反向點(diǎn)雜交技術(shù)聯(lián)合血常規(guī)檢測(cè)對(duì)β-地貧基因的診斷價(jià)值

摘要：目的 "研究反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)聯(lián)合血常規(guī)檢測(cè)對(duì)β-地貧基因的診斷價(jià)值。方法 "選取2021年1月-2023年3月我院收治的60例β-地中海貧血患者為研究組，并選取同期在我院體檢的健康人群60名為對(duì)照組，均進(jìn)行血常規(guī)和RDB技術(shù)檢測(cè)。比較兩組人群血常規(guī)指標(biāo)[紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）]，ROC曲線分析不同檢查方法（血常規(guī)、RDB、血常規(guī)+RDB）診斷β-地貧基因的效能。結(jié)果 "研究組RDW大于對(duì)照組，MCV、MCHC、MCH低于對(duì)照組（P＜0.05）；ROC曲線顯示，血常規(guī)+RDB檢查對(duì)β-地貧基因檢出率為97.86%，高于血常規(guī)、RDB單獨(dú)檢測(cè)（P＜0.05），而血常規(guī)與RDB檢測(cè)對(duì)β-地貧基因檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 "RDB技術(shù)聯(lián)合血常規(guī)檢測(cè)可提高對(duì)β-地貧基因的診斷價(jià)值，一定程度減小漏診、誤診情況，為臨床診治β-地中海貧血提供更可靠的參考，可作為臨床篩查診斷β-地貧基因的首選方法。

關(guān)鍵詞：反向點(diǎn)雜交技術(shù)；血常規(guī)檢測(cè)；β-地貧基因

中圖分類號(hào)：R446 " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.21.034

文章編號(hào)：1006-1959（2024）21-0146-04

Diagnostic Value of Reverse Dot Blot Combined with Blood Routine Test

for β-thalassemia Gene

LIN Qing，WEN Xiaojing，LAI Youmei，ZHONG Hongwen

（Laboratory Department of Ganxian District People's Hospital，Ganzhou 341100，Jiangxi，China）

Abstract：Objective "To study the diagnostic value of reverse dot blot （RDB） combined with blood routine test for β-thalassemia gene.Methods "A total of 60 patients with β-thalassemia admitted to our hospital from January 2021 to March 2023 were selected as the study group， and 60 healthy people who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The blood routine indexes [red blood cell distribution width （RDW）， red blood cell volume （MCV）， red blood cell hemoglobin concentration （MCHC）， red blood cell hemoglobin （MCH）] were compared between the two groups. ROC curve was used to analyze the efficacy of different examination methods （blood routine， RDB， blood routine+RDB） in the diagnosis of β-thalassemia gene.Results "RDW in the study group was higher than that in the control group， MCV， MCHC and MCH were lower than those in the control group （Plt;0.05）. ROC curve showed that the detection rate of β-thalassemia gene by blood routine+RDB was 97.86%， which was higher than that of blood routine and RDB alone （Plt;0.05）， while there was no significant difference in the detection rate of β-thalassemia gene between blood routine and RDB （Pgt;0.05）.Conclusion "RDB technology combined with blood routine test can improve the diagnostic value of β-thalassemia gene， reduce missed diagnosis and misdiagnosis to a certain extent， provide a more reliable reference for clinical diagnosis and treatment of β-thalassemia， and can be used as the preferred method for clinical screening and diagnosis of β-thalassemia gene.

Key words：Reverse dot blot;Blood routine test;β-thalassemia gene

β-地中海貧血是β鏈合成部分或完全抑制引起的溶血性貧血，主要是以基因突變?yōu)橹鳎俨糠质腔蛉笔В刂泻Ｘ氀颊卟煌幕蛭稽c(diǎn)突變引起不同的臨床特點(diǎn)，導(dǎo)致地中海貧血的臨床表現(xiàn)不同，從無貧血癥狀到極重度貧血不等，并引起多種并發(fā)癥[1，2]。單獨(dú)使用血常規(guī)檢測(cè)對(duì)β-地中海貧血檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)一部分的遺漏，并且不能對(duì)β-地中海貧血的基因進(jìn)行分型[3]。反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)能夠通過位于寡核苷酸探針中部的基因（或序列）特異性堿基與靶序列DNA的堿基配對(duì)和嚴(yán)格條件下洗膜來達(dá)到檢測(cè)基因中少數(shù)堿基變化（少至單個(gè)堿基）的目的[4，5]。基于此，本研究結(jié)合2021年1月-2023年3月我院收治的60例β-地中海貧血患者臨床資料，探究RDB技術(shù)聯(lián)合血常規(guī)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)β-地貧基因的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 "選取2021年1月-2023年3月贛縣區(qū)人民醫(yī)院收治的60例β-地中海貧血患者為研究組，并選取同期在我院體檢健康人群60名為對(duì)照組。研究組中男22例，女38例；年齡3～49歲，平均年齡（26.39±9.44）歲。對(duì)照組男20名，女40名；年齡4～50歲，平均年齡（27.01±10.20）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），臨床可比。所有納入對(duì)象均對(duì)研究知情，且自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) "納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)中對(duì)β-地中海貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②研究組患者均在我院進(jìn)行治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心功能不全，肝、腎功能障礙；②排除其他類型地中海貧血者。

1.3方法 "抽取兩組人群空腹肘靜脈血5 ml，放置于-20 ℃環(huán)境下保存待用。血常規(guī)檢測(cè)：使用全自動(dòng)細(xì)胞分析儀（邁瑞6900、邁瑞5390、邁瑞5180）對(duì)人群紅細(xì)胞情況進(jìn)行檢測(cè)，其中包括紅細(xì)胞分布寬度、紅細(xì)胞體積、紅細(xì)胞血紅蛋白濃度以及紅細(xì)胞血紅蛋白量[7]。RDB技術(shù)：首先使用柱式分離法提取DNA[8]，在洗滌液W1中加入5.5 ml無水乙醇，打勾標(biāo)記之后混勻待用，在洗滌液W2加入19 ml無水乙醇，打勾標(biāo)記混勻待用，往編好號(hào)的1.5 ml離心管之內(nèi)加入500 μl裂解液LB，隨后加入200 μl抗凝全血進(jìn)行短暫離心；隨后加入100 ul沉淀液PB，充分振蕩混勻，時(shí)間不少于20 s，混勻后進(jìn)行離心（12 000 rpm離心5 min），離心之后在DNA結(jié)合柱套進(jìn)2 ml收集管，小心轉(zhuǎn)移上清液至結(jié)合柱凹縫下方，再次進(jìn)行離心（12 000 rpm離心30 s），離心后加入500 μl洗滌劑W1，再進(jìn)行離心，隨后進(jìn)行兩遍洗滌劑W2洗滌，洗滌完之后小心取下收集管，丟棄濾液之后結(jié)合柱重新套入2 ml收集管進(jìn)行干燥2 min，干燥之后小心取下結(jié)合柱，套進(jìn)干凈的1.5 ml離心管之中，加入150 μl洗脫液EB至膜中心之后室溫放置1 min，放置后再次進(jìn)行離心洗脫（12000 rpm離心60 s），1.5 ml離心管內(nèi)液體即為PCR模板，保存?zhèn)溆谩Ｈ》磻?yīng)管Ⅰ和Ⅱ（內(nèi)含-PCR Mix-1，23 μl）各1支，管蓋上編號(hào)，隨后進(jìn)行5000 rpm離心2 s，離心之后將2 μl待測(cè)DNA加到PCR管內(nèi)在5000 rpm條件下離心2 s，離心后放置PCR儀器，按照程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增之后進(jìn)行雜交、顯色，首先進(jìn)行備膜，膜條進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)之后依次放入15 ml離心管，隨后進(jìn)行加液，將6 ml左右的A液以及對(duì)應(yīng)編號(hào)的PCR產(chǎn)物加入離心管內(nèi)（兩管產(chǎn)物），沸水浴10 min，沸水浴之后進(jìn)行雜交，取出離心管之后放入雜交箱內(nèi)進(jìn)行雜交（43 ℃下進(jìn)行1.5～4 h雜交），結(jié)束之后進(jìn)行孵育，將膜條放入孵育液（A液∶POD=2000：1）室內(nèi)進(jìn)行孵育30 min，孵育之后將膜條放入A液，進(jìn)行搖洗2次（5 min/次），搖洗之后進(jìn)行洗膜，洗膜之后進(jìn)行顯色，現(xiàn)配顯色液（19 ml C液+1 ml TMB+2 μl 30%H2O2）/10張膜條，實(shí)施觀察3～4 min之后進(jìn)行判讀，使用純凈水或者離子水漂洗兩次后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀之后在4 ℃環(huán)境下保存膜條。

1.4觀察指標(biāo) "比較兩組血常規(guī)指標(biāo)[細(xì)胞分布寬度（RDW）、紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）]，不同檢查方法（血常規(guī)、RDB、血常規(guī)+RDB）ROC曲線分析診斷效能。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 "采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 24.0版本對(duì)本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用（x±s）表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用？字2檢驗(yàn)，P＜0.05說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組血常規(guī)指標(biāo)比較 "研究組RDW大于對(duì)照組，MCV、MCHC、MCH均低于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

2.2不同檢測(cè)方法對(duì)β-地貧基因的診斷效能 "依據(jù)ROC曲線分析（見圖1），血常規(guī)+RDB檢查對(duì)β-地貧基因檢出率為97.86%，高于血常規(guī)、RDB單獨(dú)檢測(cè)（P＜0.05），但血常規(guī)單獨(dú)檢出率（86.34%）與RDB單獨(dú)檢出率（88.91%）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3討論

β-地貧基因是地中海貧血（Thalassemia）中的一種基因類型，它是一種遺傳性溶血性貧血。這種疾病是由于編碼β珠蛋白的基因發(fā)生變異引起的[9，10]。在臨床上，帶有α基因、β基因缺陷的地貧患者的癥狀與其拷貝數(shù)丟失程度呈正相關(guān)，拷貝數(shù)丟失越多，癥狀越嚴(yán)重，甚至可能導(dǎo)致死亡[11]。β-地貧基因的檢測(cè)對(duì)于預(yù)防和治療地中海貧血具有重要意義[12]。通過檢測(cè)β-地貧基因，可以確定個(gè)體是否攜帶該基因，以及基因變異的類型和程度，從而為預(yù)防和治療該病提供依據(jù)[13]。血常規(guī)檢測(cè)是近年來臨床常用的檢測(cè)β-地中海貧血的手段，亦是對(duì)血液檢測(cè)的一種手段，但是診斷準(zhǔn)確性不高，不能對(duì)基因進(jìn)行檢測(cè)[14]。因此，臨床提出RDB技術(shù)聯(lián)合血常規(guī)檢測(cè)，以提高對(duì)β-地貧基因的診斷。但是血常規(guī)+RDB聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值尚未完全明確，還需要臨床進(jìn)一步探究證實(shí)[15]。

本研究結(jié)果顯示，研究組RDW大于對(duì)照組，MCV、MCHC、MCH均低于對(duì)照組（P＜0.05），提示β-地貧基因患者以上血常規(guī)指標(biāo)存在異常，與健康人群存在差異，臨床可將以上指標(biāo)作為鑒別、診斷、篩查該病的指標(biāo)。分析認(rèn)為，可能是因?yàn)棣?地貧基因患者調(diào)控珠蛋白生成的基因突變或缺失，引起組成紅細(xì)胞的α珠蛋白鏈和β珠蛋白鏈合成比例失衡，從而造成紅細(xì)胞壽命縮短，進(jìn)而造成MCV、MCHC、MCH降低，RDW增大[16，17]。因此，臨床通過定期檢查、監(jiān)測(cè)以上指標(biāo)，進(jìn)行β-地貧基因診斷或監(jiān)測(cè)病情進(jìn)展[18]。同時(shí)顯示，依據(jù)ROC曲線分析，血常規(guī)+RDB檢查對(duì)β-地貧基因檢出率高于血常規(guī)、RDB單獨(dú)檢測(cè)（P＜0.05），但血常規(guī)單獨(dú)檢出率與RDB單獨(dú)檢出率基本一致（P＞0.05），提示RDB檢測(cè)對(duì)β-地貧基因的診斷價(jià)值與血常規(guī)基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是從本次研究數(shù)據(jù)觀察，RDB檢出率略高于血常規(guī)。同時(shí)，血常規(guī)+RDB檢查可提高對(duì)β-地貧基因的診斷效能，靈敏度提高至為97.86%。因此，臨床對(duì)β-地貧基因診斷，建議采用血常規(guī)+RDB檢測(cè)，以提高診斷的準(zhǔn)確性，以降低漏診或誤診率。究其原因，可能是因?yàn)檠Ｒ?guī)+RDB檢查，互相補(bǔ)充，互相促進(jìn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)血液和基因的共同檢測(cè)，從而提高檢出率，為臨床診斷和治療提供較好的價(jià)值[19]。

綜上所述，RDB技術(shù)聯(lián)合血常規(guī)檢測(cè)可提高β-地貧基因的診斷準(zhǔn)確性和靈敏度，為此類患者提供可靠的診斷和治療依據(jù)，值得臨床加以應(yīng)用。

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收稿日期：2023-12-25；修回日期：2024-01-06

編輯/成森