西伯利亞白刺鹽脅迫響應NsCIPKs基因鑒定及表達分析

摘 要 鈣離子作為普遍存在的第二信使能夠將外界脅迫快速轉化為信號傳導到細胞內，使植物對脅迫做出響應，而鈣調磷酸酶B互作蛋白激酶（CBL interacting" protein kinase，CIPKs）是鈣離子信號傳導途徑的核心和關鍵之一。本研究以鹽生植物西伯利亞白刺 （Nitraria sibirica） 作為試驗材料，基于鹽脅迫轉錄組，利用生物信息學方法對NsCIPKs家族鹽脅迫相關基因進行鑒定，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析鹽脅迫響應NsCIPKs基因的表達模式。結果表明：共鑒定到8個響應鹽脅迫的NsCIPKs成員，均編碼堿性親水蛋白且定位于細胞核，不同基因理化性質存在差異但結構保守。系統進化樹分析結果表明：8個NsCIPKs可分為4組，存在于6個亞族中，基因分化均出現于單雙子葉植物分化后。qRT-PCR結果顯示：NsCIPKs各成員均對不同鹽濃度處理的鹽脅迫有響應，且集中于根部與莖部表達，根中對鹽脅迫響應持久、迅速且高表達的基因為 NsCIPK1與 NsCIPK7，莖中為 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8，葉中為 NsCIPK3。綜上， NsCIPK1、 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8可能在鹽脅迫下發揮重要的作用。相關研究結果可為西伯利亞白刺耐鹽分子機制探索及轉基因新品種創制提供候選基因。

關鍵詞 鹽脅迫；CIPK；西伯利亞白刺;表達分析

目前，全球20%以上耕地受到土壤鹽漬化影響，到2050年受影響的面積將達到50%^[1]，由此導致的糧食損失每年將高達2 730億美元^[2]。植物不像動物一樣通過移動來避免不良環境，因此在進化過程中形成極為復雜的鹽脅迫響應機制。從植物響應鹽脅迫的分子水平來看，植物對鹽脅迫的響應是涉及多個功能與調控蛋白基因參與的動態調控過程^[3-4]。鹽脅迫響應基因根據編碼蛋白功能可分成兩大類：一類是編碼執行離子區隔化、轉運和分配，以及保護功能蛋白的基因，如鈉離子反向轉運蛋白基因、LEA（late embriogenesis abundant protein，LEA）蛋白基因、水通道蛋白基因等；另一類是調節其他基因表達、參與信號接收、轉導及編碼轉錄調節類蛋白等相關的基因，涉及轉錄因子、蛋白激酶、激素、鈣離子等分子信號^[5]。

Ca²⁺作為植物中普遍存在的第二信使，在植物受到脅迫刺激時，胞質內鈣離子濃度迅速增加，游離的鈣離子與鈣感受器蛋白結合從而進行調控。常見的鈣感受器-類鈣調磷酸酶B樣蛋白（Calcineurin B like protein，CBL）與其互作蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CBL interacting protein kinase，CIPK）結合，激活靶蛋白使其對脅迫產生反饋^[6-8]，被稱為CBL-CIPK信號傳導途徑。擬南芥（Arabidopsis thaliana）根部SOS（salt"" overly" sensitives，SOS）途徑是植物中第一個鑒定出的CBL-CIPK網絡，由3個部分組成，SOS3（CBL4）接受到來自鈣離子的信號后與SOS2（CIPK24）結合利用CBL4/CIPK24復合物磷酸化激活Na⁺/H⁺離子通道SOS1，從而控制Na⁺外排^[9-10]；此外，CBL10與SOS2結合也可以激活SOS1通道，且有研究表明其與CIPK2結合可能通過NHX蛋白將Na⁺區隔化在液泡中^[11]。如今在水稻（Oryza sativa）^[12]、棉花（Gossypium）^[13]和蘋果（Malus pumila）^[14]等植物中也發現了該途徑的存在。不同的SOS途徑中，CIPK基因均發揮了不可替代的作用。

西伯利亞白刺^[15]又名小果白刺，是蒺藜科白刺屬多年生木本灌木，為典型稀鹽型鹽生植物，可在含鹽量高于15 g/kg的重鹽堿地正常生長，對惡劣生境有極強的適應能力，亦可作為牲畜飼料，是防風固沙、保持水土及重鹽堿地改良的先鋒型植物，分布于中國西北及華北鹽堿地區、東北蘇打鹽堿地區和環渤海濱海鹽堿地區及西伯利亞地區，具有極高的生態應用價值，也是研究植物耐鹽分子機制與挖掘耐鹽抗逆等基因資源的重要材料。目前有關西伯利亞白刺耐鹽分子機制研究較少，多集中在脅迫后生理生化響應機制特征的分析。

截至目前，尚未有西伯利亞白刺CIPK家族耐鹽基因篩選挖掘相關報導。轉錄組數據可以快速獲得某一物種或組織在特定狀態下的基因表達情況，為功能基因挖掘提供可能^[16-17]。為此，本項研究基于轉錄組二代及三代測序序列組裝、注釋和表達水平定量結果的共同參考，擬對西伯利亞白刺全株CIPK響應鹽脅迫的基因進行篩選鑒定，并從進化關系、保守結構域、結構特征、鹽脅迫下的表達量等方面進行系統分析，最終篩選出鹽脅迫相關重要NsCIPK家族成員。研究可為豐富西伯利亞白刺基因庫，揭示西伯利亞白刺響應鹽脅迫反饋與調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 西伯利亞白刺鹽脅迫響應NsCIPKs家族成員的鑒定

本研究所用轉錄組數據為西伯利亞白刺根和葉短期鹽脅迫（10 min），滲透壓脅迫及無脅迫的三代測序的轉錄組，在NR、Swiss-prot和Pfam 3個數據庫中進行注釋，初步注釋后去除重復序列及冗余轉錄本。通過NCBI上的CDD（Conserved Domains Database）在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi）及pfam（http：//pfam.xfam.org/）對鹽脅迫轉錄組中獲得的候選基因進行保守結構域預測與鑒定^[18]，最終保留具有含保守結構域的CIPK家族基因序列。

1.2 NsCIPKs生物信息學分析

在ExPasy（https：//web.expasy.org/protparam/）網站預測NsCIPKs家族成員基本理化性質，使用在線程序 SOPMA（https ：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin /secpred sopma .pl ）進行蛋白二級結構分析。使用在線軟件 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對西伯利亞白刺CIPK蛋白進行亞細胞定位預測。利用在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/meme/）分析西伯利亞白刺CIPK家族蛋白的保守基序。通過Mega 7.0中鄰接法進行系統發育進化樹構建，重復值設為 1 000^[19]。

1.3 不同濃度鹽處理下西伯利亞白刺不同組織中NsCIPKs表達水平

以西伯利亞白刺無性系組培苗為材料，在 25 ℃、長日照[光照16 h；黑暗8 h；光照強度：120"" μmol/（m2·s）]溫室中培養8周后選取長勢一致的植株進行200 mmol/L與400 mmol/L NaCl脅迫處理，每個試驗重復3～6次，分別提取0、6、12、24、48、72 h共6個時間段兩種處理的根莖葉總RNA并分別反轉錄為cDNA，作為qPCR模板。

對本研究所篩選的NsCIPKs基因進行實時熒光定量PCR擴增，根據各基因特異序列設計上下游定量引物，引物序列見表1，退火溫度（T_m）均為（60±0.5）" ℃。選用actin基因^[20]為內參，各基因0 h時相對表達量為1，檢測各基因在不同時間和鹽濃度下的表達情況，根據TransStart Top Green qPCR SuperMix（全式金）試劑盒說明書進行qRT-PCR反應液的配制，在MJ MiniTM personal thermal cycler（BIO-RAD） Real-time PCR儀器上進行試驗，每個樣品進行3次生物學重復，采用2^-ΔΔCT的方法^[21]計算NsCIPKs基因的相對表達量并使其可視化。

1.4 鹽脅迫響應NsCIPKs編碼蛋白序列比對

將不同鹽處理下篩選出的F01_transcript_8177（ NsCIPK1）、F01_transcript_15178（ NsCIPK3）、F01_transcript_89644 （ NsCIPK7）與F01_transcript_10527 （ NsCIPK8） 4個重要NsCIPK家族基因編碼蛋白序列進行比對，比較其保守結構域。

2 結果與分析

2.1 西伯利亞白刺鹽脅迫響應CIPK家族成員鑒定

基于西伯利亞白刺鹽脅迫、滲透壓脅迫及三代轉錄組數據在NR、Swiss-prot和 Pfam 3個數據庫中進行注釋，根據注釋初步獲得30個CIPK基因。利用primer 5將已鑒定的基因序列翻譯成蛋白序列，并通過CDD及Pfam對其進行鑒定，去除重復序列及不含NAF保守結構域的CIPK序列，最終得到西伯利亞白刺的8個CIPK家族成員，命名為NsCIPK1、NsCIPK2、NsCIPK3、NsCIPK4、NsCIPK5、NsCIPK6、NsCIPK7和NsCIPK8。

2.2 NsCIPKs生物信息學分析

2.2.1 NsCIPKs家族理化性質

由表2可知，已鑒定的CIPK氨基酸全長除NsCIPK6為251 aa外，其余均在438～462 aa，除NsCIPK6為 28.71 ku外，其余CIPK的分子質量均在50 ku左右。等電點及不穩定系數顯示所有蛋白均為堿性穩定蛋白。此外NsCIPKs蛋白的平均親水系數在―0.473與―0.198之間，但均為負值，表明研究中所有NsCIPK鹽脅迫相關家族成員都是親水蛋白。

2.2.2 NsCIPKs二級結構及亞細胞定位預測

二級結構分析發現（表3），篩選出的所有NsCIPKs蛋白均具有α-螺旋、β-轉角、延伸鏈與無規則卷曲，其中α-螺旋與無規則卷曲的比例較高，范圍由最低33.47%至最高42.08%，β-轉角比例最低，在10%左右。亞細胞定位預測結果顯示這些蛋白均定位在細胞核上，推測NsCIPK家族鹽脅迫相關通路成員均在細胞核中發揮作用。

2.2.3 NsCIPKs結構域與保守基序分析

利用TBtools軟件將NsCIPKs基因編碼蛋白的保守結構域與基序進行結構可視化分析，圖1可見所有NsCIPKs均含有NAF蛋白激酶（Pkinase，protein kinase）結構域及與AMPK互作的結構域（AMPKA_C_like superfamily）。根據前人對于研究的CIPK各個基序所在位置的研究推測，位于C端的基序6為PPI，而其N端為NAF結構域。其余4個基序組成kinase結構域部分，目前已知Pkinase結構域中均包含有ATP結合位點及活性位點（active site）。

2.2.4 NsCIPKs系統進化分析

對本研究鑒定出的NsCIPKs進行系統進化樹分析，比較擬南芥、水稻及其他已驗證響應鹽脅迫的CIPK與西伯利亞白刺的進化關系，其中西伯利亞白刺用綠色標注出來。圖2顯示，CIPK被分成6個簇，分為4個group，其中group 1和group 2中均只有1個西伯利亞白刺的基因，group 1中的NsCIPK8與擬南芥的CIPK5及CIPK25均有較高的同源性，而group 2中的NsCIPK7與胡楊（Populus euphratica）的CIPK26有較高的同源性。西伯利亞白刺的CIPK家族成員大多聚集在group 3與group 4中，其中NsCIPK5與AtCIPK11、NsCIPK6與AtCIPK14、NsCIPK3與AtCIPK7及AtCIPK14、NsCIPK2與AtCIPK6、NsCIPK1與AtCIPK15、NsCIPK4與AtCIPK2及AtCIPK10均為高度同源。整體看來，西伯利亞白刺NsCIPKs家族與單子葉植物水稻進化樹距離遠，與雙子葉植物胡楊與擬南芥存在于同一亞族。說明該西伯利亞白刺該家族鹽脅迫響應基因的分化選擇可能出現于單雙子葉植物分化后。

2.3 不同濃度鹽處理下西伯利亞白刺不同組織中NsCIPKs表達水平

進一步利用實時熒光定量PCR分析了各家族成員在不同鹽脅迫下的時空表達模式，并進行可視化。如圖3，根部不同鹽濃度處理下，隨著鹽脅迫時間增加，8個基因相對表達量均出現變化，尤以 NsCIPK1與 NsCIPK7在所有時間段相對表達量持續變化。200 mmol/L鹽處理下， NsCIPK1、 NsCIPK2、 NsCIPK3、 NsCIPK5、 NsCIPK7及 NsCIPK8呈先升高后降低的趨勢，達到峰值后逐漸降低，相對表達量峰值出現在 12 h與24 h。400 mmol/L鹽處理下， NsCIPK1、 NsCIPK4、 NsCIPK5、 NsCIPK7、 NsCIPK8呈先升高后降低再升高的趨勢，相對表達量峰值大都出現在6 h與24 h，早于200 mmol/L鹽處理。

如圖4，莖部不同鹽濃度處理下，隨著時間增加，8個基因相對表達量出現變化，且 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8相對表達量在所有時間均發生變化， NsCIPK8相對表達量均呈先升高后降低的趨勢，NsCIPK6呈降低趨勢。200 mmol/L鹽處理下 NsCIPK1、 NsCIPK2、 NsCIPK3、 NsCIPK4、 NsCIPK5、 NsCIPK7相對表達量呈先升高后降低再升高的趨勢，并于第1次升高時表達量達到峰值，大都出現在6 h。400 mmol/L鹽處理下， NsCIPK2、 NsCIPK3、 NsCIPK5、 NsCIPK7、 NsCIPK8呈先升高后降低的趨勢， NsCIPK8變化峰值出現早于200 mmol/L鹽 處理。

如圖5，在葉中隨著鹽脅迫時間增加，僅 NsCIPK3、 NsCIPK5、 NsCIPK7與 NsCIPK8四個基因相對表達量在12 h出現不同程度上升，其余整體均呈下降趨勢，200 mmol/L鹽處理下峰值出現于12 h，400 mmol/L鹽處理下相對表達量峰值大都出現在48 h，尤以 NsCIPK3基因表達持久，但莖部不同處理下相對表達量變化情況均弱于根部與莖部表達。

結果顯示不同NsCIPKs基因在不同濃度鹽處理下表達模式存在差異，集中在根部與莖部 表達。

2.4 鹽脅迫響應NsCIPKs編碼蛋白序列比對

通過不同濃度鹽處理下西伯利亞白刺不同組織中NsCIPKs表達水平研究，篩選出 NsCIPK1、 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8這4個耐鹽相關重要CIPK基因。經多序列比對（圖6），本研究鑒定的鹽脅迫相關西伯利亞白刺CIPK基因N端均包含有AMPKA激活結構域，C端存在NAF特征結構域，為典型CIPK家族成員，且不同基因編碼蛋白在443～462 aa，后續需通過構建鹽脅迫cDNA文庫對這些基因進行克隆并具體分析其功能。

3 討" 論

鈣離子調控途徑作為一種應對脅迫的重要反饋機制，在植物響應各種脅迫時發揮重要作用。作為典型稀鹽鹽生植物，西比利亞白刺對鹽脅迫的響應機制的解析無疑為鹽生植物的耐鹽途徑研究提供重要參考。國家林業和草原局鹽堿地中心耐鹽堿植物育種團隊前期基于轉錄組共鑒定到全長大約214～262個氨基酸的CBL基因7個，與擬南芥（10個）、水稻（10個）、玉米（Zea mays，12個）、植物棉（Gossypiumar soreum，13個）、雷蒙地棉（Gossypium" raimondii，13個）、祖先二倍體棉（Gossypium arSoreum，22個）^[13]、毛果楊（Populus triShoSarpa，10個）、菠蘿（Ananas somosus，8個）、葡萄（Vitis vinifera，8個）、茄子（Solanum melongena L，5個）、胡楊（10個）相比，西伯利亞白刺無論是在個數、長度和結構均與已鑒定的CBL相似，這表明西伯利亞白刺的CBL表達較為穩定，在鹽脅迫或滲透壓脅迫初期甚至是無脅迫的情況下均有一定的表達，后續對其中NsCBL5進行了功能分析，證實了其確實參與耐鹽調節。本研究中鑒定到8個西伯利亞白刺CIPK基因，與擬南芥（26個）、水稻（33個）^[22]、菠蘿（21個）^[23]、葡萄（20個）^[24]、蘋果（34個）^[14]、茄子（15個）^[25]的長度和結構相似，但個數差異明顯，推測與生物進化，mRNA降解或僅獲得轉錄功能蛋白有關，而這些篩選結果正好說明了這些基因對短期鹽脅迫響應較強，可能發揮了重要作用。

研究表明不是所有CBL-CIPK途徑都與耐鹽相關，如CBL9-CIPK1，CBL1-CIPK1均證實參與干旱脅迫^[26]，CBL9-CIPK3被證實參與ABA調控^[27]，CBL9/CBL1與CIPK26被證實參與ROS途徑^[27]，有意思的是，這些CBL在其他研究中被證明與其他CIPK結合參與鹽脅迫的調控，如CBL9-CIPK23結合參與鉀離子通道HAK5的調節^[28]。由此可見，CBL的個數及表達量在各個物種中均較為穩定，而CIPK卻表達差異較大，究其原因是大多數CBL均參與鹽脅迫，接受不同的鈣信號后激活相應的下游CIPK并對脅迫進行調控。因此，采用轉錄組測序的方式可以鑒定出一些對鹽響應具有較強響應能力的家族基因，代表了基因家族中幾乎全部的鹽脅迫響應 基因。

生物信息學分析發現：雖然8個NsCIPKs蛋白理化性質有差異，但均為堿性穩定親水蛋白，定位于細胞核。同時，鑒定出的家族基因編碼蛋白系統進化樹與保守基序分析發現：8個NsCIPKs蛋白均NAF蛋白激酶結構域及與AMPK互作的結構域，屬于典型的CIPK家族蛋白，推測行使的生物學功能也基本相似。通過與擬南芥，水稻及其他已驗證響應鹽脅迫的CIPK蛋白構建進化樹，西伯利亞白刺均能較好分組，基因功能研究可參考進化樹其同簇他物種成員進行作為鹽生植物，西伯利亞白刺能夠在15" g/kg（約256" mmol/L）以上的鹽濃度正常生長，200 mmol/L鹽脅迫甚至有促進生長的作用，但這個濃度卻限制了大多數甜土植物的生長^[4，29-30]，此外，400 mmol/L的鹽濃度被證實為明顯抑制西伯利亞的生長^[13]，采用這兩個濃度作為脅迫濃度可更好的對比不同鹽處理下8個NsCIPKs成員表達情況。通過對200 mmol/L與400 mmol/L鹽處理下西伯利亞白刺的8個基因進行qRT-PCR分析，結果顯示：鑒定的西伯利亞白刺CIPK基因在不同的時間及脅迫下表達量差異明顯，主要在根與莖中表達，且大多數對高鹽脅迫更為敏感，這與植物在不同時間及不同鹽濃度需要響應的不同脅迫相關，進一步說明在西伯利亞白刺鹽脅迫響應中，NsCIPKs家族基因發揮著重要的調控作用，且該家族對鹽脅迫的反應是復雜的，具有組織特異性。

在不同物種鑒定的CIPK中，擬南芥^[31]、胡楊^[32]及番茄的" CIPK24^[33]，蘋果中的" MdCIPK24 NsCIPK1與 NsCIPK7，莖部為 NsCIPK3、 NsCIPK7與 NsCIPK8，葉中為 NsCIPK3，4個基因編碼蛋白長度相似。后續可通過對篩選出的4個基因進行克隆與功能分析驗證，研究西伯利亞白刺的鹽脅迫響應機制，進一步豐富耐鹽植物新品種基因庫。

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Identification and" Expression Level Analysis of Nitraria sibirica NsCIPKs in Response to Salt Stress

HUANG Anying^1，2，3，YAN Qing^1，2，4，YANG Xiuyan^1，2，ZHANG Huilong^1，2" and ZHANG Huaxin^1，2

（1.The Comprehensive Experimental Center of Chinese Academy of Forestry in Yellow River Delta，Dongying Shandong 257500，China; 2.Institute of Ecological Conservation and Restoration，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China;

3.Research Institute of Fast-growing Trees，Chinese Academy of Forestry，Zhanjiang Guangdong 524300，China;

4.Zhanjiang Experimental Station，Chinese Academy of" Tropical Agricultural" Sciences，Zhanjiang" Guangdong 524013，China）

Abstract Ca²⁺，as a universal second messenger，can quickly transform external stress into signal transduction within cells.The CBL interacting" protein" kinase （CIPKs） represent a pivotal component in this calcium signaling pathway.The transcriptome of Nitraria sibirica" treated with salt stress was used to identify the members of NsCIPKs family in response to salt stress，and verify the expression levels using the real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） method. The results showed the presence of eight NsCIPK genes responsive to salt stress，encoding basic hydrophilic proteins located in the nucleus. Despite differences in their physicochemical properties，these genes displayed conserved structures.Phylogenetic tree analysis classified the eight NsCIPKs into four groups across six subfamilies，indicating that the differentiation of NsCIPKs occurred after the differentiation of monocotyledonous and dicotyledonous plants. Tissue-specific expression analysis indicated a preference for roots and stems under salt stress. NsCIPK1 and" NsCIPK7 exhibited high expression levels in roots，indicating a prolonged and rapid response to salt stress， in contrast， NsCIPK3， NsCIPK7，and NsCIPK8 were predominant in stems，while" NsCIPK3 showed preferential expression in leaves. This study provides theoretical and practical references for exploration of genes in Nitraria sibirica.

Key words Salt stress; CIPK; Nitraria sibirica; Expression analysis

Received" 2024-01-04""" Returned 2024-02-06

Foundation item Special Fund for Scholars" of the Yellow River Delta（No.2020）; the National Natural Science Foundation of China（No. 31770640）.

First author HUANG" Anying，female，master，assistant research fellow.Research area：forest genetic breeding，genetic foundation and functional gene. E-mail： 2319486242@qq.com

Corresponding"" author ZHANG" Huaxin，male，Ph.D，research fellow.Research area：breeding of saline-alkali tolerant plants and biological treatment of saline-alkali land.E-mail：zhanghx1998@126.com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）

基金項目：黃河三角洲學者專項經費資助項目（2020）；國家自然科學基金（31770640）。

第一作者：黃安瀛，女，碩士，助理研究員，研究方向為林木遺傳育種、遺傳基礎與功能基因研究。E-mail：2319486242@qq.com

通信作者：張華新，男，博士，研究員，研究方向為耐鹽堿植物選育與鹽堿地生物治理。E-mail：zhanghx1998@126.com