感染性肺結節患者呼吸道微生態分析

摘要：目的" 分析感染性肺結節患者呼吸道微生態成分構成和變化。方法" 收集2020年6月-2022年12月在我院呼吸與危重癥醫學科診斷和治療的肺結節病患者共53例，根據臨床診斷分為感染組（22例）和非感染組（31例）。收集肺泡灌洗液行宏基因組測序（mNGS）檢測呼吸道微生物。比較兩組患者呼吸道微生物Alpha多樣性，以及各指數ROC和PRC曲線。結果" 感染組Sobs指數、Chao1指數、Shannon指數均高于非感染組，而Simpson指數低于非感染組，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。感染組ACE指數高于非感染組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。非感染組以G陰性菌和病毒為主要微生物群落，感染組則以G陽性菌為主，差異有統計學意義（Plt;0.05）。Sobs、Chao1和Simpson指數的錯誤率高于50%，僅ACE和Shannon指數錯誤率低于50%。ACE和Shannon指數用于診斷感染性肺結節的準確率、特異性、敏感性和精確度均高于其它指數。Sobs、Chao1、AEC、Shannon和Simpson指數ROC的AUC分別為0.396、0.394、0.569、0.582和0.449。PRC的AUC分別為0.476、0.474、0.562、0.647和0.511；聯合檢測ROC和PRC的AUC為0.482和0.520。結論" 呼吸道微生態與感染性肺結節患者相關，對呼吸道微生物Alpha多樣性分析可用于感染性肺結節患者臨床診斷和治療，具有一定的應用價值。

關鍵詞：感染性肺結節；呼吸道微生態；Alpha多樣性

中圖分類號：R563；R816.4" " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.17.011

文章編號：1006-1959（2024）17-0064-05

Analysis of Respiratory Tract Microecology in Patients with Infectious Pulmonary Nodules

HE Yan-qin，TANG Wei，ZHANG Yin-jie，SHI Lin-feng，HE Mei-yan

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture People's Hospital，Xishuangbanna 666100，Yunnan，China）

Abstract：Objective" To analyze the composition and changes of respiratory microecological components in patients with infectious pulmonary nodules.Methods" A total of 53 patients with pulmonary sarcoidosis diagnosed and treated in the Department of Respiratory and Critical Care Medicine of our hospital from June 2020 to December 2022 were collected. According to the clinical diagnosis， they were divided into infection group （22 patients） and non-infection group （31 patients）. Bronchoalveolar lavage fluid was collected for metagenomic sequencing （mNGS） to detect respiratory microorganisms. The Alpha diversity of respiratory microorganisms and the ROC and PRC curves of each index were compared between the two groups.Results" The Sobs index， Chao1 index and Shannon index of the infected group were higher than those of the non-infected group， while the Simpson index was lower than that of the non-infected group， but the difference were not statistically significant （Pgt;0.05）. The ACE index of the infected group was higher than that of the non-infected group， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The non-infected group was dominated by G-negative and virus， while the infected group was dominated by G-positive bacteria， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The error rates of Sobs， Chao1 and Simpson indices were higher than 50%， and only ACE and Shannon indices were lower than 50%. The accuracy， specificity， sensitivity and accuracy of ACE and Shannon index in the diagnosis of infectious pulmonary nodules were higher than those of other indexes. The AUC of Sobs， Chao1， AEC， Shannon and Simpson index ROC were 0.396， 0.394， 0.569， 0.582 and 0.449， respectively. The AUC of PRC was 0.476， 0.474， 0.562， 0.647 and 0.511， respectively. The AUC of combined detection of ROC and PRC was 0.482 and 0.520.Conclusion" Respiratory tract microecology is related to patients with infectious pulmonary nodules. The analysis of Alpha diversity of respiratory tract microorganisms can be used for clinical diagnosis and treatment of patients with infectious pulmonary nodules， which has certain application value.

Key words：Infectious lung nodule;Respiratory microecology;Alpha diversity

隨著我國人口結構老齡化和現代影像學的發展，肺結節診斷率逐漸增加，其檢出率約為20%。但據美國國家肺癌CT篩查結果顯示，96.4%的陽性結節為良性結節，而對疑似肺癌的肺結節患者行手術治療，良性結節率為25%[1，2]。較高假陽性率不利于醫療資源充分利用和合理分配，可導致誤診和過度治療，也可能引起患者心理焦慮和家庭不睦。以病原微生物將肺部病變分為感染性和非感染性，感染性肺炎由細菌、病毒、真菌等病原微生物引起，而非感染性肺炎則無特異性病原體或不明[3]。呼吸道中存在微生物菌群，且處于動態變化中，若呼吸道微生態平衡被打破，就會對呼吸胸產生不良影響，引起肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病等疾病[4-7]。因此，研究呼吸道微生態紊亂引起肺部感染所致結節，對于肺結節鑒別診斷和預防治療具有一定臨床價值和意義。本研究通過收集患者肺泡灌洗液進行mNGS檢測呼吸道微生物，對比微生物在感染性和非感染性肺結節患者分布情況，分析感染性肺結節患者呼吸道微生態成分構成特點。

1資料與方法

1.1一般資料" 收集2020年6月-2022年12月在西雙版納傣族自治州人民醫院經高分辨CT確診的肺小結節患者53例，其中男26例，女27例；年齡18～90歲，平均年齡（53.66±17.95）歲；依據臨床診斷結果將患者分為感染性和非感染性肺病兩組。其中非感染組2例患者未參與支氣管鏡檢查和肺泡灌洗液收集。本項目經西雙版納傣族自治州人民醫院倫理委員會批準（NO.2023015），患者和家屬知情同意并簽署參與志愿書。研究實施過程中嚴格遵循赫爾辛基宣言。

1.2納入和排除標準" 納入標準：①影像學表現為直徑≤3 cm的局灶性、類圓形、高密度的實性或亞實性肺部隱影；②孤立性肺結節邊界清楚、密度高，且周圍被含氣肺組織包繞；③多發性肺結節數量≤10個，單一肺結節伴有一個或多個小結節；④不伴有肺不張、肺門淋巴結腫大和或胸腔積液；⑤未患包括肺癌在內等癌癥。排除標準：①患有全身嚴重疾病，如尿毒癥、風濕病、類風濕關節炎、強直性脊柱炎等；②患有高血壓、糖尿病、高尿酸血癥等；③患有家族遺傳病和先天性疾病等；④年齡大于90歲和（或）不能耐受氣管鏡檢查。感染性肺結節除滿足肺結節患者納入和排除標準之外應符合以下條件之一：①CT檢查提示滲出性病變（磨玻璃密度影）、變質性病變（囊變、空腔、鈣化等）、增生性病變（條索、斑片、腫塊等）；②HRCT提示結節有暈征，結節內部結構密度低、松散，純磨玻璃或部分磨玻璃樣，肉芽組織形成和增生，帶磨玻璃樣纖維灶[2，3，8]。

1.3樣本收集" 患者入院第2天在局部麻醉后行纖維支氣管鏡（奧林巴斯，BF-P60）肺泡灌洗檢查。灌洗部位遵循“灌洗病變葉段”原則，優先灌洗新發或浸潤性病變葉段；雙肺彌漫性病變選擇灌洗右肺中葉或左肺舌段。灌洗時將37 ℃滅菌生理鹽水30 ml由氣管活檢孔注入，再以-19.95～-13.3 kPa壓力吸出并轉移至高壓蒸汽滅菌瓶內。灌洗共5次，共收集約90 ml肺泡灌洗液，低溫保存至實驗室。

1.4 DNA提取和mNGS" 灌洗液500×g離心10 min后棄細胞沉淀，收集上清10 000×g離心10 min后采用1 ml PBS清洗沉淀物后再高速離心。然后使用HostZERO Microbial DNA Kit（ZYMO Research）提取懸浮物中DNA。放置-80 ℃凍存備用。基于Illumina高通量測序平臺IDsep（微遠基因，北京）對呼吸道樣本進行病原宏基因組測序并分析。

1.5 統計學方法" 采用R軟件（版本4.3.0）對數據進行統計分析。符合正態分布且方差齊的計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用Student's T檢驗；若不符合正態分布或方差不齊，則采用Wilcoxon檢驗。計數資料以頻數或百分率描述，采用χ2檢驗進行組間比較。Alpha生物多樣性檢測采用R軟件包vegan和picante進行分析。基于R軟件包precrec分析各因素診斷效能。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1患者臨床特征" "兩組性別、年齡、民族、吸煙情況、PCT、G試驗、GM試驗、結節位置和類型比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。感染組CRP水平高于非感染組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2呼吸道微生物比較" 感染組Sobs指數、Chao1指數、Shannon指數均高于非感染組，而Simpson指數低于非感染組，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。感染組ACE指數高于非感染組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。非感染組以G陰性菌和病毒為主要微生物群落，感染組則以G陽性菌為主，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.3呼吸道微生態分布對感染性肺結節診斷效能" 呼吸道微生物Alpha多樣性指數對感染性肺結節診斷效能較低。Sobs、Chao1和Simpson指數的錯誤率高于50%，僅ACE和Shannon指數錯誤率低于50%。ACE和Shannon指數用于診斷感染性肺結節的準確率、特異性、敏感性和精確度均高于其它指數，大于52%，見表3。

2.4呼吸道微生態對感染性肺結節診斷價值" 通過ROC和PRC曲線繪制和分析，Sobs、Chao1、AEC、Shannon和Simpson指數ROC的AUC分別為0.396、0.394、0.569、0.582和0.449；PRC的AUC分別為0.476、0.474、0.562、0.647和0.511；聯合檢測ROC和PRC的AUC為0.482和0.520。AEC和Shannon指數的ROC和PRC曲線見圖1。

3討論

感染性肺部良性結節是臨床常見的肺病[9]。影響因素較為復雜，主要機制為肺部炎性滲出物以肺泡孔為中心向周圍擴散，肺炎的炎性物質由周圍向中央均勻吸收，此外抗生素使用后炎性介質逐漸局限并形成結節[8，10]。感染性肺結節在普通CT上表現與惡性肺結節類似，易誤診；HRCT是最重要的影像學診斷方法[11]。

感染性肺結節HRCT表現為結節周邊存在暈環、內部疏松呈低密度影、完全或部分磨玻璃樣變化。然而，多發性和彌漫性肺結節診斷較為困難，需結合影像、臨床檢查和醫生經驗綜合判斷，必要時需取肺組織行病理檢查后確診。許仙花等[2]報道了7例感染性肺結節患者實驗室檢查正常，無明顯感染癥狀，CT提示惡性或傾向惡性，術后病理檢查則確證為感染性疾病，包括寄生蟲、曲霉菌、隱球菌和其他真菌感染。本研究發現感染性肺結節患者C反應蛋白高于非感染性肺結節患者組。PCT是降鈣素的前體物，在炎癥疾病早期發現臨床相關細菌感染和判斷肺炎預后具有一定臨床價值；但CRP對于評估肺炎嚴重程度和器官功能障礙等方面更具臨床意義，已作為一項獨立的生物指標用于臨床[12]。其與異常磷酰膽堿結合激活補體系統和單核細胞，清除和吞噬死亡細胞和病原微生物[13]。

呼吸道微生物多樣性對呼吸系統疾病具有一定影響[14]。一旦呼吸道微生態失衡，引起上皮細胞纖毛擺動能力減低、黏液分泌增加、上皮細胞凋亡或壞死，表現出免疫和炎癥反應。肺間質纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺炎等患者呼吸道菌群多樣性存在顯著不平衡[15]。Alpha多樣性指數可反應呼吸道生物群落中微生物數量、豐度和均勻程度。Sobs、Chao1和ACE指數能夠反應呼吸道生物群落豐富程度。與Sobs、Chao1指數估算菌落豐度不同，ACE可用于估計呼吸道微生物總數，并將測序數10以下微生物單獨計算，進而計算微生物群落中真實存在微生物數量，值越大則微生物類型越大[16]。本研究顯示，感染性肺結節患者ACE指數大于非感染性組，提示某一種或幾種微生物處于絕對優勢狀態，存在呼吸道微生態不平衡。這可能是由于共生菌數量減低、致病菌大量繁殖導致的。肺炎致病菌以格蘭陽性菌為主，尤其肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌這兩大類常見，與本研究感染性肺結節組患者一致；非感染組則革蘭陰性菌和病毒為優勢微生物群落[17，18]。細菌群體感應（quorum sensing， QS）系統在革蘭陽和陰性菌中普遍存在，致病菌QS信號通路與生物膜構成、毒力因子釋放等致病性密切相關，可影響非致病菌群[19，20]。

綜上所述，呼吸道微生態多樣性變化與感染性肺結節患者相關，對呼吸道微生物豐度、多樣性、均衡性進行分析，可用于感染性肺結節患者診斷和指導治療，具有一定的臨床運用價值。

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收稿日期：2023-08-04；修回日期：2023-09-14

編輯/肖婷婷