基于網絡藥理學和分子對接探討厚樸主要成分抗乳腺癌的分子機制

摘要：目的" 基于網絡藥理學和分子對接技術，探究中藥厚樸主要成分抑制乳腺癌的分子機制。方法" 通過數據庫篩選厚樸有效成分及其靶點，并檢索乳腺癌相關靶點，對靶點取交集。運用STRING平臺構建厚樸抗乳腺癌基因PPI網絡圖，Cytoscape軟件篩選核心靶點， 使用DAVID數據庫對20個核心靶點基因進行GO和 KEGG富集分析。利用AutoDock Vina軟件將關鍵靶點基因與厚樸2個有效成分進行分子對接，PyMOL軟件對接結果進行可視化。結果" 篩選得到厚樸中2個主要成分厚樸酚與和厚樸酚，構建蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）將結果導入Cytoscape軟件中篩選出厚樸抗乳腺癌的20個核心基因，其中ESR1、ESR2、NCOA3、MED1與厚樸酚、和厚樸酚具有相關性，確定為關鍵靶點基因；選用20個核心基因進行GO和KEGG富集分析，其中與4個關鍵靶點基因相關的結果有：GO分析顯示與RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、核染色質、轉錄因子結合等相關；KEGG分析顯示主要與內分泌的阻力、雌激素信號通路、癌癥通路、乳腺癌等相關；分子對接結果顯示這4個基因與厚樸酚、和厚樸酚具有很好的結合活性。結論" 厚樸主要成分厚樸酚與和厚樸酚可通過作用于ESR1、ESR2、NCOA3、MED1基因發揮抗乳腺癌作用，有可能作為厚樸治療乳腺癌的潛在靶點。

關鍵詞：網絡藥理學；分子對接；厚樸；乳腺癌；分子機制

中圖分類號：R285；R736.3" " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " nbsp; " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.14.003

文章編號：1006-1959（2024）14-0012-07

Molecular Mechanism of the Main Components of Cortex Magnoliae Officinalis in Anti-breast

Cancer Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

DU Juan1，SHAO Bing2，PAN Wang1，MA Jia-yi2，FU Xiu2，HAN Xiao1

（1.School of Pharmacy，Beihua University，Jilin 132013，Jilin，China;

2.School of Public Health，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：Objective" To explore the molecular mechanism of the main components of Cortex Magnoliae Officinalis in inhibiting breast cancer based on network pharmacology and molecular docking technology.Methods" The effective components and targets of Cortex Magnoliae Officinalis were screened by database， and the related targets of breast cancer were retrieved， and the targets were intersected. The STRING platform was used to construct the PPI network diagram of Cortex Magnoliae Officinalis anti-breast cancer gene. Cytoscape software was used to screen the core targets. DAVID database was used to analyze the GO and KEGG enrichment of 20 core target genes. AutoDock Vina software was used to dock the key target genes with the two effective components of Cortex Magnoliae Officinalis， and the docking results were visualized by PyMOL software.Results" Two main components in Cortex Magnoliae Officinalis were screened， which were magnolol and honokiol. By constructing protein-protein interaction network （PPI）， the results were imported into Cytoscape software to screen out 20 core genes of Cortex Magnoliae Officinalis anti-breast cancer. Among them， ESR1， ESR2， NCOA3 and MED1 were correlated with magnolol and honokiol， and were identified as key target genes. Twenty core genes were selected for GO and KEGG enrichment analysis. Among them， the results related to four key target genes were as follows： GO analysis showed that it was related to the positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription， nuclear chromatin， transcription factor binding， etc.; KEGG analysis showed that it was mainly related to endocrine resistance， estrogen signaling pathway， cancer pathway， breast cancer and so on. Molecular docking results showed that these four genes had good binding activity with magnolol and honokiol.Conclusion" Magnolol and honokiol， the main components of Cortex Magnoliae Officinalis， can exert anti-breast cancer effects by acting on ESR1， ESR2， NCOA3 and MED1 genes， which may be used as potential targets for the treatment of breast cancer.

Key words：Network pharmacology;Molecular docking;Cortex Magnoliae Officinalis;Breast cancer;Molecular mechanism

乳腺癌是發生在乳腺上皮細胞的惡性腫瘤。據2020年全球癌癥統計數據顯示，乳腺癌的發病率已在全球大多數國家排名第一位，僅2020年，全球乳腺癌新發患者超過肺癌，約230萬病例（11.7%），死亡數約68.5萬[1]。目前乳腺癌治療以手術為主，根據病情分期，加以放化療和免疫治療、靶向治療。這些治療手段可以大大提高生存率，但是對患者后期的生活質量有著嚴重影響，同時還要承擔巨額費用，因此探索成本低、不良反應少的中藥治療乳腺癌具有長遠意義。在中醫中，乳腺癌被稱為“乳巖”“乳石癰”等[2]，中醫藥治療原則注重調節整體平衡，相對減輕手術等治療后的副作用[3]。隨著中醫不斷的進步和發展，在乳腺癌治療過程中，中醫藥治療已成為標準治療中的重要輔助手段[4，5]。厚樸為木蘭科木蘭屬厚樸或者凹葉厚樸干燥的干皮、根皮和枝皮。厚樸味苦、辛，性溫，具有燥濕消痰，下氣除滿的功效。厚樸的主要成分為厚樸酚與和厚樸酚等酚類成分，少量的生物堿類、揮發油、多糖類成分[6]。現代研究表明[7]，厚樸酚與和厚樸酚對腫瘤具有抑制作用，其研究受到廣泛關注。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術，研究厚樸主要成分抗乳腺癌的分子機制，為厚樸的臨床開發應用提供參考。

1資料與方法

1.1厚樸有效成分和作用靶點篩選" 通過BATMAN-TCM數據庫篩選厚樸有效成分和作用靶點。在Select input type中選擇Herb or Herb list，輸入Houpo，并設置Score dutoff≥30，Adjusted P-value＜0.05進行篩選。在TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacol）中藥系統藥理學數據庫與分析平臺中，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選厚樸的有效成分和作用靶點。

1.2乳腺癌相關靶點篩選" 利用GeneCards數據庫、網上《人類孟德爾遺傳》數據庫-OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）、PharmGKB數據庫（Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base）、TTD數據庫（Therapeutic Target Database）和DrugBank Online數據庫中，分別輸入“breast cancer”，檢索得到與乳腺癌疾病相關的作用靶點信息。

1.3厚樸作用靶點與乳腺癌相關靶點基因整合" 運用BioVenn網站，在“選擇文件”處分別導入厚樸靶點和乳腺癌疾病靶點，選擇結果輸出格式后，結果以韋恩圖導出，得到厚樸靶點和乳腺癌疾病靶點的交集，即厚樸抗乳腺癌的作用靶點。

1.4厚樸成分與乳腺癌靶點基因網絡調控" 運用Perl軟件，將厚樸有效成分通過相對應的靶基因，與乳腺癌靶點基因進行網絡構建。將得到的厚樸成分-靶點文件、基因類型文件等導入Cytoscape3.8.0，繪制厚樸成分與靶點基因相互映射的網絡圖。靶點基因面積越大，與其相對應的成分越多；藥物成分與其相連線路越多，說明其對應的靶點基因越多。

1.5蛋白-蛋白相互作用網絡的構建（PPI）" 將厚樸抗乳腺癌的潛在作用靶點基因輸入到STRING數據庫（https：//cn.sring-db.org/）中，物種選擇Homo sapiens，將所得數據以tsv格式導出到Excel表格，構建蛋白-蛋白質互作網絡。將STRING數據庫所得文件導入Cytoscape軟件，利用MCODE插件進行分析和打分篩選，再通過R軟件平臺，對得到的基因進行中位值過濾，得到厚樸與乳腺癌的網絡核心基因。

1.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析" 將1.5中得到厚樸抗乳腺癌作用的20個核心靶點基因導入到DAVID數據庫（http：//david.ncifcrf.gov/），利用DAVID數據庫進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，進一步闡明厚樸抗乳腺癌相關機制。在微生信網站將GO和KEGG富集結果繪制成柱狀圖和氣泡圖。

1.7分子對接" 選擇1.5中PPI網絡關鍵靶點基因與厚樸有效成分進行分子對接，驗證兩者之間的結合活性。運用PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索厚樸有效成分的3D結構，PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）輸入核心基因，下載蛋白受體3D結構文件，再利用PyMOL軟件刪除蛋白受體3D結構中的水分子和小分子配體。運用AutoDock Vina軟件對小分子配體和蛋白受體進行加氫后進行分子對接，用結合自由能高低來作為靶點和有效成分結合程度標準，自由能越低，結合越穩定。最后，用PyMOL軟件將分子對接結果進行可視化展示。

2結果

2.1厚樸有效成分和作用靶點" 分別運用BATMAN-TCM數據庫和TCMSP數據庫，得到厚樸44個有效成分，920個作用靶點，其中15種主要活性成分信息見表1。

2.2乳腺癌相關基因整合" 通過GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD和DrugBank數據庫分別檢索得到與乳腺癌疾病相關的作用靶點基因，其中GeneCards數據庫檢索12 761個靶基因，OMIM數據庫檢索113個靶基因，PharmGKB數據庫檢索296個靶基因，TTD數據庫檢索172個靶基因，DrugBank數據庫檢索163個靶基因。利用韋恩圖，刪除5個數據庫中重復的基因，得到乳腺癌的作用靶點取并集，共得到12 878個作用靶點，見圖1。

2.3厚樸和乳腺癌相關靶點基因整合" 將厚樸920個作用靶點和乳腺癌12 878個靶點基因繪制韋恩圖，得到694個交集基因，見圖2。

2.4厚樸成分-乳腺癌-靶點網絡的構建" 將厚樸的44種有效成分和694個靶點基因，利用Cytoscape軟件構建厚樸有效成分-靶點基因的調控網絡圖，并計算節點的度值（Degree），節點越大，表示Degree值越大，且厚樸酚與和厚樸酚在厚樸中含量高，篩選出厚樸的主要成分為厚樸酚與和厚樸酚。厚樸同一有效成分對應多個靶點基因，同時多個有效成分也可對應同一靶點基因，這種對應關系體現出厚樸多成分和多靶點抗乳腺癌的作用機制。

2.5 PPI網絡構建及核心靶點基因篩選" 運用STRING數據庫對694個基因進行PPI網絡分析，設置minimum required interaction score為0.95，得到PPI網絡圖有406個節點，804條邊。將數據導入Cytoscape軟件篩選，由Degree值進行打分處理后，再用R軟件對Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC和Network進行中位值過濾，得到86個節點，296條邊，見圖3。再次篩選，得到20個節點，79條邊，為厚樸抗乳腺癌的網絡核心基因。由圖可見，20個核心基因包括EGFR、PPARG、CTNNB1、JUN、NCOA3、PIK3R1、NCOA2、NCOA1、IL6、SRC、FOS、ESR1、HIF1A、RXRA、MAPK1、TNF、MED1、AR、PPARA、ESR2，其中與厚樸主要成分厚樸酚與和厚樸酚相關的基因有ESR1、ESR2、 MED1 和NCOA3，確定為關鍵靶點基因。

2.6 GO和KEGG通路富集分析結果" 運用DAVID數據庫，將厚樸抑制乳腺癌的20個核心靶點基因進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結果分為三部分，生物過程（BP）得到212個條目、細胞組成（CC）得到21個條目、分子功能（MF）得到56個條目，按P-Value值大小繪制柱狀圖，見圖4～圖6，柱子高低代表富集在此過程的基因數目多少。與BP相關的有轉錄正調控并DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對pri-miRNA轉錄的正向調節、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄負調控等；與CC相關的有核染色質、高分子配合物、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、轉錄、核原生質等；與MF相關的有轉錄因子結合、酶結合、配體依賴性核受體結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性并配體激活的序列特異性DNA結合配體依賴性核受體結合、染色質綁定、雌激素受體結合等。KEGG通路富集分析結果，得到113條信號通路，按P-Value值大小繪制氣泡圖（圖7），氣泡大小代表富集在此通路的基因數目多少。其KEGG顯著通路有內分泌的阻力、雌激素信號通路、癌癥通路、乳腺癌等。

2.7分子對接結果分析" 為確定厚樸主要成分與關鍵靶點之間的結合活性，將厚樸主要成分厚樸酚、和厚樸酚與4個關鍵靶點基因ESR1、ESR2、MED1、NCOA3進行分子對接驗證，見表2。結果顯示，厚樸酚與ESR1結合自由能為-7.6 kcal/mol、與ESR2結合自由能為-8.1 kcal/mol、與MED1結合自由能為-8.0 kcal/mol、與NCOA3 結合自由能為-8.1 kcal/mol；和厚樸酚與ESR1結合自由能為-7.2 kcal/mol、與ESR2結合自由能為-7.9 kcal/mol、與MED1結合自由能為-8.2 kcal/mol、與NCOA3 結合自由能為-8.1 kcal/mol。全部自由能均小于-7.0 kcal/mol，有較好的結合活性。用PyMOL軟件對分子對接結果進行可視化展示，見圖8，結果顯示對接位置較好。

3討論

厚樸已經被證實具有抗腫瘤的作用，其中抗乳腺癌作用機制也備受研究者關注。厚樸酚與和厚樸酚是從厚樸中提取得到的酚類化合物，為同分異構體，是厚樸的主要活性成分，其含量已經作為厚樸中藥材重要的質量標準，且藥理活性廣泛。厚樸酚有抗菌、抗氧化和抗炎等作用，近幾年其抗腫瘤作用成為研究熱點，尤其在抗消化系統腫瘤和抗肺部腫瘤方面已經被驗證，在抗白血病、淋巴瘤、肉瘤、皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、鼻咽癌等腫瘤細胞方面有相關報道[8，9]。和厚樸酚也具有抗氧化和抗菌作用，在抗乳腺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌等腫瘤細胞方面也有相關報道[10，11]。厚樸酚與和厚樸酚毒性很小，且對正常細胞和其他臟器沒有明顯影響，因此厚樸酚與和厚樸酚用于抗乳腺癌具有潛在應用價值。

本研究顯示，在厚樸抗乳腺癌的20個核心靶點中，只有ESR1、ESR2、MED1、NCOA3這4個基因與厚樸酚、和厚樸酚具有相關性，因此將其作為關鍵靶點基因。ESR1基因是一種雌激素受體和配體激活的轉錄因子，調節雌激素誘導基因轉錄，在生長、代謝、妊娠、性發育和其他生殖功能中起到重要作用，在乳腺癌、骨質疏松癥和子宮內膜癌中發揮關鍵作用，且ESR1突變是引起乳腺癌內分泌治療耐藥的原因之一[12]。ESR2基因與ESR1同為雌激素受體和核受體轉錄因子，與17β-雌二醇或其他配體結合后，形成同源或異源二聚體，與特定DNA序列相互作用以激活轉錄，主要抑制其他雌激素類受體活性，在乳腺癌的預防和控制等方面發揮重要功能[13]。MED1內質網共激活因子，由識別DNA中的轉錄增強子位點因素觸發轉錄激活，指導RNA聚合酶Ⅱ的裝置轉錄起始，是一種獨特的、組織特異性輔助因子，可介導乳腺癌的轉移、治療抗雌激素抵抗，還可以調節p53所依賴的細胞凋亡，影響脂肪形成，且有自寡聚的能力[14]。NCOA3是一種核受體的輔激活子，具有和核激素受體作用，能夠增強轉錄激活功能，有組蛋白乙酰轉移酶的活性，可以激活基因轉錄[15]。NCOA3的過表達，在乳腺癌、肝癌、胰腺癌中具有抑制腫瘤的生長、轉移、化療耐藥性和侵襲等過程[16]。

本研究中KEGG富集分析結果顯示，厚樸抗乳腺癌得到113條通路，主要通路涉及內分泌的阻力、雌激素信號通路、癌癥通路、乳腺癌等。研究表明，雌激素信號通路對正常乳腺細胞的生長、發育和凋亡等有很大影響，如果通路信號紊亂則影響ESR1、ESR2、MED1、NCOA3基因表達，導致乳腺癌細胞增殖、凋亡等生物過程失衡，引發乳腺癌，因此調控雌激素信號通路也是抑制乳腺癌的關鍵，為后期研究提供方向[17，18]。內分泌阻力通路中，乳腺癌患者ESR1基因的LBD位點產生復發性突變，一般采用內分泌療法；ESR1融合蛋白在乳腺癌中富集，產生內分泌抵抗，進而形成耐藥[19]；沉默子SALL2與DNA啟動子結合與否，上調或下調ESR1與PTEN的轉錄水平，同樣會導致內分泌治療耐藥。另外，核因子κB促進組蛋白一線轉移酶p300與 NCOA3形成轉錄復合體，此復合體啟動并激活抗凋亡基因BCL2、MCL1、BCL2A1、BCL2L2等表達，導致細胞不凋亡進而致癌，在雌激素受體陽性乳腺癌細胞中過表達，阻斷或靶向NCOA3也是治療雌激素受體陽性乳腺癌的新方向[20]。MED1也與抗內分泌治療相關，是抗雌激素治療抵抗和內質網功能的關鍵介質，是乳腺癌治療的新靶點[21]。

總之，中藥具有多成分、多靶點、多效應的治療優點。本研究通過網絡藥理學有效整合厚樸主要活性成分，并通過數據庫查找乳腺癌靶點基因，篩選出厚樸抗乳腺癌2個主要活性成分厚樸酚與和厚樸酚以及4個關鍵靶點基因ESR1、ESR2、MED1、NCOA3。利用分子對接技術驗證了主要成分與關鍵靶點基因之間的結合自由能，顯示結合狀態較好，GO和KEGG富集分析結果顯示厚樸酚與和厚樸酚可能通過內分泌的阻力、雌激素信號通路、癌癥通路、乳腺癌等生物學通路發揮抗乳腺癌作用。

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收稿日期：2023-08-10；修回日期：2023-08-23

編輯/成森