非洲豬瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表達及反應原性分析

收稿日期：2023-12-11

基金項目：國家重點研發計劃項目（2022YFD1800601）；國家自然科學基金項目（31941013）；江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（21）3137）]；河北省省級科技計劃資助項目（21322401D）；蘇北科技專項（SZ-LYG202109）

作者簡介：周俊明（1983-），男，江蘇東臺人，碩士，副研究員，主要從事動物傳染病防治和診斷技術研究。（Tel） 025-84390988；（E-mail） zhoujm075@163.com

通訊作者：李 彬，（E-mail） libinana@126.com

摘要： 為比較非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反應原性，探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原優勢片段。本研究通過PCR、克隆技術將p30蛋白氨基酸序列中不同片段的編碼基因分別插入表達質粒pET32a，經IPTG誘導、Ni柱純化、透析后，獲得p30蛋白氨基酸序列中8～101 aa片段（P-1#）、58～101 aa片段（P-2#）、101～158 aa片段（P-3#）、8～194 aa片段（P-4#），用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段與p30蛋白免疫兔血清和ASFV陽性豬血清的反應原性。結果顯示，上述片段均獲得誘導表達及純化，表達形式有可溶性表達（P-1#、P-3#）和包涵體表達（P-2#、P-4#）。各片段以1.0 mg/L包被時，p30免疫兔血清與p30蛋白氨基酸序列中4種片段均能發生免疫反應，ASFV陽性豬血清與P-4#、P-1#反應較佳，與P-3#反應中等，與P-2#反應最弱。綜上，p30蛋白氨基酸序列中不同片段反應原性的差異為認識p30抗原優勢區域提供了數據，這將有助于非洲豬瘟血清學診斷抗原的科學篩選。

關鍵詞： 非洲豬瘟病毒；p30蛋白；氨基酸序列片段；反應原性

中圖分類號： S852.65"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）10-1875-07

Expression and reactogenicity analysis of the truncated amino acid sequence of p30 protein in African swine fever virus

ZHOU Junming， NI Yanxiu， FAN Baochao， ZHU Haodan， ZHU Xuejiao， WANG Dandan， HU Yiyi， LI Bin

（Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China）

Abstract： The purpose of this study was to compare the reactogenicity of different fragments of the p30 protein amino acid sequence of African swine fever virus （ASFV）， and to explore the possible antigen-dominant fragments in the p30 protein amino acid sequence. In this study， the coding genes of different fragments of p30 amino acid sequence were inserted into the expression plasmid pET32a by PCR and cloning techniques. After IPTG induction， Ni column purification and dialysis， 8-101 aa fragment （P-1#）， 58-101 aa fragment （P-2#）， 101-158 aa fragment （P-3#） and 8-194 aa fragment （P-4#） in the amino acid sequence of p30 protein were obtained. The reactogenicity of different fragments of p30 protein amino acid sequence with p30 protein immunized rabbit serum and ASFV positive pig serum was analyzed by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The results showed that the above fragments were induced and purified. The expression forms were soluble expression （P-1#， P-3#） and inclusion body expression （P-2#， P-4#）. When each fragment was coated at 1.0 mg/L， the p30 immunized rabbit serum and the four fragments in the amino acid sequence of p30 protein could react with each other. The reaction of ASFV-positive pig serum with P-4# and P-1# was better， with P-3# was moderate， and with P-2# was the weakest. In summary， the differences in the reactogenicity of different fragments in the amino acid sequence of p30 protein provide data for understanding the dominant fragments of p30 antigen， which will help the scientific screening of serological diagnostic antigens of African swine fever.

Key words： African swine fever virus;p30 protein;amino acid sequence fragment;reactogenicity

非洲豬瘟（Afircan swine fever， ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種高度致死性傳染病，可感染不同日齡和品種的家豬和野豬^[1]，臨床表現急性出血熱、皮膚斑點，剖檢有淋巴結和內臟器官出血等癥狀^[2]。ASF被世界動物衛生組織（OIE）列為法定報告動物疫病，2018年8月，首次報道了非洲豬瘟病毒基因Ⅱ型毒株傳入中國，在短短6個月內，高致死率的急性非洲豬瘟在中國大多數省份迅速傳播，給中國養豬業造成了巨大損失^[3]；2020年報道非洲豬瘟病毒出現了低毒力基因Ⅱ型毒株^[4]；2021年出現非洲豬瘟基因Ⅰ型毒株，該毒株可引起豬慢性感染^[5]，上述低致病力毒株的出現給非洲豬瘟的防控帶來新的挑戰。

國際病毒分類委員會將ASFV歸為非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，ASFV含有雙層囊膜，基因組全長170～193 kb，包含151～167個基因^[6]，基因組中間區域較為保守，不同ASFV毒株之間的基因組差異主要來源于基因組末端多基因家族的不同^[7]。有研究利用原核表達系統表達了35種ASFV結構蛋白，并利用ASFV陽性豬血清評估這些蛋白的抗原性，結果顯示，感染ASFV后p30蛋白誘發的免疫反應早且明顯^[7]。p30定位于ASFV囊膜的內膜，由基因CP204L編碼，主要參與了ASFV與靶細胞結合以及內化^[8-9]，目前已有較多研究利用p30單克隆抗體解析p30的抗原信息，以及表達p30全長蛋白建立ASFV抗體檢測方法，但大部分原核表達獲得的p30蛋白是以包涵體形式存在的。本研究擬開展p30蛋白氨基酸序列不同片段的原核表達，并分析p30蛋白不同區域的表達形式以及免疫反應特性，進一步豐富對p30抗原特性的認識。

1 材料與方法

1.1 載體、重組菌、蛋白和血清

p30重組表達質粒 pET28a-p30（1～194位氨基酸）、表達載體pET-32a（+）、硫氧還蛋白（TRX）、pET32a-p30（8～101位氨基酸）重組菌、pET28a-p30純化重組蛋白均由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存^[10]；非洲豬瘟陽性豬血清購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 主要試劑

PrimeSTARMax DNA Polymerase、限制性核酸內切酶Bam HⅠ和SalⅠ、DNA Ligation Kit均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；羊抗兔IgG-HRP、硫酸卡那霉素溶液、10×PBS緩沖液、溶菌酶、Tween 20購自北京索萊寶科技有限公司；HisTrap HP預裝柱購自Cytiva公司；HRP標記羊抗豬IgG（H+L）購自Bethyl公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；IPTG溶液、即用型氨芐青霉素鈉溶液均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；預染蛋白Marker購自GeneDireX公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒均購自Omega公司。

1.3 兔p30多克隆抗體的制備

取適量純化的pET28a-p30重組蛋白與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑分別進行乳化，蛋白質與佐劑體積比為1∶1，乳化后p30蛋白質量濃度為1 g/L。取3只體重3 kg的普通級新西蘭兔（購自南京市青龍山動物繁殖場），分別皮下分點注射1 mL經弗氏完全佐劑乳化的p30蛋白，首次免疫后14 d和28 d，分別取經弗氏不完全佐劑乳化的p30蛋白，同上進行皮下免疫。首次免疫前7 d和末次免疫后7 d，分別采集兔血，分離出血清，分裝后在-20 ℃條件下保存備用。

1.4 編碼p30蛋白不同區域基因序列的克隆、轉化

按重組質粒pET28a-p30中p30優化編碼基因序列，設計系列引物，分別進行PCR擴增p30蛋白58～101位、101～158位、8～194位氨基酸序列的編碼基因序列，擴增引物序列見表1；隨后將各PCR擴增片段進行膠回收，利用限制性核酸內切酶Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切回收PCR片段，分別以連接酶連接表達載體pET-32a（+），連接產物分別轉化入感受態BL21（DE3），經限制性核酸內切酶Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定陽性重組菌，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將實驗室保存的pET32a-p30（8～101）重組菌以及新構建的表達p30蛋白不同氨基酸序列片段的重組菌pET32-p30（58～101）、pET32-p30（101～158）、pET32-p30（8～194）分別命名為1#、2#、3#、4#。

1.5 蛋白質表達及純化

將4種重組菌進行體外擴大培養，按1%的比例接種至200 mL的LB液體培養基（含50 mg/L氨芐青霉素鈉）中，37 ℃，220 r/min振蕩培養至細菌液OD600值達到0.5左右時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220 r/min繼續振蕩培養4 h，10 000 r/min離心收集菌體，加入10 mL 1×PBS重懸菌體，再加入終濃度為0.2 g/L的溶菌酶，混勻后冰上孵育30 min，以300 W，5 s超聲，10 s間歇的條件，超聲波破碎上述細菌混懸液，10 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀以變性緩沖液（8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸二氫鈉、500 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L咪唑、pH 7.4）溶解，10 000 r/min離心15 min，收集上清液（包涵體蛋白）。收集誘導前菌體蛋白、誘導后菌體超聲上清液、誘導后菌體超聲沉淀樣品各16 μL，加入4 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，處理后樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分析不同重組蛋白的表達形式。收集PBS重懸的各誘導后的菌體，同上處理樣品并進行免疫印跡試驗（Western blot），分析各重組菌誘導蛋白質與His單抗的反應原性。隨后參照HiTrap HP親和層析柱說明書，純化4種重組蛋白，以1×PBS作為緩沖液透析處理純化蛋白質，隨后NanoDrop分析蛋白質含量，調整含量后取適量重組蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.6 ELISA

以包被液（100 mmol/L NaHCO3、46 mmol/L Na2CO3、pH 9.6）將各純化的重組蛋白及硫氧還蛋白分別稀釋至1.0 mg/L和0.1 mg/L，每孔100 μL，分別加入96微孔板中，4 ℃包被過夜；棄去抗原液，用PBST（1×PBS，含0.05% Tween 20）洗滌5次，每孔300 μL，每次10 s，加入PBST（含5%脫脂奶粉）封閉，每孔300 μL，37 ℃孵育2 h；棄去孵育液，同上洗滌，用PBST（含2%脫脂奶粉）分別稀釋p30免疫兔血清或非洲豬瘟陽性豬血清（按體積比1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋），同時設立40倍稀釋的兔免疫p30前血清或ASFV抗體陰性豬血清分別作為陰性對照，每孔100 μL，加入96微孔板，37 ℃孵育30 min，棄去血清，同上洗滌，加入1∶10 000稀釋的HRP標記羊抗兔二抗或HRP標記羊抗豬二抗，每孔100 μL，在37 ℃條件下作用30 min，棄去二抗，同上洗滌，每孔加入50 μL單組分TMB顯色液，37 ℃避光作用10 min，最后加入2 mol/L H2SO4，每孔50 μL，終止反應，用酶標儀讀OD450值，計算樣品OD450 （S-N）值[樣品OD450（S-N）值=樣品OD450-陰性血清OD450]。試驗重復2次，計算平均值。

2 結果與分析

2.1 重組質粒鑒定

提取重組菌1#、2#、3#、4#重組質粒，經Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，均獲得約5 900 bp的pET32a載體片段，同時分別產生282 bp、132 bp、174 bp和561 bp的插入片段，與預期目的片段長度相符，結果見圖1。經測序，各載體中插入堿基序列編碼的多肽氨基酸序列均包含有Pig/HLJ/2018毒株的CP204L蛋白氨基酸序列（GenBank QBH90581.1）。

2.2 重組蛋白氨基酸序列片段誘導表達和鑒定

經過IPTG誘導，pET32a-p30（8～101）、pET32-p30 （58～101）、pET32-p30 （101～158）、pET32-p30 （8～194）分別表達獲得相對分子量32 000、25 000、33 000、50 000的重組蛋白氨基酸序列片段，分別命名為P-1#、P-2#、P-3#、P-4#，SDS-PAGE分析顯示，P-1#和P-3#表達在誘導細菌超聲波破碎的上清液中，P-4#表達在包涵體中，P-2#表達在上清液和包涵體中，但以表達在包涵體中為主（圖2A）。誘導后的4種重組菌，與His單克隆抗體均有對應的特異性反應條帶（圖2B）。

2.3 重組蛋白氨基酸序列片段純化

分別將表達在上清液中的P-1#和P-3#和表達在包涵體中的P-2#和P-4#進行Ni柱純化，SDS-PAGE顯示，獲得4種純化的p30重組蛋白氨基酸序列片段，各相對分子量符合預期（圖3）。

2.4 p30蛋白氨基酸序列不同片段的反應原性

將純化、透析后的4種重組蛋白氨基酸序列片段分別稀釋至1.0 mg/L和0.1 mg/L進行包被，與不同稀釋濃度下的ASFV陽性豬血清或p30免疫兔血清進行ELISA反應，結果顯示2種蛋白質濃度包被下P-1#和P-4#，與40倍稀釋ASFV陽性豬血清均有較好的免疫反應，隨著血清稀釋度增加，其ELISA反應OD450（S-N）值均顯示出下降趨勢；2種蛋白質濃度包被的P-2#，與40倍稀釋的ASFV陽性豬血清ELISA反應OD450（S-N）值均較低，提示P-2#的抗原較弱。

由圖4可見，4種重組蛋白氨基酸序列片段以1.0 mg/L進行包被，與系列稀釋的p30免疫兔血清均有較好的免疫反應，隨著血清稀釋度增加，P-2#和P-3#的ELISA反應OD450（S-N）值略有下降；當蛋白質包被濃度為0.1 mg/L時，P-2#與p30免疫兔血清反應最弱，隨著血清稀釋度增加，P-3#的ELISA反應OD450（S-N）值顯示出下降趨勢，而P-1#和P-4#與系列稀釋的p30免疫兔血清均保持較好的免疫反應，由此可見P-2#和P-3#誘導的兔多抗效價弱于P-1#和P-4#，硫氧還蛋白（Trx）與ASFV陽性豬血清和p30免疫兔血清均無反應。

3 討論

非洲豬瘟是一種高傳染性動物疫病，家豬感染后死亡率最高可達100%，20世紀90年代末，其流行僅限于非洲大陸和歐洲部分地區，2007年高加索地區出現非洲豬瘟疫情，加速了其在歐洲和亞洲的流行^[11-12]，現今ASFV基因Ⅱ毒株已經傳至世界各大洲^[13]。目前，由于尚未有成熟的非洲豬瘟疫苗，對于該病的防控依賴于主動監測，ASFV可編碼接近200種結構蛋白和非結構蛋白，其中結構蛋白p30分布于病毒囊膜的內膜，是ASFV主要的免疫原性蛋白之一，p30和p54的嵌合蛋白可產生中和性抗體^[14]，p30抗體對病毒內化有一定的抑制作用^[15]，因此較多診斷試劑和亞單位疫苗的研制均將p30蛋白列為重要的研究靶標。

通常以單克隆抗體來獲取p30蛋白抗原信息，目前已制備出多株p30單克隆抗體，同時對p30蛋白的表位有了進一步認識^[16-17]。本研究通過對p30蛋白氨基酸序列進行分片段原核表達，直接分析ASFV陽性豬血清和p30免疫兔血清與不同p30蛋白氨基酸序列片段的反應原性，結果顯示P-2#與p30免疫兔血清有免疫反應，但與ASFV陽性豬血清反應較弱，表明p30蛋白氨基酸序列中第58～101位片段的反應原性弱，而該片段內已被證實含有p30單克隆抗體識別的抗原表位（61～93 aa）^[18]。有研究以甲病毒表達的關聯片段（61～110 aa）2次免疫10頭豬，不能有效激活抗體產生（轉陽比例1/10），以ASFV弱毒株OURT88/3繼續攻毒后，才激活了抗體產生（轉陽比例9/10）^[19]。綜上，該片段存在的抗原表位（61～93 aa）可能不是p30的優勢抗原表位，其抗體的產生需要該片段抗原的多次刺激。此外，甲病毒表達的p30的不同氨基酸片段，發現p30（1～100 aa）與ASFV弱毒株OURT88/3感染血清的反應原性最弱，同時推測p30蛋白的優勢抗原區域集中在101～150 aa^[19]，而本研究以大腸桿菌原核表達p30蛋白不同氨基酸片段，發現P-1#（8～101 aa）與ASFV陽性豬血清的反應原性高于P-3#（101～158 aa），上述結果差異是否與蛋白質表達系統差異或者血清來源差異有關，值得后續進一步研究。

原核表達系統表達p30全長蛋白，用于建立ASFV抗體檢測方法已見多次報道^[20-21]，但多數獲得的蛋白質是以包涵體形式表達，盡管通過蛋白質復性可恢復部分活性，但復性效率較低。本研究通過大腸桿菌表達系統表達了p30蛋白氨基酸序列系列片段，其中P-1#（8～101 aa）和P-3#（101～158 aa）均是可溶性表達，同時P-1#（8～101 aa）能夠與ASFV陽性豬血清和p30免疫兔血清有較好的反應原性，僅次于包涵體表達的P-4#（8～194 aa），結果表明P-1#（8～101 aa）可用于后續ASFV診斷候選靶抗原。此外，研制非洲豬瘟診斷試劑時，由于制備ASFV感染或免疫陽性豬血清有條件限制，常以蛋白質免疫豬或其他種屬動物制備陽性血清替代，本研究中1.0 mg/L包被的P-2#與ASFV陽性豬血清反應較弱，但與p30免疫兔血清有較明顯的免疫反應，表示經過抗原的多次免疫刺激可能存在較弱抗原性區域反應性提升的現象，因此建議篩選診斷優勢抗原和優化診斷方法時，應慎重選用多次免疫血清去評價。

4 結論

本研究分析了非洲豬瘟病毒p30蛋白不同氨基酸序列片段反應原性，發現p30蛋白的8～101 aa氨基酸序列片段可在大腸桿菌表達系統中實現可溶性表達，同時該氨基酸序列為p30潛在抗原優勢區域。

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（責任編輯：黃克玲）