中風停顆粒對急性腦梗死大鼠NLRP3炎癥小體及MMP-9、血管內皮生長因子A、表皮生長因子表達的影響

摘要" 目的：探討中風停顆粒對急性腦梗死（ACI）大鼠核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、血管內皮生長因子A（VEGF-A）及表皮生長因子（EGF）表達的影響。方法：將60只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組和中藥組，每組20只，中藥組每只大鼠每次給予中風停顆粒0.51 mL/100 g，每日灌胃2次；空白對照組、模型組每只大鼠每次給予生理鹽水0.51 mL/100 g，每日灌胃2次。連續干預7 d取材。以大腦中動脈線栓法建立大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠模型，采用Zea-longa 5分法評估大鼠神經功能，蛋白質印跡法檢測大鼠腦組織NLRP3表達，酶聯免疫吸附測定法檢測血漿MMP-9、VEGF-A、EGF表達。結果：與模型組比較，中藥組大鼠神經功能評分降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，模型組、中藥組大鼠腦組織NLRP3表達增強（P＜0.05），血漿MMP-9、VEGF-A水平升高（P＜0.01），EGF水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，中風停顆粒組大鼠腦組織NLRP3表達水平降低（P＜0.05），血漿VEGF-A、EGF水平升高（P＜0.01），MMP-9水平降低（P＜0.01）。結論：中風停顆粒可抑制ACI大鼠NLRP3炎癥小體表達水平，減輕炎癥反應，改善MMP-9、VEGF-A、EGF表達。

關鍵詞" 急性腦梗死；中風停顆粒；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族蛋白3； 基質金屬蛋白酶9；血管內皮生長因子A；表皮生長因子；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.23.011

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）嚴重危害人類的健康，具有較高的發病率、致死率、致殘率和復發率［1］。中國腦卒中疾病負擔研究顯示，2020年我國腦梗死的患病率為2.6%，年發病率為505.2/10萬，年死亡率為343.4/10萬，其中缺血性腦卒中占所有腦卒中的86.8%［2］。研究表明，炎癥反應與ACI發生密切相關，隨著溶栓、動脈取栓等血管再通技術不斷發展，腦卒中后再灌注治療成為ACI重要的治療措施，繼發的血管再灌注損傷也伴隨著更劇烈的炎癥反應，炎癥反應影響神經功能缺損的發生發展，抑制炎癥反應能夠促進神經功能恢復［3-4］。故而減輕炎癥反應，抑制炎性因子表達有望成為治療ACI、改善神經功能缺損的重要靶點。ACI屬中醫“中風”范疇，風痰、瘀血痹阻脈絡為中風病急性期核心病機，內風、火熱、痰濕、瘀血為最常見證候要素［5］。中風停顆粒具有息風清火、活血化痰之功效，能夠提高ACI屬風火痰瘀證病人的臨床療效，改善病人神經功能，降低炎性因子［6-7］。本研究通過大腦中動脈線栓法建立ACI大鼠模型，以探討中風停顆粒對ACI大鼠核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體及基質金屬蛋白酶9

基金項目" 第五批全國中醫臨床優秀人才研修項目，編號：國中醫藥人教函〔2022〕1號；山東省中醫藥科技項目（No.M-2023066）

作者單位" 1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院（北京 100020）；2.淄博市中醫醫院（山東淄博 255399）；3.山東中醫藥大學；4.山東省臨沂市中醫醫院

通訊作者" 朱文浩，E-mail：doctorzwh@163.com

引用信息" 董珍宇，朱文浩，黃英俊，等.中風停顆粒對急性腦梗死大鼠NLRP3炎癥小體及MMP-9、血管內皮生長因子A、表皮生長因子表達的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2022，22（23）：4301-4304.

（MMP-9）、血管內皮生長因子A（VEGF-A）及表皮生長因子（EGF）表達的影響，探討中風停顆粒治療ACI的作用機制。

1" 材料與方法

1.1" 實驗動物

無特定病原體動物（SPF）級雄性SD大鼠共60只，6～8周齡，體質量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證編號：SCXK（京）2016-0011。飼養于山東中醫藥大學SPF級動物房。實驗前先適應性飼養1周，溫度（20±2）℃，相對濕度45%～70%，維持明暗每次各12 h交替循環，自由飲水及進食。本研究獲得淄博市中醫醫院醫學倫理委員會批準（2023-倫審-004）。

1.2" 實驗藥物

中風停顆粒（由天麻10 g，鉤藤15 g，生牡蠣30 g，生龍骨30 g，生石決明30 g，丹參10 g，牡丹皮10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g，膽南星10 g，白附子6 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，梔子10 g，蜈蚣2 g，全蝎3 g等17味中藥組成），由淄博市中醫醫院中藥房提供，廣東一方制藥有限公司生產的配方顆粒。用300mL開水將配方顆粒1劑溶解，將藥液混勻后紗布過濾，濃縮成相當于每毫升2.2 g生藥，滅菌后4 ℃保存備用。

1.3" 試劑及儀器

Anti-NLRP3抗體（Abcam，批號：Ab263899）；大鼠MMP-9、VEGF-A、EGF酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司（批號：GR20220110）；Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）辣根過氧化物酶（HRP）（Sparkjade，EF0002）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（Sparkjade，EC0003）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（Sparkjade，EC0001）。VELOCITY 18R高速冷凍離心機（Dynamica公司）；Tanon5200 Multi全自動化學發光/熒光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；超聲波細胞粉碎機JY92-IIN（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3K15型4 ℃低溫離心機（美國sigma公司），AMR-100型酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司），MVS-1型旋渦混合器（北京金北德工貿有限公司），UB1001型隔水式培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）。

1.4" 分組及造模

將60只SD雄性大鼠隨機分為空白對照組、模型組、中藥組，每組20只。模型組、中藥組動物采用大腦中動脈線栓法制備大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，參照Longa改良線栓法［8］。大鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.7 mL/100 g）麻醉。大鼠仰臥于手術臺上，經頸正中切口顯露右側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）。頭端直徑為（0.36±0.02）mm的尼龍線從右側CCA進入右側ICA，直到超出ICA分叉18 mm。結扎血管，切斷多余的尼龍線。縫合切口后，局部輸注0.2 mL的0.25%布比卡因以減輕術后疼痛。在整個手術過程中，使用加熱墊檢測并維持大鼠肛門溫度（37.0±0.5）℃。術后3 h采用5級4分法標準［8］進行神經功能缺損程度評分，分值≥1分判定為造模成功。插線操作超過15 min、術中出血多、麻醉過深呼吸不規律、術后3 h仍不能蘇醒的動物不列入統計范圍。在后續實驗中補充剔除出組的動物，保證每組動物數。

1.5" 給藥方法

造模后當天給藥。大鼠灌胃的中風停顆粒中藥劑量根據成人每日服用215 g生藥，參照《藥理實驗方法學》［9］中人和動物間體表面積折算系數換算，即大鼠等效劑量相當于人的6.3倍，估算大鼠每天的臨床劑量為22.68 g/kg。中藥組每只大鼠每次給予中風停顆粒0.51 mL/100 g，每日灌胃2次；空白對照組、模型組每只大鼠每次給予生理鹽水0.51 mL/100 g，每日灌胃2次。連續干預7 d。經預實驗已證明本研究中藥劑量因素對藥效的影響無明顯差異，故此實驗中只選用臨床常規中藥劑量。

1.6" 神經功能評分

采用Zea Longa 5分制評分標準評價神經功能缺損程度。0分：無神經功能缺損；1分：輕度局灶性神經功能缺損（右前爪不能完全伸展）；2分：中度局灶性神經功能缺損（向右側轉圈）；3分：重度局灶性神經功能缺損（向右側傾倒）；4分：不能自主行走，意識水平下降［8］。

1.7" 標本采集與檢測

1.7.1" 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測NLRP3表達

取病灶側腦組織，加入RIPA裂解液，低溫條件下勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經12%SDS-PAGE電泳后將電泳產物轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗NLRP3 1∶2 000稀釋；孵育，二抗［Goat Anti-RabbitIgG（H＋L）HRP］1∶5 000稀釋孵育，將膜置于發光板上，用濾紙吸去膜上的多余的TBST，加入適量的發光液，完全覆蓋住聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用化學發光成像儀曝光顯影。用NIH Image J 1.41計算灰度值，與內參（β-actin）做比值后分析。

1.7.2" ELISA法檢測MMP-9、VEGF-A、EGF表達

大鼠麻醉后抽取靜脈血，置于抗凝管中，3 000 r/min離心20 min，取血漿上清液。按照ELISA分析試劑盒步驟，酶標儀測定細胞上清液MMP-9、VEGF-A、EGF含量。

1.8" 統計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩個樣本均數的比較采用t或t′檢驗，多個樣本均數的比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" 各組一般情況及神經功能評分比較

造模后，空白對照組大鼠進食正常，體質量逐漸增加，未出現大小便失禁情況。模型組、中藥組存在進食減少，體質量下降，每組各有1只存在大小便失禁情況。空白對照組無神經功能缺損癥狀。第1天，模型組神經功能評分與中藥組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第7天，模型組、中藥組神經功能評分均低于第1天，中藥組神經功能評分低于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2" 3組血漿MMP-9、VEGF-A、EGF水平比較

與空白對照組比較，模型組、中藥組血漿MMP-9、VEGF-A水平均升高（P＜0.01），EGF水平降低（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組血漿VEGF-A、EGF水平均升高（P＜0.01），MMP-9水平降低（P＜0.01）。詳見表2。

2.3" 3組大鼠腦組織NLRP3水平比較

模型組、中藥組腦組織NLRP3表達水平均高于空白對照組（P＜0.05）；中藥組腦組織NLRP3表達水平低于模型組（P＜0.05）。詳見表3、圖1。

3" 討" 論

ACI發生后，腦組織缺血缺氧，引起一系列細胞死亡事件如興奮性毒性、氧化應激和神經炎癥［10］，血管內皮細胞受損，血腦屏障通透性增加，腦細胞發生凋亡和壞死，最終導致神經功能缺損。近年來，中藥復方治療ACI的報道逐漸增多，研究表明中藥復方能降低炎性因子水平、改善氧化應激指標、緩解神經細胞凋亡，促進神經功能恢復，保護缺血損傷的腦組織［11-14］。隨著研究不斷深入，炎癥反應在ACI病程進展中的作用被日益重視。最新研究顯示，NLRP3炎癥小體在ACI后炎癥反應中起關鍵作用，能誘導ACI后神經炎癥，抑制其表達能促進神經功能恢復［15-16］。課題組前期研究已證實，中風停顆粒能降低ACI病人血漿炎性因子白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素8（IL-8）、白細胞介素17A（IL-17A）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等水平，改善病人的神經功能［6，17］。本研究在前期臨床研究基礎上，探討中風停顆粒對ACI大鼠NLRP3炎癥小體及MMP-9、EGF、VEGF-A表達的影響，以期深入探討中風停顆粒的作用機制。

本研究采用大腦中動脈線栓法建立MCAO大鼠模型，是目前常用的模擬腦缺血損傷模型，被廣泛應用于缺血性腦卒中的研究，該模型能夠模擬人腦缺血損傷后的病理機制。本研究結果顯示，模型大鼠的神經功能缺損評分、腦組織NLRP3表達水平顯著升高，血漿MMP-9、VEGF-A水平升高，EGF水平降低，表明MCAO模型大鼠存在明顯的炎癥反應、內皮細胞受損、血腦屏障破壞及神經功能損傷，提示模型構建成功。

炎癥反應在腦缺血早期對神經功能的損傷被臨床逐漸重視，NLRP3炎癥小體是最具特征的炎性小體，與炎癥反應密切相關［9］。腦組織缺血缺氧時，細胞內三磷酸腺苷（ATP）含量下降，NLRP3被激活而啟動炎癥反應，釋放大量促炎細胞因子，如IL-1β和白細胞介素8（IL-18），促炎細胞因子使血腦屏障通透性增加，并透過血腦屏障加重神經炎癥，使梗死體積擴大和腦水腫形成，從而使神經功能損傷程度加重［18］。抑制NLRP3炎癥小體的表達和活性成為目前ACI的重要治療靶點［15］。中藥復方和西藥均證實通過調控NLRP3炎癥小體，抑制炎癥反應，可促進神經功能恢復。《古今錄驗》續命湯［19］通過抑制低氧誘導因子-1α（HIF-1α）/NLRP3途徑，可抑制缺血性中風細胞焦亡，促進神經功能恢復，脈絡舒通丸［20］可通過調控Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）/NLRP3信號通路，抑制炎癥反應，保護小鼠腦缺血再灌注損傷，依達拉奉右冰片醇［21］可通過抑制NLRP3炎癥小體和NF-κB信號激活，以抑制小膠質細胞/巨噬細胞焦亡，而起到神經保護作用。內皮細胞是血腦屏障重要的細胞組成，MMP-9是細胞外基質重要的調節蛋白酶，主要在缺血腦組織的內皮細胞中表達，MMP-9激活是血腦屏障損傷的直接原因［22-23］。VEGF-A在腦缺血修復過程的血管生成中起重要作用，可刺激內皮細胞增殖和遷移，促進新血管形成，發揮神經保護作用［24］。研究表明，通過激活HIF-1α/血管內皮生長因子（VEGF）信號通路，可促進血管生成，促進神經恢復，減輕腦缺血損傷［25-26］。也有研究認為，VEGF-A在腦缺血早期過表達可誘導血管通透性增強，破壞血腦屏障，產生負面影響，加重腦損傷［27］，但目前研究總體認為，負面損傷是暫時的，VEGF有明顯的臨床意義。EGF是一種促神經生長因子，能夠調節神經細胞生長、增殖、分化和再生，促進腦組織再生和神經元修復［28］。研究證實，腦缺血時EGF可刺激MMP-9的表達，損傷腦血管內皮細胞［29］，上調EGF的表達水平，可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，發揮腦保護作用［30］，給MCAO大鼠腦室內注入外源性EGF后，大鼠神經功能恢復的可塑性更強［28］。

本研究結果顯示，模型組、中藥組大鼠腦組織NLRP3表達顯著升高，中風停顆粒治療后NLRP3表達水平顯著下調，提示炎癥反應是ACI病理過程的重要表現，中風停顆粒能抑制NLRP3水平的表達，減輕炎癥反應。模型組、中藥組大鼠血漿MMP-9、VEGF-A水平升高，EGF水平降低，中風停顆粒治療后血漿MMP-9水平降低，VEGF-A、EGF水平升高，提示ACI發生后腦血管內皮細胞受損、血管屏障完整性破壞，中風停顆粒能促進內皮細胞生長增殖，修復血腦屏障，促進神經元再生，發揮神經保護作用。本研究予中風停顆粒治療后ACI大鼠腦組織中NLRP3的表達水平降低，血漿MMP-9表達水平下降，VEGF-A、EGF水平表達升高，神經功能損傷和神經炎癥明顯減輕，提示中風停顆粒可能通過抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，改善內皮細胞功能，促進血腦屏障修復，進而改善ACI大鼠神經損傷。

本研究不足之處在于對NLRP3炎癥小體與焦亡之間的信號通路，以及焦亡下游的效應機制尚未明確，將在后續研究中進行深入探索。

綜上所述，中風停顆粒可抑制ACI大鼠NLRP3炎癥小體表達水平，減輕炎癥反應，改善MMP-9、EGF、VEGF-A表達。

參考文獻：

［1］" 中華醫學會神經病學分會，中華醫學會神經病學分會腦血管病學組.中國缺血性卒中和短暫性腦缺血發作二級預防指南2022［J］.中華神經科雜志，2022，55（10）：1071-1110.

［2］" TU W J，ZHAO Z P，YIN P，et al.Estimated burden of stroke in China in 2020［J］.JAMA Network Open，2023，6（3）：e231455.

［3］" 王玲，孫玉華，浮榮莉，等.NLRP3炎癥小體與腦梗死后患者神經功能恢復的相關性分析［J］.中國實用神經疾病雜志，2021，24（6）：499-504.

［4］" 李兆珍，張丹參.腦缺血再灌注損傷相關機制的研究進展［J］.神經藥理學報，2020，10（6）：60-63.

［5］" 朱文浩，胡浩，劉現鋒，等.缺血性中風證候要素分布規律與影響因素的研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2019，17（23）：3690-3694.

［6］" 蘇鈺，朱文浩，劉寶殊，等.熄風清火活血化痰湯對急性缺血性中風（風火痰瘀證）患者血清IL-1β、IL-5、IL-17、TNF-α水平的影響［J］.中國中醫急癥，2021，30（12）：2166-2169.

［7］" 朱文浩，宋以玉，胡浩，等.熄風清火活血化痰湯治療急性缺血性腦卒中風火痰瘀證臨床觀察［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2022，20（5）：94-97.

［8］" LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［9］" 魏偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學［M］.4版.北京：人民衛生出版社，2010：1-5.

［10］" 蘇鈺，朱文浩.炎性小體與缺血性腦卒中發病及中醫相關機制的研究進展［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2022，20（19）：3582-3586.

［11］" 鄭玉蘭，徐貞，李如珊，等.腦栓通膠囊對急性腦梗死模型大鼠炎癥因子、MMP-9和TIMP-1表達及氧化應激指標的影響［J］.中國中醫急癥，2020，29（6）：1027-1030;1044.

［12］" 閆振文，鄭眉光，李梅.益氣活血通絡方對急性腦梗死大鼠炎癥因子、氧化應激指標及神經細胞凋亡的影響［J］.中國中醫急癥，2020，29（6）：957-961.

［13］" 張婷，齊婧，劉侃，等.補陽還五湯對rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經細胞凋亡及Ang/Tie-2蛋白表達的影響［J］.遵義醫科大學學報，2021，44（6）：711-717.

［14］" 俞一超，鄧玉，徐紹卿，等.枳術湯對急性腦梗死大鼠神經功能及海馬組織Nogo-A及LPA蛋白表達的影響［J］.新中醫，2022，54（7）：33-37.

［15］" RAN Y Y，SU W，GAO F H，et al.Curcumin ameliorates white matter injury after ischemic stroke by inhibiting microglia/macrophage pyroptosis through NF-κB suppression and NLRP3 inflammasome inhibition［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2021，2021：1552127.

［16］" 尹倩，周德生，陳瑤，等.基于NLRP3炎癥小體探討活血榮絡方對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機制［J］.中國中醫藥信息雜志，2023，30（9）：115-121.

［17］" 蒲馨穎，朱文浩，劉寶殊，等.中風停顆粒對急性缺血性腦卒中風火痰瘀證患者炎癥因子表達的影響［J］.亞太傳統醫藥，2023，19（10）：72-75.

［18］" ZHU H，JIAN Z H，ZHONG Y，et al.Janus kinase inhibition ameliorates ischemic stroke injury and neuroinflammation through reducing NLRP3 inflammasome activation via JAK2/STAT3 pathway inhibition［J］.Frontiers in Immunology，2021，12：714943.

［19］" 蔡昱哲，李定祥，羅政，等.基于HIF-1α/NLRP3途徑介導細胞焦亡探討《古今錄驗》續命湯治療缺血性卒中的機制［J］.中國實驗方劑學雜志，2023，29（17）：9-17.

［20］" 楊永芳，王愷悅，張玉娟，等.基于TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路探討脈絡舒通丸保護小鼠腦缺血再灌注損傷的作用機制［J］.中藥藥理與臨床，2023，39（8）：36-40.

［21］" HU R Y，LIANG J，DING L，et al.Edaravone dexborneol provides neuroprotective benefits by suppressing NLRP3 inflammasome-induced microglial pyroptosis in experimental ischemic stroke［J］.International Immunopharmacology，2022，113（Pt A）：109315.

［22］" VAFADARI B，SALAMIAN A，KACZMAREK L.MMP-9 in translation：from molecule to brain physiology，pathology，and therapy［J］.Journal of Neurochemistry，2016，139（S2）：91-114.

［23］" MISRA S，MONTANER J，RAMIRO L，et al.Blood biomarkers for the diagnosis and differentiation of stroke：a systematic review and meta-analysis［J］.International Journal of Stroke，2020，15（7）：704-721.

［24］" 張普娟，魏經化，凡鑫.半夏白術天麻湯加減對急性腦梗死的療效及其對VEGF、Ang-2和NSE水平的影響［J］.貴州醫藥，2020，44（8）：1289-1290.

［25］" LI Y，MA T T，ZHU X Y，et al.Zinc improves neurological recovery by promoting angiogenesis via the astrocyte-mediated HIF-1α/VEGF signaling pathway in experimental stroke［J］.CNS Neuroscience amp; Therapeutics，2022，28（11）：1790-1799.

［26］" NI H Z，LI J X，ZHENG J Y，et al.Cardamonin attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury by activating the HIF-1α/VEGFA pathway［J］.Phytotherapy Research，2022，36（4）：1736-1747.

［27］" DEYAMA S，LI X Y，DUMAN R S.Neuron-specific deletion of VEGF or its receptor Flk-1 impairs recognition memory［J］.European Neuropsychopharmacology，2020，31：145-151.

［28］" 余劍，曾進勝，熊麗，等.表皮生長因子對大鼠腦梗死后神經功能恢復的影響［J］.中國卒中雜志，2007，2（7）：574-577.

［29］" ASHOK A，RAI N K，RAZA W，et al.Chronic cerebral hypoperfusion-induced impairment of Aβ clearance requires HB-EGF-dependent sequential activation of HIF1α and MMP9［J］.Neurobiology of Disease，2016，95：179-193.

［30］" 張雅婷，馬靜萍.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后EGF表達的影響［J］.當代醫學，2020，26（18）：143-144.

（收稿日期：2023-11-28）

（本文編輯郭懷印）