玉米葉部性狀的QTL定位與候選基因分析

收稿日期：2024-01-17

基金項目：國家自然科學基金項目（32060460、32160451）；貴州省科技支撐計劃項目[黔科合支撐（2022）重點029]；貴州省山地農業關鍵核心技術攻關項目（GZNYGJHX-2023012）；貴州省育種科研基礎平臺創新能力建設項目[黔科合服企（2022）014]；黔農科院國基后補助項目[（2021）16號、（2022）02號、（2022） 09號]；貴州喀斯特山區重要作物生物育種平臺建設項目[黔科合中引地（2023）033]；貴州省育種科研基礎平臺創新能力建設項目[黔科合服企[（2022）014]；貴州省科研機構創新能力建設項目[（2022）007]

作者簡介：郭 爽（1997-），女，貴州晴隆人，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。（Tel）18985987996；（E-mail）18985987996@163.com

通訊作者：吳 迅， （Tel）18798004601;（E-mail）wuxunyong@126.com;陳澤輝，（Tel）13985441082;（E-mail）chenzh907@sina.com

摘要： 葉片在玉米生長過程中發揮著重要作用，它能夠有效地進行光合作用，為玉米提供營養物質，通過影響耐密性等影響產量提升。本研究選用QR273和T32為親本，構建150份F2、F2∶3家系材料，結合基因型和不同環境中葉部性狀的表型評價數據，利用完備區間作圖法進行數量性狀座位（QTL）定位。結果發現，2個環境下共檢測到85個葉部性狀相關QTL，其中有12個全株葉片數相關QTL、14個穗上葉片數相關QTL、22個葉長相關QTL、17個葉寬相關QTL、20個葉夾角相關QTL。結合公共數據庫和生物信息學分析方法共篩選出7個候選基因。其中Zm00001d013612編碼微管蛋白，參與調控細胞骨架結構組成；Zm00001d053543參與油菜素甾醇介導的信號通路；Zm00001d031291編碼的蛋白質具有組蛋白乙酰化功能；Zm00001d031292參與富含羥脯氨酸糖蛋白家族基因表達的調控；Zm00001d031296調控鉀離子跨膜轉運蛋白活性；Zm00001d031300、Zm00001d031303參與碳水化合物代謝過程。蛋白質功能分析結果表明，這7個候選基因均參與細胞分化，與植物的生長發育息息相關。本研究結果將為深度揭示玉米葉部性狀變異的遺傳基礎提供更豐富的理論支持。

關鍵詞： 玉米；葉部性狀；數量性狀座位（QTL）；候選基因

中圖分類號： S513"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）10-1777-10

QTL mapping and candidate gene analysis of leaf related traits in maize

GUO Shuang^1，2， NIE Lei^1，2， HE Yue^1，2， WANG Dong^1，2， TU Liang²， LIU Pengfei²， JIANG Yulin^2，3，GUO Xiangyang²， WANG Angui²， ZHU Yunfang²， WU Xun^2，3， CHEN Zehui²

（1.Agricultural College of Guizhou University， Guiyang 550025， China;2.Institute of Upland Food Crops， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550006， China;3.Key Laboratory of Crop Genetic Resources and Germplasm Innovation in Karst Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Guiyang 550006， China）

Abstract： Leaf plays an important role in the growth process of maize， and can effectively carry out photosynthesis， provide nutrients for maize， as well as affect yield increase by affecting density tolerance. In this paper， 150 F2 and F2∶3 family materials were constructed， using QR273 and T32 as the parents. Based on the genotype data and the phenotypic evaluation data of leaf related traits under different environments， quantitative trait locus （QTL） mapping was carried out by using inclusive composite interval mapping method. The results showed that， a total of 85 QTLs for leaf related traits were detected under two environments， including 12 QTLs relevant to total leaf number， 14 QTLs relevant to leaf number above the ear， 22 QTLs relevant to leaf length， 17 QTLs relevant to leaf width， and 20 QTLs relevant to leaf angle. Combined with the public database and bioinformatics analysis methods， seven candidate genes controlling leaf related traits were screened. Wherein Zm00001d013612 encoded tubulin and participated in the regulation of cytoskeleton structure composition， Zm00001d053543 involved in the brassinosteroid-mediated signaling pathway， and Zm00001d031291 encoded protein had the function of histone acetylation， Zm00001d031292 involved in the regulation of genes encoding hydroxyproline-rich glycoprotein family. Zm00001d031296 regulated the activity of potassium ion transmembrane transporter. Zm00001d031300 and Zm00001d031303 involved in carbohydrate metabolism. Functional analysis of proteins showed that， the seven candidate genes all involved in cell differentiation， which were closely related with plant growth and development. These results can provide relatively more theoretical support for deeply revealing the genetic basis of maize leaf related trait variation.

Key words： maize；leaf related traits；quantitative trait locus （QTL）；candidate gene

玉米（Zea mays L.）作為全球主要的糧飼兼用作物及主要的工業原料，在保障國家糧食安全及畜牧業發展中發揮著至關重要的作用^[1]。葉部性狀作為影響玉米種植密度的重要組成因素，對植物的光合作用、水分吸收、干物質積累以及產量形成等都起著重要作用^[2]。玉米葉部性狀是受多個微效基因調控的數量性狀，包括全株葉片數、穗上葉片數、葉長、葉寬、葉夾角等，易受環境影響。目前，已有較多研究者對玉米葉部性狀進行了研究。奉杰等^[3]以用玉米自交系ZNC442和SCML0849為親本構建的131份F2∶3家系為材料，在1號、2號、3號、5號、6號、8號、9號、10號染色體上定位到15個與穗上葉片數相關的數量性狀座位（QTL），貢獻率最大的為13.03%；定位到21個與葉夾角相關的QTL，可解釋2.47%～9.43%的表型變異。羅巧玲等^[4]以鄭58和B73構建的雙親分離群體為材料，共定位到11個控制玉米葉長的QTL，單個QTL的表型貢獻率為3.69%～25.53%。王會濤等^[5]利用豫82和豫87-1構建的重組自交系群體進行試驗，共定位到5個與葉長相關的QTL，單個QTL的表型貢獻率為8.72%～13.43%；與葉寬相關的QTL有7個，單個QTL的表型貢獻率為6.93%～11.68%；與葉夾角相關的QTL有7個，單個 QTL 的表型貢獻率為 7.08%～11.59%。這些研究結果為玉米葉部性狀遺傳機制解析和基于分子輔助的葉部性狀遺傳改良利用提供了較為豐富的分子遺傳學依據。但是，比較不同的研究成果，發現所用的材料、分子標記類型和數量都存在差異，所得到的QTL區段也存在差異。玉米葉部性狀不僅有著復雜的遺傳機制和基因調控網絡，還受到遺傳背景的影響。本研究擬以150份由玉米骨干自交系QR273和T32為親本構建的F2、F2∶3家系為材料，結合簡化基因組測序（GBS）結果和多個環境下葉部性狀表型數據，進行QTL定位，利用生物信息學分析方法對定位結果進行候選基因的預測，研究結果可為玉米葉部性狀改良提供更為豐富的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用的親本材料為QR273和T32，構建150份F2、F2∶3家系。雙親均為熱帶玉米骨干自交系，并在葉部性狀表現上具有明顯差異，親本T32葉部性狀表現為葉夾角大、葉較長、葉較寬，親本QR273葉部性狀表現為葉夾角小、葉較短、葉較窄，全株葉片數較少。

1.2 田間試驗及性狀調查

2021年冬天，在海南種植親本及F2代群體材料，將套袋自交后得到的F2∶3群體種植于甘肅省張掖市、貴州省貴陽市2地，試驗采取隨機區組設計，設置行長為3.00 m，行距為0.65 m，重復2次。在授粉20 d后，參考石云素^[6]對葉部性狀的考察標準，調查全株葉片數、穗上葉片數、葉長、葉寬、葉夾角，調查標準和參數設置如下：

全株葉片數：玉米第一節間以上的葉片數，單位為片；穗上葉片數：玉米有效穗部葉及以上葉片數，單位為片；葉長：有效穗上第一葉葉舌至葉尖長度，單位為cm；葉寬：有效穗上第一葉葉中部的寬度，單位為cm；葉夾角：有效穗上第一葉與主莖間的角度，單位為°。

1.3 基因型鑒定

對田間的F2代植株進行單株幼苗的DNA提取，將提取液送至北京康普生生物有限公司進行基因組測序，詳細的過程參考Wu等^[7]的方法。

1.4 數據整理與分析

利用Excel2021和SPSS26.0軟件對調查數據進行整理和分析，計算2個環境下的材料在群體間的全株葉片數（LN）、穗上葉片數（LAN）、葉長（LL）、葉寬（LW）、葉夾角（LA）的平均值與變異系數、方差、峰度、偏度和相關性系數等，家系遺傳力的計算公式為：

H2per mean=δ2gδ2g+δ2gee+δ2εer

δ2g為基因型方差，δ2ge為基因型×環境互作方差，δ2ε為誤差方差，m為環境個數，ｒ為重復數。

1.5 QTL定位及候選基因預測

去掉等位基因頻率（MAF）lt;0.05以及缺失率大于20%的單核苷酸多態性（SNP）位點后得到68 994個高質量SNP標記。QTL定位使用的軟件為IciMapping4.1，其中作圖步長為1 cM、逐步回歸標記進入的概率（PIN）為0.001、對數優勢比（LOD值）為2.5。對獲得的QTL結果進行一致性分析，一致性QTL判定標準參照奉杰等^[3]的方法，即與前人定位到的同一性狀的QTL區段存在重疊區段。隨后，利用生物學信息法在maize GDB的GBrowse網站（https：// maizegdb.org/gbrowse）上對一致性QTL區段進行候選基因及其功能注釋的查找，再結合前人的相關研究報道，篩選出關鍵候選基因。

2 結果與分析

2.1 葉部性狀表型分析

從表1可看出，自交系QR273的穗上葉片數平均值高于T32，而T32的全株葉片數、葉長、葉夾角平均值高于QR273。對于F2∶3群體的分析結果表明，5個性狀的偏度和峰度的絕對值均小于3.00，符合正態分布，且各性狀在分離群體中差異顯著（P＜0.05），符合QTL定位分析的條件。在不同環境中遺傳力存在一定的差異，其中葉長和葉夾角間遺傳力差異較大，葉長的遺傳力在貴陽為0.90，在張掖為0.62；葉夾角的遺傳力在貴陽為0.60，在張掖為0.91。

2.2 相關性分析

葉部性狀間的相關性分析結果見表2。結果顯示，全株葉片數與穗上葉片數、葉寬，穗上葉片數與葉寬，在2個環境下均呈極顯著正相關，而葉長與葉夾角在貴陽環境下呈極顯著負相關，穗上葉片數與葉長在貴陽環境下呈顯著正相關。

2.3 高密度物理圖譜構建

對獲得的SNP位點進行過濾后得到68 994個高質量SNP標記。標記數量在1號染色體到10號染色體上依次為8 725個、8 824個、7 623個、8 901個、7 174個、5 432個、5 592個、6 407個、5 782個、4 534個，標記數量的大小情況表現為： 4號染色體＞2號染色體＞1號染色體＞3號染色體＞5號染色體＞8號染色體＞9號染色體＞7號染色體＞6號染色體＞10號染色體，染色體長度分別為308.42Mb、243.67 Mb、237.96 Mb、250.18 Mb、226.35 Mb、181.35 Mb、185.78 Mb、182.31 Mb、162.90 Mb、152.37 Mb，平均標記間距為30.89 kb。

2.4 控制葉部性狀QTL

如表3和圖1所示，共檢測到85個葉部相關性狀QTL。全株葉片數相關QTL有12個，分布于1號、2號、4號、5號、6號、7號染色體上，其中張掖有6個，貴陽有6個，單個QTL可解釋的表型貢獻率為1.07%～9.40%；穗上葉片數相關QTL有14個，分布于10條染色體上，其中張掖有8個，貴陽有6個，單個QTL可解釋的表型貢獻率為4.24%～11.98%；葉長相關QTL有22個，除6號染色體以外的9條染色體上均有分布，其中張掖有7個，貴陽有15個，單個QTL可解釋的表型貢獻率為2.70%～8.44%；葉寬相關QTL有17個，分布于1號、2號、3號、4號、5號、9號、10號染色體上，其中張掖有10個，貴陽有7個，單個QTL可解釋的表型貢獻率為1.58%～12.91%；葉夾角相關QTL有20個，10條染色體上均有分布，其中張掖有6個，貴陽有14個，單個QTL可解釋的表型貢獻率為2.43%～7.43%。由表3還可以看出，共檢測到有2個穗上葉片數相關QTL和1個葉寬相關QTL貢獻率大于10.00%，并且在10號染色體上發現1個QTL富集區域，即在10號染色體上的138 770 494～139 388 961 bp區間檢測到1個同時控制玉米葉寬和葉夾角的QTL，表現出一因多效的現象。

2.5 “一致性”QTL及候選基因預測

對比前人的研究結果^[8-12]，共找到7個“一致性”QTL，分別控制葉長、葉寬和葉夾角的變異。在這7個“一致性”QTL中查找相關基因的功能注釋，再根據前人的研究成果，初步預測出7個候選基因（表4）。蛋白質功能分析結果顯示，Zm00001d013612編碼微管蛋白β鏈并且參與調控細胞骨架結構組成、微管細胞骨架組織的組成；Zm00001d053543參與油菜素甾醇介導的信號通路；Zm00001d031291編碼組蛋白乙?；⑶覅⑴cDNA甲基化調控；Zm00001d031292 參與富含羥脯氨酸糖蛋白家族基因表達的調控；Zm00001d031296調控鉀離子跨膜轉運蛋白活性；Zm00001d031300、Zm00001d031303參與碳水化合物代謝過程。這些基因參與的蛋白質編輯功能可能與植物葉片發育密切相關。

3 討論

3.1 本研究與前人研究結果的比較

本研究共定位到85個葉部性狀相關QTL，其中有7個QTL與前人定位到的區段存在重合，本研究在4號染色體232.9～233.6 Mb和10號染色體33.9～34.1 Mb定位到的葉長相關QTL，與趙文明^[8]利用簡單重復序列（SSR）標記對豫82和沈137構建的F2∶3家系群體進行QTL定位，在第4染色的120.2～244.5 Mb（B73RefGen_v4）和第10染色體的13.5～85.2 Mb（B73RefGen_v4）定位到的葉長相關QTL存在重疊，但本研究鑒定出的QTL區間更小。此外，張曠野^[9]通過SSR標記對掖478和齊319構建的300份重組自交系進行QTL定位，在1號染色體的184.8～193.6 Mb（B73RefGen_v4）定位到1個與葉寬相關QTL，大小為8.8 Mb。本研究在1號染色體185.3～186.1 Mb定位到1個葉寬相關QTL，大小為0.8 Mb，定位區間顯著小于前人定位結果。路明等^[10]利用SSR標記以掖 478和丹 340構建的F2、F2∶3群體為材料，在164.2～194.9 Mb定位到1個控制葉夾角的QTL，與本研究在3號染色體的175.19～175.35 Mb定位到的葉夾角相關QTL存在重疊。常立國等^[11]以許178×K12構建的150份重組自交系為材料，利用SSR標記對葉部性狀進行QTL定位，在第3染色體的172.8～190.3 Mb（B73RefGen_v4）和第10染色體的115.2～128.2 Mb（B73RefGen_v4）各定位到1個與葉夾角相關的QTL，與本研究定位結果相似，即本研究在3號染色體175.2～175.4 Mb（B73RefGen_v4）和10號染色體116.9～117.1 Mb（B73RefGen_v4）也各定位到1個與葉夾角相關的QTL，大小均為0.2 Mb，定位區間進一步縮小。劉鵬飛等^[12]在5號染色體的4.3～55.7 Mb（B73RefGen_v4）定位到1個控制玉米葉夾角的QTL，本研究在3號染色體175.2～175.4 Mb（B73RefGen_v4）和10號染色體116.9～117.1 Mb內也各定位到1個與葉夾角相關的QTL，在這些“一致性”QTL表達較穩定、可靠性較高的基礎上，本研究定位到的QTL較前人定位區間更小，更利于下一步精細定位和候選基因的圖位克隆。

3.2 候選基因預測分析

本研究共篩選出7個關鍵候選基因，這些基因參與的激素調控和蛋白質表達，可能與植物葉片生長發育密切相關。其中，Zm00001d013612編碼微管蛋白β鏈并且參與調控細胞骨架結構組成、微管細胞骨架組織的組成。根據前人的研究結果，細胞骨架包括微絲、微管和中間纖維^[13]，微管在植物中具有維持植物細胞形態^[14-15]、細胞運動^[16]、細胞內物質運輸^[17-18]、細胞分裂^[19]以及細胞壁形成等重要作用^[20]。Zm00001d053543參與油菜素甾醇介導的信號通路，在植物中參與莖的伸長、細胞分裂和分化的調節^[21-24]，參與了幾乎所有的植物生長發育過程，被證實在水稻中能夠調控株高、葉夾角、籽粒大小^[25]。Zm00001d031291編碼組蛋白乙酰化并且參與DNA甲基化調控，影響植物的分生組織形成^[26]、細胞的增殖^[27]等過程，與器官的生長過程密切相關，在細胞內通過影響基因的轉錄和表達，從而影響細胞分化的過程^[28]。Zm00001d031292參與富含羥脯氨酸糖蛋白家族表達基因的調控，而此蛋白質是高等植物細胞壁中特有的，具有強固細胞壁的作用^[29]。Zm00001d031296與鉀離子跨膜轉運蛋白活性密切相關，鉀營養能夠影響油菜葉片生長過程中葉肉細胞的分布和形態，對葉面積擴張、CO2和H2O的運輸過程具有重要作用^[30]。 Zm00001d031300、Zm00001d031303參與碳水化合物的代謝過程，碳水化合物能夠參與植物細胞壁的形成，是植物的主要能量來源，Blumstein等^[31]研究發現非結構性碳水化合物能夠向細胞發出時間流逝的信號，觸發葉片發育，這些基因可能通過影響細胞的生長發育或參與激素的調控等方式影響植物葉部性狀的生長發育，可初步預測為關鍵候選基因。本研究結果可為后續的基因精細定位、克隆以及有效開展玉米葉部性狀分子改良研究提供支撐。

3.3 葉部性狀QTL在育種上的利用

目前也有較多研究者通過QTL定位發現控制玉米葉部性狀的關鍵基因，Gao等^[32]鑒定到葉寬相關QTL的候選基因ZmNL4在被敲除后玉米葉片寬度顯著降低， Xia等^[33]通過全基因組關聯分析發現了1個位于基因RHW1上的SNP位點與玉米殼葉寬度顯著相關，并證實RHW1-ZCN4調控途徑會影響玉米殼葉的寬度，Tian等^[34]研究證實ZmRAVL1能夠通過影響葉鞘和韌帶區域正向厚壁組織細胞數目從而正向調節玉米葉夾角。植物中還存在許多基因通過參與激素調控來控制葉部性狀。例如擬南芥中ROTUNDIFOLIA3/4編碼的CYP90C1能夠通過合成油菜素內脂，影響細胞的極性擴展，從而對葉片長度起到調控作用^[35-37]。Uzair等^[38]研究發現窄葉突變體生長素響應因子ARF的蛋白質翻譯效率降低后會導致生長素調控的葉片細胞分裂和擴展受阻，從而影響葉片寬度。Best等^[39]研究發現影響油菜素甾醇合成的基因Nana plant2突變后會導致玉米矮小、葉片形態變化和葉夾角增大^[40]?？偟膩碚f，植物葉部性狀的生長發育是一個復雜的過程，具體的調控網絡還有待進一步的深入挖掘。QTL定位是數量遺傳學的主要研究課題之一，高分辨率的遺傳標記圖譜能夠定位到更精確的QTL區段，基于這些研究成果，后續可對所得到的關鍵遺傳區段進行精細定位，利用亞細胞定位、β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）染色、遺傳轉化（過表達、干擾、基因編輯等）對候選基因進行功能驗證，開展蛋白質互作相關試驗，通過酵母雙雜、免疫共沉淀（CO-IP）、雙分子熒光互補（BiFC），或是蛋白質與核酸互作研究等方式對目標基因的功能機制進行更深入的研究。綜上所述，本研究結果能夠對后續深度揭示玉米葉部性狀變異的遺傳機制、相關候選基因克隆以及基于分子輔助選擇育種提供參考。

4 結論

本研究共檢測到85個葉部性狀相關QTL，單個QTL的貢獻率為1.07%～12.91%，與前人研究結果進行比對，共發現7個“一致性”QTL，并且定位到的區間更小。共預測出7個候選基因，分別是Zm00001d013612、Zm00001d053543、Zm00001d031291、Zm00001d031292、Zm00001d031296、Zm00001d031300、Zm00001d031303，所參與的細胞生長發育、蛋白質和激素調控在作物生長發育過程中起著重要作用，可能是玉米葉部性狀變異的關鍵候選基因，可以作為后續QTL的精細定位、候選基因圖位克隆和功能研究新的參照。

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（責任編輯：陳海霞）