少孢節叢孢菌響應幾丁質誘導的mRNA表達譜特征分析

摘 要 少孢節叢孢菌（Arthrobotrys oligospora，AO）是一種重要的捕食線蟲性真菌，具有防控動物線蟲病的潛在應用前景。為了探究AO 侵染線蟲的分子機制，擬對幾丁質誘導的AO和未誘導的AO菌絲進行mRNA轉錄組學測序和驗證，利用GO和KEGG富集方法分析探究AO差異表達基因（DEGs）及其參與的代謝過程和關鍵信號通路，分析差異表達基因在AO響應幾丁質誘導mRNA表達譜特征。結果顯示，AO 響應幾丁質誘導后，共有2 904個DEGs，其中1 376個上調，1 528個下調；RT-qPCR結果顯示，挑選的6個DEGs表達變化趨勢與測序結果一致；GO分析發現，細胞代謝過程、碳水化合物代謝過程、氮化合物代謝過程等差異明顯；KEGG分析顯示，DEGs主要參與真核生物核糖體的生物發生、果糖和甘露糖代謝、幾丁質酶基因、C源和N源吸收途徑、信號傳導、細胞壁合成及捕食器官形成等信號通路。該研究探究AO響應幾丁質誘導的mRNA表達譜特征分析，為深入揭示少孢節叢孢侵染線蟲的分子機制奠定前期研究基礎 。

關鍵詞 少孢節叢孢菌；轉錄組學；幾丁質；差異基因

線蟲是一種假體腔多細胞原生動物，屬于線蟲動物門，根據寄主的差異可將寄生線蟲分成植物寄生線蟲和動物寄生線蟲。植物寄生線蟲和動物寄生線蟲每年都給中國農業生產帶來了巨大的經濟損失^[1]。據2019年新疆動物疫病調查，綿羊線蟲感染率為100%，其中以毛圓線蟲、血矛線蟲、細頸線蟲、奧斯特線蟲、馬歇爾線蟲、毛尾線蟲等屬的線蟲為主^[2]。線蟲可以消耗家畜的營養、對腸道造成機械性損傷而降低飼料報酬，導致家畜生長緩慢、消瘦，畜產品的產量、質量下降，嚴重的甚至會導致家畜的死亡。每年僅因線蟲病的問題就給新疆養羊業帶來了巨大的經濟損失。

少孢節叢孢菌（Arthrobotrys oligospora， AO）是一類典型的食線蟲真菌。2011年，Yang等^[3]研究了捕食線蟲真菌AO并對其完成了全基因組測序，使其成為研究捕食線蟲性真菌的參考物種。AO能以腐生生活方式和捕食生活方式生存，在其生活環境中沒有線蟲時以腐生生活方式生存，而當AO環境中有線蟲時會產生三維菌網來捕食線蟲^[4-5]。捕食線蟲性真菌在其整個生長過程中都會產生多種胞外分泌性蛋白酶（如絲氨酸蛋白質酶、幾丁質酶等）。在這些蛋白酶中，幾丁質酶在真菌捕食線蟲時發揮重要作用^[6-7]。

幾丁質是一種線形高分子聚合物，由Ｎ-乙酰-Ｄ氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成，該聚合物是線蟲體表和卵殼的重要組成成分，對線蟲具有重要的保護作用，同時，線蟲體表的幾丁質可將角質層附著在表皮細胞上，支持線蟲肌肉附著和運動。因此，在侵染線蟲過程中，AO利用其表達的幾丁質酶突破線蟲體表的幾丁質，然后將其作為為捕食線蟲真菌提供重要的碳源和氮源^[8-9]。然而，AO響應幾丁質誘導的mRNA表達譜特征及幾丁質酶表達調控的分子機制至今尚未深入研究。鑒于此，本研究對幾丁質誘導的AO和未誘導的AO菌絲進行mRNA轉錄組學測序，并利用GO和KEGG富集方法分析探究AO差異表達基因，為探究少孢節叢孢侵染線蟲的分子機制提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

AO XJ2菌株由石河子大學預防獸醫實驗室分離、鑒定和保存。大豆蛋白胨和幾丁質購自北京索萊寶科技有限公司、TRIZOL購自英濰捷基有限公司；DEPC 和RT-qPCR試劑盒購自全式金生物技術有限公司。

1.2 引物

根據GenBank登錄的AO基因組序列（登錄號：ATCC24927），利用Primer 5.0軟件設計相關基因的引物，送北京華大基因公司合成（表1）。

1.3 AO分生孢子的培養

取AO XJ2分生孢子接種于玉米粉瓊脂培養基上，置 27 ℃溫箱中培養5 d使菌絲布滿培養皿。切取上述培養的0.5 mm×0.5 mm帶有菌絲的瓊脂塊5～10小塊，放入玉米粒分生孢子培養三角瓶中，25 ℃避光培養21 d，然后用滅菌蒸餾水渦旋振蕩洗脫分生孢子，血球計數板計數后4 ℃冰箱保存，備用。

1.4 AO菌絲的幾丁質誘導培養

切取玉米粉瓊脂培養基上帶有菌絲的瓊脂塊接種于含有0.2%幾丁質的玉米粉瓊脂培養基和普通玉米粉瓊脂培養基上，置 27 ℃溫箱中培養。接種AO分生孢子于0.5%的大豆蛋白胨液體培養基中，使其孢子終濃度為每升1×10⁷個培養基，25 ℃培養5～7 d。當菌絲產生時，加入配制的膠體幾丁質，25" ℃誘導培養24 h。分別取幾丁質誘導前和誘導后的培養液用4層滅菌濾紙或擦鏡紙過濾，收集菌絲（誘導組命名為AO-e、未誘導組命名為AO-c），用滅菌蒸餾水清洗，4 ℃保存，備用。

1.5 誘導前后AO菌絲的RNA提取與測序

將幾丁質誘導前和誘導后的AO菌絲中分別加入液氮，在研缽中迅速研磨，充分勻漿后分別用TRIZOL進行總RNA的提取。用70%乙醇洗滌RNA沉淀，真空干燥后溶解于焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的ddH₂O中，送質檢合格的RNA至百邁客生物公司進行轉錄組測序。

1.6 轉錄組數據驗證

以cDNA為模板，選取6個差異表達基因（DEG）對分析結果進行RT-qPCR驗證，每個樣品重復3個，試驗重復3次，以 "U6基因作為內參，所得數據用2^-ΔΔCt計算分析^[10]。

1.7 AO幾丁質誘導mRNA轉錄組學數據分析

采用Illumina高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序。對數據采取去除含有接頭的Reads，去除低質量的Reads（包括去除N的比例大于10%的Reads，去除質量值Q≤10的堿基數占整條Read的50%以上的Reads）等處理后以FASTQ格式進行存儲。利用表達定量軟件RSEM分別對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析，定量指標為FPKM。基因表達量分析獲得基因的Read Counts數后，采用edgeR 軟件進行差異分析。將差異倍數FC（Fold Change≥2）且錯誤發現率（False discovery rate，FDR）lt;0.01 作為篩選標準。鑒定出幾丁質誘導AO差異基因，進而研究差異基因的功能。

1.8 GO和KEGG富集分析

采用軟件Goatools對基因進行GO富集分析，從而獲得該基因集中的基因主要具有哪些GO功能。Pathway顯著性富集分析以KEGG數據庫中Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的Pathway。通過Pathway顯著性富集能確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑，采用Cytoscape對顯著性q value最小的前20個通路進行網絡圖可視化。

1.9 數據分析

采用SPSS 25軟件進行統計學分析。使用方差分析比較連續變量，卡方檢驗分析分類變量，數據表示為平均值±標準差（SD），統計學上Plt; 0.05被認為差異顯著，Plt;0.01被認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 AO菌絲培養及RNA的提取

AO在幾丁質誘導下生長情況良好，但AO-e和AO-c菌絲形態、產孢量、分生孢子形態無顯著差異。然而，AO-e組在秀麗隱桿線蟲的誘導下產生的捕食器官顯著高于對AO-c組（圖1）。利用NanoDrop2000超微量分光光度計對其濃度和純度進行分析顯示，總RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀為2.18，RNA濃度≥100 ng/μL，表明RNA質量符合測序要求。

2.2 RNA-seq測序質控分析

對幾丁質誘導的AO-e和AO-c菌絲的轉錄組測序獲得的Clean" read進行質控分析（表2）。各樣品Q30堿基百分比均不小于92.65%，表明轉錄組測序結果可信。

2.3 差異基因mRNA表達分析

采用軟件RSEM對基因的表達水平進行定量分析顯示，AO幾丁質誘導及正常菌絲大部分基因的表達位于同一水平，僅有個別基因表達量過高或過低（圖2-A）。edgeR 軟件進行差異分析，以 Fold Change≥2且FDRlt;0.01 作為篩選標準，篩選出差異基因2 904個，其中幾丁質誘導后上調基因1 376個，下調基因1 528個（圖 2-B）。

2.4 轉錄組數據驗證結果

為了驗證轉錄組學的可靠性，根據功能類別，分別挑取了6個基因（ "AOL_s00210g51、 AOL_s00054g446、 AOL_s00004g610、 AOL_s00080g371、 AOL_s00091g31、 AOL_s00215g507），通過RT-qPCR檢測其表達量是否與轉錄組一致。RT-qPCR結果顯示，盡管6個基因的變化倍數與測序結果有所不同，但其變化趨勢是一致的（圖3）。

2.5 GO富集分析

GO功能顯著性富集分析顯示，在幾丁質誘導下，下調基因主要參與核糖體核糖核酸處理（20個基因）、細胞代謝過程（30個基因）、代謝過程（30個基因）、有機物代謝過程（29個基因）、碳水化合物代謝過程（26個基因）、氮化合物代謝過程（26個基因）；上調基因主要包括碳水化合物代謝過程（26個基因）、生物過程調控（19個基因）、生物調節（19個基因）、細胞過程的調節（18個基因）、代謝過程（18個基因）（圖4）。

2.6 KEGG富集分析

KEGG通路富集分析顯示，誘導菌株中有103條通路下調和101條通路上調，其中差異基因主要參與氨基酸的生物合成（14個基因上調、36個基因下調）、真核生物核糖體的生物發生（4個基因上升、30個基因下調）、果糖和甘露糖代謝（17個基因上升、1個基因下調）、氨酰基tRNA生物合成（4個基因上調、18個基因下調）、檸檬酸循環（1個基因上調、5個基因下調）（表3）。顯著性q value最小的前20個通路中，氮代謝、氨基酸的生物合成、真核生物中的核糖體的生物發生等顯著差異最為明顯（圖5）。其中，幾丁質酶基因、C、N源吸收途徑、信號傳導、細胞壁基因、捕食能力等基因表達差異顯著（表4）。轉錄組測序結果表明，在幾丁質的誘導下，幾丁質酶基因 "gene-AOL_s00091g31、 gene-AOL_s00215g801上調，主要參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑和代謝幾丁質途徑。此外， 在幾丁質的誘導下，SNF1活化激酶1、自噬相關蛋白11、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RIM15、肌微管蛋白相關蛋白6/7/8、Ras相關蛋白Rab-7A、溶質載體家族36基因均上調；碳分解代謝產物減壓蛋白激酶基因下調。

3 討" 論

AO是目前研究最深入的捕獲線蟲性真菌（NTFs）之一，也是研發防控動物寄生線蟲生物制劑的主要真菌^[11-12]。在捕獲線蟲時，NTF會分泌大量的蛋白酶，如幾丁質酶、絲氨酸蛋白酶等，在真菌中，幾丁質酶有自溶、營養和形態發生作用，通常被認為與真菌病有關。AO的幾丁質酶在感染線蟲中起關鍵作用，幾丁質酶可分解線蟲體表的幾丁質以達到殺害線蟲的作用^[13-14]。

絲狀真菌的幾丁質酶可分為四個分支（I、II、III和IV）。 "AO492（ AOL_s00006g492）、 "AO31（ AOL_s00091g31）、 "AO801（ AOL_s00215g801）基因為同一個分支，其中 "AO801、 "AO492沒有信號肽且都位于細胞質中^[15]，Yang等^[16]研究表明幾丁質酶 "AO801在幾丁質為底物或植物病原真菌存在下上調，與本研究一致。本研究在低營養的條件下以膠體幾丁質誘導，結果表明幾丁質酶大部分下降， "AO31、 "AO801顯著上調，表明 "AO31、 "AO801可能是攝取外源幾丁質的主要 基因。

為了適應復雜的生長環境，絲狀真菌在不存在較優碳源或氮源的環境中，可抑制較優碳源或氮源攝取和分解代謝相關基因的轉錄，并通過上調幾丁質酶相關基因的表達，從而為捕食線蟲真菌提供充足的碳源和氮源^[17-18]。在酵母中， "Snf1（哺乳動物中的AMPK）是對低葡萄糖可用性反應的主要調節因子，在缺乏葡萄糖（或果糖）時 "Snf1可調節細胞的代謝和信號通路，以允許利用替代碳源（如半乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、乳酸、乙醇、乙酸鹽或脂肪酸）^[19-21]。此外，在酵母中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶協調葡萄糖分配以響應代謝和細胞完整性信號，參與細胞的生長、增殖過程^[22]。本研究中幾丁質誘導后，AO酵母自嗜能力相關基因（ "Snf1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）表達上調，且AO捕食器官顯著增多。說明幾丁質為AO提供了碳源，促進了AO的生長。

缺乏谷氨酸脫氫酶的酵母細胞表現出對熱應激和氧化應激的敏感性，可導致細胞死亡。Mara等^[23]研究發現，谷氨酸脫氫酶基因在富含葡萄糖中下調，在不可發酵的碳源和氨基酸作為氮源下上調。有研究表明，AO在酸性環境下生長速率更快、捕食能力更強^[24]。硝酸還原酶、亞硝酸鹽轉運蛋白家族、甲酰胺酶、氰化物基因的下調可能促進了真菌對氨的釋放。在氨的存在下，AO可以改變其生活方式，從腐生性轉變為肉食性，在這一轉變過程中其捕食性相關基因明顯上調^[25]。本研究證實，在幾丁質誘導下氮代謝基因的表達發生了顯著的變化，促進了AO氨的釋放及吸收，進而轉變AO的生活方式。硝酸單加氧酶、谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合成酶分別顯著上調，硝酸還原、亞硝酸鹽轉運蛋白家族、甲酰胺酶、氰化物則明顯下調。磷脂酰肌醇信號系統廣泛存在于生物體中，當外界環境發生改變時，胞外信號需要通過第二信使傳入細胞內，從而引起相應的細胞生理生化反應^[26-27]。本研究結果提示，幾丁質誘導后少孢節從孢菌信號傳導、細胞分泌等相關基因的表達明顯上調，表明AO在幾丁質誘導下新陳代謝更為迅速。

4 結" 論

本研究采用轉錄組測序分析AO響應幾丁質誘導的mRNA表達譜特征，證實了幾丁質誘導下AO幾丁質酶、 "Snf1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、氮代謝等基因表達差異顯著，提示這些DEGs在AO捕獲線蟲過程中為AO做出快速的新陳代謝發揮著重要生物學功能，為后續深入研究幾丁質響應基因的作用分子機制奠定了研究基礎。

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Analysis of mRNA Expression Profiles in Response to Chitin Induction in Arthrobotrys oligosporum

LI Ningxing¹，SUN Dianming¹，ZHANG Huimei¹，SUN Yansen¹，LI Ruobing¹，MENG Qingling¹，QIAO Jun¹ and" CAI Xuepeng²

（1.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi"nbsp; Xinjiang 832003，China;

2.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China ）

Abstract Arthrobotrys oligospora（AO） is an important nematode-trapping fungus with potential application in the prevention and control of animal nematodiasis.To explore the molecular mechanism of AO infection in" C.elegans，mRNA transcriptomics sequencing and verification were performed on chitin-induced AO and uninduced AO hyphae.GO and KEGG enrichment analyses were used to explore AO differentially expressed genes （ DEGs ） and their associated metabolic processes and signaling pathways in response to chitin induction.This study analyzed the characteristics of AO’s differential gene expression profile in response to chitin induction.The results showed 2 904 DEGs in AO responding to chitin induction，with 1 376 up-regulated and 1 528 down-regulated genes.The results of RT-qPCR showed that the expression patterns of six DEGs were consistent with the sequencing results.GO analysis showed that there were significant differences in cell metabolic process，carbohy" drate metabolic process and nitrogen metabolic process.KEGG analysis showed that DEGs were mainly involved in eukaryotic ribosome biogenesis，fructose and mannose metabolism，chitinase genes，C source and" N" source absorption pathways，signal transduction，cell wall synthesis and predatory organ formation.This study elucidated the characteristics of AO response to chitin-induced mRNA expression profile，and laid a foundation for further investigations into the molecular mechanism of Arthrobotrys oligospora infection in nematodes.

Key words Arthrospora oligospora; Transcriptomics; Chitin; Differential genes

Received" 2024-01-05""" Returned 2024-02-06

Foundation item National Natural Science Foundation of China（No.32260888，No.32060801） ;Graduate Research and Innovation Program of Xinjiang Autonomous Region（No.XJGRI2015038）.

First author" LI Ningxing，male，master" student.Research area：animal parasitology.E-mail：2267382571@qq.com

Corresponding"" author MENG Qingling，female，Ph.D，professor.Research area：animal parasitology.E-mail：xjmqlqj@163.com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）

基金項目：國家自然科學基金（32260888，32060801）；新疆自治區研究生科研創新計劃項目（XJGRI2015038）。

第一作者：李檸杏，男，碩士研究生，研究方向為動物寄生蟲學。E-mail：2267382571@qq.com

通信作者：孟慶玲，女，博士，教授，研究方向為動物寄生蟲學。E-mail：xjmqlqj@163.com