNA3.1-PINK1進行功能挽救實驗，結果顯示，pcDNA3.1-PINK1可部分逆轉丹紅注射液對心肌線粒體的保護作用；推斷丹紅注射液可能通過抑制PINK1/Parkin信號來發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

綜上所述，丹紅注射液能明顯抑制CHD大鼠心肌組織的氧化應激，降低心肌線粒體的自噬水平，下調心肌組織中細胞凋亡率，改善心功能，這可能與抑制PINK1/Parkin信號傳導有關。但是如何將這一作用推廣至疾病的臨床治療中，仍需結合病人體質進行綜合性的預判。

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（收稿日期：2023-05-23）

（本文編輯 鄒麗）