嘌呤能受體在卵巢癌中的預后價值及腫瘤免疫浸潤分析

摘要：目的" 構建漿液性卵巢癌（OV）嘌呤能受體家族基因的預后模型，分析基因的表達與免疫細胞浸潤及常用化療藥物的關系。方法" 下載癌癥基因圖譜（TCGA）等數據庫中15個嘌呤能受體家族基因的表達譜數據及臨床信息，利用LASSO回歸分析篩選與OV患者生存有關的基因，根據風險值對患者分組并使用Kaplan-Meier Plotter對關鍵基因進行生存分析。應用多因素Cox回歸分析構建基于TCGA-OV數據集的預后模型，繪制列線圖和校準曲線。利用TIMER、xCell算法進行免疫浸潤分析。利用TIDE算法分析基因的表達與免疫檢查點阻斷（ICB）治療的相關性。利用TCGA聯合癌癥藥物敏感性基因組學（GDSC）數據庫進行藥物敏感性分析。結果" LASSO回歸分析篩選得到6個嘌呤能受體家族基因與OV患者預后有關。多因素Cox回歸分析顯示，P2RX6、P2RY12、P2RY14、年齡和種族是OV患者獨立的預后因素（Plt;0.05）。P2RX6和P2RY14在OV中表達下調（Plt;0.05）。P2RY14的表達不僅與PDCD1、CTLA4、TIGIT等多種免疫檢查點有關，還與紫杉醇、順鉑、環磷酰胺、多西他賽的半抑制濃度（IC50）呈負相關。P2RY14相關基因主要參與免疫細胞激活、分化、增殖等生物學過程。結論" 基于TCGA數據庫構建OV患者的預后模型，經篩選得出P2RY14可作為OV患者預后獨立危險因素，可為指導OV的免疫治療提供新的思路和方向。

關鍵詞：嘌呤能受體；漿液性卵巢癌；數據庫；預后；免疫浸潤

中圖分類號：R737.31" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.17.001

文章編號：1006-1959（2024）17-0001-10

Prognostic Value of Purinergic Receptors in Ovarian Cancer and Analysis of Tumor Immune Infiltration

LI Zhao1，ZHOU Yu-ming2，JIANG Ru2，YU Yun-liang2

（1.Department of Medical Laboratory，Linqing People’s Hospital，Liaocheng 252600，Shandong，China;

2.Department of Medical Laboratory，Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Yantai 264100，Shandong，China）

Abstract：Objective" To construct a prognostic model of purinergic receptor family genes in serous ovarian cancer （OV）， and to analyze the relationship between gene expression and immune cell infiltration and commonly used chemotherapeutic drugs.Methods" The expression profile data and clinical information of 15 purinergic receptor family genes in databases such as the Cancer Genome Atlas （TCGA） were downloaded. LASSO regression analysis was used to screen genes related to the survival of OV patients. Patients were grouped according to the risk value and Kaplan-Meier Plotter was used to analyze the survival of key genes. Multivariate Cox regression analysis was used to construct a prognostic model based on TCGA-OV data set， and the nomogram and calibration curve were drawn. Immune infiltration analysis was performed using TIMER and xCell algorithms. TIDE algorithm was used to analyze the correlation between gene expression and immune checkpoint blockade （ICB） treatment. Drug sensitivity analysis was performed using the TCGA combined with Genomics of Drug Sensitivity in Cancer （GDSC） database.Results" Six purinergic receptor family genes screened by LASSO regression analysis were related to the prognosis of OV patients. Multivariate Cox regression analysis showed that P2RX6， P2RY12， P2RY14， age and race were independent prognostic factors for OV patients （Plt;0.05）. The expression of P2RX6 and P2RY14 was down-regulated in OV （Plt;0.05）. The expression of P2RY14 was not only related to PDCD1， CTLA4， TIGIT and other immune checkpoints， but also negatively correlated with the half inhibitory concentration （IC50） of paclitaxel， cisplatin， cyclophosphamide and docetaxel. P2RY14-related genes were mainly involved in biological processes such as immune cell activation， differentiation， and proliferation.Conclusion" Based on the TCGA database， the prognostic model of OV patients is constructed. After screening， P2RY14 can be used as an independent risk factor for the prognosis of OV patients， which can provide new ideas and directions for guiding the immunotherapy of OV.

Key words：Purinergic receptors;Ovarian serous cancer;Database;Prognosis;Immune infiltration

上皮性卵巢癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，其中漿液性卵巢癌（ovarian serous cancer， OV）是上皮性卵巢癌主要組織學類型[1]。近年來，隨著免疫檢查點阻斷療法（immune checkpoints blockade， ICB）、樹突狀細胞疫苗（dendritic-cell vaccine， DCVAC）、嵌合抗原受體T細胞治療等免疫療法的應用，免疫治療目前已成為OV治療最具前景和最具潛力的療法[2-4]。盡管各種免疫治療方法在OV治療中顯示出一定的效果，但OV，尤其是高級別OV，其特征是腫瘤微環境（tumor microenvironment， TME）免疫浸潤程度較低，對免疫治療的應答率較低[5]。篩選與ICB有關的OV預測標記物或預測模型來輔助臨床診療，對于OV患者的個體化和精準化免疫治療及改善患者的預后具有重要價值。嘌呤能受體家族分子是機體內重要的ATP門控離子通道受體，其家族主要包括7種P2X受體（P2X purinoreceptors， P2RXs）和8種P2Y受體（P2Y purinoreceptors， P2RYs）[6]。P2RXs包括P2RX1～P2RX7，P2RYs包括P2RY1、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY11、P2RY12、P2RY13和P2RY14。這些分子廣泛參與機體能量代謝、免疫調控、炎癥反應等生物學進程。近年來，研究發現嘌呤能受體分子在女性生殖系統、消化系統、呼吸系統等腫瘤中發揮重要的免疫調控作用[7-10]。然而關于其家族成員是否對OV患者有影響的研究鮮有報道。本研究以癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas， TCGA）數據庫、基因型組織表達（The Genotype-Tissue Expression， GTEx）數據庫、高通量基因表達（Gene Expression Omnibus， GEO）數據庫、癌癥相關藥物敏感性基因組學（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer， GDSC）數據庫為基礎，建立15個嘌呤能受體家族基因的風險預測模型并進行篩選驗證，分析關鍵基因的表達與OV患者的預后、腫瘤浸潤細胞（Tumor Immune Infiltrating Cells， TIICs）、免疫檢查點（Immune Checkpoints， ICs）、ICB、常用化療藥物的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration， IC50）等的相關關系，旨在為進一步探索嘌呤能受體在OV中發揮作用的機制提供線索。

1資料與方法

1.1數據來源與處理" 從Sangerbox生物信息在線平臺（https：//sangerbox.com）下載經標準化處理后基因的表達譜數據及臨床信息，這些數據來源于TCGA數據庫（http：//cancergenome.nih.gov）（TCGA-OV共419例）和GTEx數據庫（https：//gtexportal.org/）（正常卵巢組織共88例）。下載GEO數據集（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）（GSE12470[11]及GSE40595[12]）中正常卵巢組織和OV組織數據，格式為“MINiML”的表達譜數據進行表達分析驗證。

1.2預后模型的構建" 運用R軟件“glmnet”包，利用最小絕對收縮和選擇運算符（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator， LASSO）回歸分析構建預測模型。根據log（λ）序列生成LASSO系數剖面圖，其中最優λ值使用10折交叉驗證獲取。在LASSO回歸模型中納入基因的表達水平與相關系數的乘積，繪制部分似然偏差曲線與log（λ）的相關關系圖。計算每個樣本的風險評分從而將樣本根據分值的高低進行分組，隨后使用Kaplan-Meier Plotter繪制生存曲線，分析兩組間的生存差異，以觀察不同樣本的風險評分、生存時間和存活狀態。根據風險評分的高低繪制受試者工作特征曲線（Receiver Operator charateristic Curve， ROC），統計分析OV患者第1、2、3年ROC下方面積（Area Under Curve， AUC），以此對建立模型中的不同時間的預測效能進行評估。

1.3篩選OV患者預后的獨立危險因素" 運用“forestplot”“rms”等R軟件包，使用單因素和多因素Cox回歸分析計算每個變量的P值、風險比（Hazard Ratio， HR）和95%可信區間，并繪制森林圖。基于多因素Cox回歸分析的結果，構建列線圖以預測OV患者第1、2、3年每個風險因素對OV患者的預后價值。為評估列線圖實際生存和預測生存的一致性，繪制預測第1、2、3年生存率的校準曲線，用于評估預測風險與實際風險的接近程度。校準曲線越靠近45°對角線，斜率越接近1，模型的預測效能越高。

1.4免疫浸潤分析" TIMER算法是利用反褶積算法從基因表達譜中推斷TIICs的豐度的一種算法，可估計TME中6種TIICs（B細胞，CD4+T細胞，CD8+T細胞，中性粒細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞）的浸潤程度[13]。本研究使用TIMER算法分析了基因的表達與TME中6種TIICs的相關性。xCell算法根據免疫細胞和基質細胞類型的基因表達數據進行細胞類型富集分析，分析不同TIICs亞型的浸潤程度[14]。本研究使用xCell算法分析了目的基因的表達與不同類型的TIICs的相關性。使用Spearman相關性檢驗分析基因的表達與8種常見ICs（CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、SIGLEC15和TIGIT）的相關性。使用腫瘤免疫功能障礙與排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion， TIDE）算法，在預處理基因組學的基礎上，預測OV患者對ICB治療的響應性。

1.5富集分析" 基于OV中P2RY14的mRNA表達的四分位數，使用“Limma”等R軟件包將OV患者分為高表達組和低表達組，篩選差異具有統計學意義的基因，篩選標準為校正后的Plt;0.01，且差異表達倍數的對數值達2倍以上的基因。對篩選得到的上調的前50個P2RY14相關基因進行聚類分析，繪制火山圖和熱圖。使用“cluster Profiler”等R軟件包對篩選的基因進行基因本體論（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。

1.6藥敏分析" 將TCGA獲得的OV患者的表達譜數據和臨床數據結合GDSC數據庫（https：//www.cancerrxgene.org/）信息，運用R包“pRRophetic”預測每個樣本的化療反應。使用Spearman相關性分析基因表達與6種常見OV化療藥物IC50之間的相關性。

1.7統計學方法" "所有統計分析均通過R（版本號：4.0.3）軟件進行。兩組樣本基因表達差異的比較使用Wilcox檢驗，三組樣本比較使用Kruskal-Wallis檢驗。使用Spearman 相關性檢驗分析P2RXs與TIICs、ICs、TIDE等的相關關系。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1預后風險評分模型的建立" LASSO回歸分析顯示，15個嘌呤能受體家族分子中共有6個被納入OV患者風險評估模型，包括P2RX1、P2RX6、P2RY2、P2RY6、P2RY12和P2RY14。這6個基因中P2RX1、P2RY14被認為是危險基因，而P2RX6、P2RY2、P2RY6和P2RY12被認為是保護基因（圖1A）。為了防止模型過度擬合，本研究使用交叉驗證選擇了最優的λ值，即篩選得到6個基因被納入風險評估模型（圖1B）。根據模型中風險評分的高低進行分組，以展示兩組中不同樣本的風險評分、生存時間和存活狀態，結果如圖1C所示。進一步繪制生存曲線，結果顯示生存曲線中高表達組的HR達1.8（Log-rank P=1.26e-5），見圖1D。說明該模型中高風險組相對于低風險組樣本的風險系數較高，即高風險組模型為危險模型。對建立的風險模型不同時間的預測效能進行評估，結果顯示第1、2和3年ROC曲線AUC分別為0.567、0.6和0.609，說明該模型在OV中短期預測效能良好（圖1E）。

2.2構建與評估OV患者生存時間預測的列線圖" 單因素Cox回歸分析顯示，P2RX1、P2RX6、P2RY12、P2RY14、年齡和種族與OV患者的總生存期有關（Plt;0.05，圖2A）。多因素Cox回歸分析顯示，P2RX6、P2RY12、P2RY14、年齡和種族與OV患者生存期有關（Plt;0.05，圖2B）。其中，P2RX6的HR為1.36349，P2RY12的HR為1.47826，P2RY14的HR為0.59017，說明P2RX6和P2RY12是預后的危險因素，而P2RY14是保護因素。依據多因素Cox回歸分析的變量構建列線圖，結果顯示P2RX6、P2RY12、P2RY14、年齡和種族可作為OV患者預后的獨立危險因素（圖2C）。校準曲線結果顯示第1、2、3年生存率校準曲線都靠近45°對角線，即該模型對OV患者短期內的生存預測準確性較高（圖2D）。

2.3 P2RX6和P2RY14在OV中的表達" 對P2RX6、P2RY12和P2RY14在OV中的表達模式進行研究結果見圖3A～圖3I。TCGA聯合GTEx數據庫結果顯示，P2RX6和P2RY14 mRNA在OV中表達下調（Plt;0.05，圖3A和圖3C），但P2RY12在OV和正常卵巢組織中表達無差異（圖3B）。GSE40595數據集也顯示P2RX6和P2RY14 mRNA在OV中表達下調（圖3D和圖3F），而P2RY12在正常組織和OV中表達無差異（圖3E）。GSE12470數據集顯示P2RX6在6例正常卵巢上皮組織中的表達顯著低于31例卵巢癌間質和32例OV組織，而P2RY14在正常和癌間質中的表達顯著高于OV組織（圖3G和圖3I）。P2RY12在正常組織中的表達顯著高于32例OV組織，其余無差異（圖3H）。

2.4嘌呤能受體家族分子與免疫浸潤的關系" TIMER算法分析結果顯示，在OV中，15種嘌呤能受體分子與多數TIICs呈正相關關系（圖4A），其中P2RX7與髓源性DCs正相關性最強（Plt;0.05，r=0.71）。在15種分子中，P2RY14與巨噬細胞、髓源性DCs、中性粒細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞均呈正相關（Plt;0.05，圖4A）。根據P2RY14表達的四分位數將患者分為高、低表達組后，利用xCell算法進一步分析P2RY14與不同亞型的免疫細胞的相關性，結果顯示P2RY14與天然CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD8+中央記憶T細胞、CD4+效應記憶T細胞、類別轉換記憶B細胞、M2型巨噬細胞、漿細胞樣DCs、巨噬細胞、M1型巨噬細胞、髓源性激活的DCs、單核細胞、免疫評分、微環境評分、CD4+記憶T細胞、B細胞、Th1 CD4+ T細胞、基質評分、內皮細胞、造血干細胞相關（圖4B）。P2RY14表達量較高的OV患者，上述細胞的浸潤程度或免疫/基質評分也較高。

2.5 P2RY14與ICs及ICB的關系" 在OV中，P2RY14與8種ICs即CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、SIGLEC15和TIGIT均呈正相關關系（Plt;0.05，圖5A）。根據P2RY14表達的四分位數進行分組后，比較高表達組和低表達組中這8種ICs是否存在差異，結果顯示P2RY14高表達的患者中這8種ICs的表達高于P2Y14低表達組（Plt;0.05，圖5B）。進一步利用TIDE算法評估OV患者ICB治療響應性，結果顯示P2RY14高表達組TIDE評分高于低表達組，即P2RY14與TIDE評分負相關，P2RY14高表達患者ICB治療療效較差（圖5C）。

2.6 P2RY14參與TME免疫調控" 根據前文篩選條件，在OV中，篩選得到與P2RY14正相關的基因共有666個，主要包括POSTN、LUM、LYZ等，負相關的基因共有35個，主要有PHOX2A、VSIG2、OVGP1等（Plt;0.05，圖6A）。熱圖結果顯示了每例OV樣本中P2RY14的表達與上調的前50個基因及下調的35個基因的相關性（圖6B）。KEGG結果顯示上調的前50基因主要富集于細胞因子-細胞因子相互作用、吞噬體、造血細胞系等信號通路（Plt;0.05，圖6C）；GO功能分析顯示這些基因主要富集于各種TIICs的激活、發育、活化、遷移等功能（Plt;0.05，圖6D）。

2.7 P2RY14與多種OV化療藥物有關" 聯合TCGA中P2RY14表達譜數據與GDSC數據庫信息，評估6種OV常用化療藥物的IC50評分和P2RY14基因表達相關性，結果顯示P2RY14的表達與紫杉醇、順鉑、環磷酰胺和多西他賽的IC50呈負相關關系（Plt;0.05，圖7A～圖7D），而與吉西他濱和多柔比星不相關（圖7E、圖7F）。根據P2RY14表達四分位數進行分組后，進一步分析在P2RY14高、低表達組中6種化療藥物是否存在差異，結果顯示除吉西他濱和多柔比星外（圖7K、圖7L），其余4種抗腫瘤藥物的IC50在P2RY14高表達組中均低于P2RY14低表達組（Plt;0.05，圖7G～圖7J），即P2RY14高表達的OV患者對上述4種藥物更敏感。

3討論

嘌呤能受體是配體門控的離子通道家族成員，在介導細胞外ATP信號傳導中起著至關重要的作用。嘌呤能受體被細胞外ATP的結合激活后，觸發了由受體亞基的跨膜結構域形成的離子通道孔，隨后胞外陽離子（主要是Na+和Ca2+）可通過離子通道進入細胞[15]。嘌呤能家族受體廣泛參與人體各種生理過程，包括神經傳遞、神經調控、免疫反應、炎癥和痛覺等。在免疫系統中，這些受體存在于巨噬細胞、T細胞和DCs等免疫細胞上，它們參與免疫細胞激活、細胞因子釋放和炎癥反應的調節[16]。目前，關于該家族分子與腫瘤發生、發展的研究正逐漸受到重視，探索該家族分子與腫瘤患者預后的關系及明確其發揮作用的機制可為OV診療提供新的思路和研究方向。

LASSO回歸是一種機器學習算法，可以降低模型復雜度，識別潛在風險因素，是一種廣泛應用于癌癥患者預后模型的構建及篩選的算法[17]。本研究通過LASSO回歸分析共篩選出6個基因被納入風險評估模型。將這6個基因根據風險評分數值分為高、低風險組，通過繪制生存曲線及計算AUC面積評估風險模型的預測能力，結果顯示高風險組患者的生存概率相對于低風險組患者較低，ROC曲線下AUC面積提示本研究模型具有良好的短期預測能力，以上結果為后續的預后分析奠定了基礎。多因素Cox回歸分析顯示在這6個基因中P2RX6、P2RY12和P2RY14是OV患者獨立的預后因素。其中，P2RX6和P2RY12的HR均大于1，而P2RY14的HR小于1，說明隨著P2RX6和P2RY2的增加，患者死亡的風險也增加，即患者的生存期減少，而P2RY14與兩者相反。為更好地預測每例OV患者的生存時間，本研究又將挑選的關鍵基因與患者的年齡、種族等臨床特征相結合，構建了預測OV患者第1、2、3年的生存率的列線圖，校準曲線顯示列線圖短期的預測能力較好。通過篩選和構建列線圖，可為OV患者選擇個體化的精準靶向治療方案提供一定的研究基礎。針對多因素Cox回歸分析篩選的基因（P2RX6、P2RY12和P2RY14），本研究又通過TCGA數據庫探索了三者在OV中的表達模式，結果顯示P2RX6和P2RY14 mRNA在OV中顯著下調，而P2RY12在正常組織和OV中表達無差異。本研究所挑選的GSE數據集也顯示P2RX6和P2RY14在OV中呈現顯著下調的表達模式，推測P2RY14很可能作為一個抑癌因子，在OV發生發展進程中扮演著重要的抗腫瘤作用。

鑒于嘌呤能受體家族中多個基因與腫瘤患者TME中TIICs浸潤有關[7-10]，在OV中，本研究運用TIMER算法分析了15個嘌呤能受體與OV患者6種TIICs的相關性，結果顯示多數嘌呤能受體分子與巨噬細胞、髓源性DCs、中性粒細胞和CD4+T細胞呈正相關。在6種TIICs中，P2RX6僅與B細胞呈負相關，而P2RY14與除了B細胞外的另外5種TIICs均呈正相關。使用xCell算法進一步分析P2RY14與不同TIICs亞型的相關性，結果顯示P2RY14高表達的患者其TME中多種TIICs浸潤程度較高，進一步說明P2RY14可能在TME免疫調控網絡中發揮重要作用。研究表明[18]，P2Y14受體在人未成熟DCs中的高表達，壞死腫瘤細胞誘導的成熟DCs這樣一個過程所的引起的危險信號可能在免疫防御的開始中扮演著重要的角色。本研究發現P2RY14不僅與激活的髓源性DCs顯著相關，而且還與漿細胞樣DCs浸潤程度有關，而兩者是DCs不同時空下的兩種亞型，說明使用P2RY14可能參與OV患者TME中的DCs的分化、發育等過程。

OV，尤其是高級別OV是少數自發抗腫瘤免疫反應與延長生存顯著相關的癌癥類型之一，免疫逃避機制與低生存相關，表明高級別OV具有一定的免疫原性[19]。OV在抗PD-1/PD-L1或抗CTLA4單一療法的反應中并沒有取得顯著的突破，這可能是因為部分的OV患者腫瘤異質性較高。在本研究中發現P2RY14與8種臨床常用的ICs尤其是PDCD1LG2、CTLA4等呈顯著正相關，說明P2RY14可對ICB治療提供一定參考基礎。然而，P2RY14高表達OV患者TIDE評分也較高，即這部分患者接受ICB治療效果較差，由此推測P2RY14可能在OV中發揮雙向調控作用，這可能與OV患者復雜的腫瘤逃避機制有關。通過對P2RY14差異基因進行富集分析發現，上調的差異基因主要參與細胞因子-細胞因子相互作用信號通路、趨化因子信號通路等，主要富集于OV中多種免疫細胞的活化、分化、增殖、遷移等生物學功能，這些結果表明P2RY14在TME免疫調控網絡中發揮重要的調控點作用。在OV TME廣泛存在的細胞因子、趨化因子如活性氧、IL-6和IL-8等除了能刺激腫瘤細胞的細胞生長外，還能產生化療耐藥，而化療耐藥是OV患者生存率較低及臨床治療失敗的重要原因[20]。如前文所述，本研究富集分析結果顯示P2RY14與細胞因子、趨化因子等信號通路有關，隨后深入研究發現P2RY14的表達與紫杉醇、順鉑、環磷酰胺、多西他賽的IC50呈顯著負相關關系，說明P2RY14高表達的OV患者IC50較小，對上述四種化療藥物敏感。由此我們推測P2RY14還可能參與OV患者耐藥，其過程可能是通過調控細胞因子、趨化因子等炎性成分進行的。

需要指出的是，本研究雖然具有一定的前瞻性，但同樣存在一些局限性。首先，研究使用的TCGA來源的隊列數據中針對OV患者的臨床信息較少，構建的預后預測模型存在一定偏差。其次，關于嘌呤能受體分子的表達模式及免疫調控機制的研究也停留在轉錄組水平，P2RY14在OV中發揮免疫調控作用的機制需要進行基礎實驗來加以證明。最后，P2RY14在免疫調控網絡中可能起到一個關鍵調控點的作用，但在不同的時間和空間上，P2RY14參與免疫調控的機制可能不同，闡明P2RY14復雜的調控機制需要更深層次的研究。

總之，本研究構建了OV中嘌呤能受體家族基因預后預測模型，并對篩選的與OV患者預后有關的基因進行了深入研究。其中，在OV中低表達的P2RY14不僅與TIICs有關，還與ICs、ICB、化療藥物有關，這些結果對OV患者的個體化、精準化治療的選擇及改善患者的預后提供了一定的研究基礎。

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收稿日期：2023-09-27；修回日期：2023-11-01

編輯/肖婷婷