球毛殼菌發酵濾液對松樹蜂共生真菌的抑菌活性

摘 要 探究樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）內生真菌球毛殼菌（Chaetomium globosum）發酵濾液對重大入侵害蟲松樹蜂（Sirex noctilio）共生真菌網隙裂粉韌革菌（Amylostereum areolatum）的抑制作用，篩選抑菌能力較強的差異代謝產物，有效防治松樹蜂。首先對球毛殼菌發酵濾液抑菌活性進行測定，然后從代謝組學角度對球毛殼菌中潛在的抑菌物質進行篩選。結果表明，球毛殼菌發酵濾液可以完全抑制松樹蜂共生真菌A.areolatum的菌絲生長，且抑菌活性穩定，不受儲存時間、紫外線和溫度的影響。共篩選出球毛殼菌發酵濾液差異代謝產物213種，其中潛在的抑菌物質15種，包括異阿魏酸、香草酸、大麻二酚、甘氨酸、大黃素、丹皮酚、4-胍基丁酸、隱綠原酸、苯并呋喃、4-羥基苯甲酸、綠原酸、琥珀酸、4-甲氧基肉桂酸、龍葵素和二甲喹唑啉C。差異代謝產物的KEGG富集分析中ABC轉運蛋白、檸檬酸循環（TCA循環）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、氨基苯甲酸鹽降解丁酸代謝和C₅支鏈二元酸代謝顯著富集。研究表明，球毛殼菌發酵濾液能夠抑制松樹蜂共生真菌網隙裂粉韌革菌的菌絲生長，且抑菌活性穩定，并篩選得到球毛殼菌發酵濾液的潛在抑菌物質。

關鍵詞 松樹蜂；球毛殼菌；共生真菌；代謝組學；差異代謝產物

松樹蜂（Sirex noctilio）隸屬于膜翅目（Hymenoptera）樹蜂科（Siricidae）樹蜂屬（Sirex），是一種國際重大林業檢疫性害蟲，于2013年在我國黑龍江省杜蒙縣首次發現，對樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）造成巨大危害^[1]。有別于一般鉆蛀性害蟲僅直接鉆蛀樹木造成危害，樹蜂屬昆蟲能與淀粉韌革菌屬（Amylostereum）真菌互利共生、協同致害寄主樹種^[2]。共生真菌可為樹蜂幼蟲生長發育提供必不可少的營養物質，如果共生真菌在寄主植物內生長受阻，樹蜂幼蟲也將發育不良，甚至死亡。研究發現，松樹蜂的共生真菌為網隙裂粉韌革菌（Amylostereum areolatum）^[3]，是一種致病力較弱的白腐真菌，可降解寄主樹木的木質纖維素，以便于松樹蜂幼蟲在寄主內取食生長^[4]。

昆蟲與共生真菌復合危害寄主的同時，寄主樹種自身微環境會對昆蟲及其共生菌產生抗性^[5]。樹木的內生真菌是指其生活史的某一階段或者全部階段生活在樹木組織內，不會引起宿主明顯病變癥狀的真菌。前期研究發現，一些寄主樹木的內生真菌能夠影響昆蟲與共生真菌的互利共生關系。閆鵬勇等^[6]研究發現，落葉松（Larix gmelinii）韌皮部的內生真菌輪枝孢（Pochonia bulbillosa）和油松（Pinus tabuliformis）韌皮部的內生真菌瓶頭霉屬真菌（Phialocephala sp.）對紅脂大小蠹（Dendroctonus valens）共生真菌長梗細帚霉（Leptographium procerum）、小長喙殼（Ophiostoma minus）、齒小蠹蛇口殼（O.ips）和多孢多穴腔菌（Sydowia polyspora）均有顯著的抑制效果，進而影響紅脂大小蠹的生長發育。有研究^[7-8]發現，松樹蜂寄主樟子松的內生真菌可以通過抑制共生真菌A.areolatum的菌絲生長而間接影響松樹蜂幼蟲的生長發育，如大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）、綠色木霉（Trichoderma viride）、深綠木霉（T.atroviride）、哈茨木霉（T.harzianum）、松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）、球毛殼菌（Chaetomium globosum）和小長喙殼（O.minus）等。其中綠色木霉和大伏革菌菌絲可通過纏繞、寄生或穿插生長在A.areolatum菌絲上，最終完全覆蓋共生菌菌落，導致共生真菌無法生長而死亡^[9]；球毛殼菌菌絲與 A.areolatum菌絲能夠相互抑制。進一步研究發現，球毛殼菌發酵濾液可完全抑制A.areolatum的菌絲生長，抑制率為100%；且其余內生真菌發酵濾液也對A.areolatum有不同程度的抑制作用^[7]，故本研究選取對A.areolatum抑菌能力極強的球毛殼菌發酵濾液進行代謝組學分析。

代謝組學是轉錄組學和蛋白質組學的延伸，對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統生物學的組成部分^[10-11]。球毛殼菌作為植物內生真菌，它的差異代謝物種類較多，主要有生物堿、有機酸、酚類等化合物，具有抑菌特性^[12-13]。因此，本試驗首先研究了球毛殼菌發酵濾液的抑菌活性，其次從代謝組學角度篩選抑制松樹蜂共生真菌的化學物質，探究寄主樟子松對松樹蜂的抗性機制，也為內生真菌的后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2種供試內生真菌球毛殼菌（C.globosum）和大伏革菌（P.gigantea）分離自黑龍江省鶴崗市峻德林場的健康樟子松干部組織，鑒定后保存于甘肅農業大學植物保護省級重點實驗室。

松樹蜂采集于黑龍江省鶴崗市峻德林場，共生真菌網隙裂粉韌革菌（A.areolatum）分離自松樹蜂雌成蟲貯菌囊。

1.2 球毛殼菌發酵濾液的活性測定

內生真菌發酵濾液的制備^[14]：將球毛殼菌接種于直徑9 cm PDA（葡萄糖3 g，馬鈴薯30 g，瓊脂3 g，蒸餾水150 mL）平板上25" ℃活化7 d后，在無菌條件下用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。將菌餅接種至含有150 mL PDB（葡萄糖3 g，馬鈴薯30 g，蒸餾水150 mL）發酵培養基的錐形瓶中，每個錐形瓶接種5個菌餅。于 25" ℃，180 r/min至于搖床中培養14 d后，得到的培養液以5 000 r/min離心10 min取上清液，并經過0.22 μm的微孔濾膜真空抽濾，收集發酵濾液。取發酵濾液原液20 mL用無菌水定容至100 mL，4" ℃保存備用。以相同方法制備了大伏革菌發酵濾液，用于球毛殼菌代謝組分析的對 照組。

將收集到的球毛殼菌發酵濾液，分別在285 nm波長（UV-B）的紫外線條件下照射15 min、30 min及45 min；60 ℃和100 ℃高溫水浴條件分別加熱15 min、30 min及45 min；以及4 ℃低溫貯藏15 d、30 d及45 d。將經過上述處理的球毛殼菌發酵濾液分別與PDA培養基（50" ℃）按1∶9的比例混合后制作平板，對照組加入等量PDB代替發酵濾液與PDA培養基混合。然后用直徑5 mm的打孔器在已培養7 d的共生菌A.areolatum菌落邊緣打取菌餅，將菌餅的菌絲面朝下接種于培養基平板中心處。每個處理重復3組， 25" ℃恒溫培養15 d。采用十字交叉法測量對照組和處理組菌落直徑，并計算抑制率。

抑制率（p）=（C-T）/C×100%

p：抑制率；C：對照組中A.areolatum的菌落直徑；T：處理組中A.areolatum的菌落直徑。

1.3 內生真菌發酵濾液代謝組學分析

1.3.1 代謝物的提取

將球毛殼菌發酵濾液和大伏革菌發酵濾液分別取20 μL，加入120 μL 50%甲醇提取代謝物，將其震蕩混勻，常溫儲存靜置10 min；提取－20" ℃過夜，沉淀樣本中的蛋白質；4 000 g離心20 min吸取上清。所有代謝樣本保存于－80" ℃冰箱中，用于液相色譜—質譜聯用儀（LC-MS）分析。每種內生真菌設置6次生物學重復。

1.3.2 內生真菌發酵濾液液相特征分析

數據采集所用到的液相體系為超高壓液相SCIEX（UK公司）。所用的色譜分析柱型號規格為ACQUITYUPLCT3（100 mm×2.1 mm，1.8" μm，Waters，UK）。采用的流動相為A相：水（1%甲酸）；B相：乙腈（1%甲酸）。液相梯度設置為：0～0.5 min，5% B；0.5～7 min，5%～100% B；7～8 min，100% B；8～8.1 min，100%～5% B；8.1～10 min，5% B。采集時，柱溫設置為35" ℃，流速為0.4 mL/mL。

1.3.3 內生真菌發酵濾液質譜特征分析

離子源的遮蔽氣壓為2.07×10⁵ Pa，源溫度650" ℃。正離子模式時電壓為5 000 V，負離子模式時為-4 500 V。數據采集模式為IDA（信息依賴性采集）模式。質譜儀檢測器有4個通道，脈沖射頻電的頻率為11 kHz；檢測器的檢測頻率為40 GHz；每次掃描的粒子信號以4個通道分別記錄共4次后合并轉化成數據。在采集過程中，每間隔20個樣本校正1次儀器的精度。同時，每間隔10個樣本掃描1次質控（Quality control，QC）樣本（一種特殊樣本，從每個待測樣本中取相同體積的提取物混合）。在整批測試中，QC間的質量差距被用來糾正系統誤差。

1.3.4 內生真菌發酵濾液多元統計分析

對于樣本質譜峰的響應強度，使用峰面積歸一化法來進行規格化，得到歸一化的數據矩陣，將數據矩陣導入SIMCA-P+14.0軟件包，并給出用主成分分析（Principal component" analysis，PCA）與偏最小二乘判別分析（Partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）結果，來區分各組間代謝輪廓的總體差異，尋找組間差異代謝物。PLS-DA分析中，變量權重值（Variable important in projection，VIP）大于1的變量被認為是差異 變量。

1.3.5內生真菌代謝物注釋分析

通過杭州聯川生物云平臺In-House數據庫鑒定的所有代謝物與KEGG數據庫進行比較，獲得數據庫注釋信息，將代謝物與KEGG Compound數據庫比對，獲得分類信息和KEGG功能通路。

1.3.6 差異代謝物篩選及代謝通路分析

采用t檢驗結合PLS-DA分析方法，篩選內生真菌差異代謝物（同時滿足VIP≥1.0、q≤0.05和FC≥2.0或FC≤0.5）。通過比較KEGG Compound、HMDB和LIPID MAPS數據庫，尋找差異代謝物的KEGG ID，再進行代謝通路注釋和富集分析，獲得代謝通路圖，并分析通路功能。

1.4 數據分析

統計分析軟件使用SPSS 23.0。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對抑制率進行分析，多重比較使用Tukey HSD檢驗法。代謝產物數據分析在Excel 2019中進行，并計算相應的統計學參數，代謝組分析在杭州聯川生物云平臺上完成。

2 結果與分析

2.1 球毛殼菌發酵濾液的活性

由圖1-A可知，球毛殼菌發酵濾液在4 ℃條件下貯藏15 d、30 d和45 d后，其對共生菌 A.areolatum的抑制活性并未隨貯藏時間的延長而抑制率下降。即在45 d內，球毛殼菌發酵濾液均具有較高的抑菌活性。

球毛殼菌發酵濾液在經過15 min、30 min和45 min的紫外線照射后，其抑菌活性并未出現明顯的改變（圖1-B）。在60 ℃條件下水浴處理 15 min、30 min和45 min后不會影響球毛殼菌發酵濾液的抑菌活性（圖1-C）。在100 ℃條件下水浴處理15 min不會影響發酵濾液活性；水浴 30 min和45 min后共生真菌A.areolatum菌絲僅有少量生長，但與15 min相比差異不顯著（圖1-D）。

2.2 內生真菌發酵濾液代謝組學檢測結果

2.2.1 內生真菌發酵濾液的總離子流比較

總離子流圖（TIC）以時間點為橫坐標，每個時間點質譜中所有離子總強度為縱坐標，每種顏色代表一個樣本。由圖2可知，混合TIC圖重疊性高，即保留時間和峰值均一致，說明試驗儀器是穩定的，本試驗檢測的系統誤差在可控范圍內。

2.2.2 整體主成分分析以及系統穩定性

球毛殼菌和大伏革菌樣本間分布區別明顯，離散程度較小，并且質控樣本聚集在一起（圖3-A），表明整個分析系統穩定性良好，試驗結果可靠性高。球毛殼菌和大伏革菌的主成分分析（PCA）表明，2種內生真菌樣本間的重復性較好，代謝物存在顯著差異（圖3-B）。

通過偏最小二乘判別分析（PLS-DA）表明（圖4-A），不同內生真菌組合模型參數中對矩陣解釋率R²為0.999，模型的預測能力Q²為 0.995，模型的解釋率R²和預測率Q²均大于 0.5，符合對試驗數據模型的預期，說明本研究所建立的PLS-DA模型可以很好的解釋球毛殼菌和大伏革菌的代謝產物的差異。PLS-DA模型的置換驗證（如圖4-B）所示，模型中的Q²從右向左依次降低，說明模型具有較好的預測能力并且有效可用，能夠用于球毛殼菌和大伏革菌發酵濾液代謝物的差異分析。

2.2.3 球毛殼菌的抗真菌差異代謝產物篩選

PLS-DA模型中VIP值（VIP≥1）與q值（P值校正后的結果，可統計差異的顯著性）（q≤0.05）和FC（變化倍數Fold change）（FC≥2.0或FC≤ 0.5）綜合分析確定標志性差異代謝產物。共篩選得到球毛殼菌的差異代謝產物213種，其中15種差異代謝產物對真菌有抑制作用。由表1可知，這些差異代謝物主要是由有機酸、黃酮類、酚類、有機雜環化合物、生物堿組成，包括異阿魏酸、香草酸、大麻二酚、甘氨酸、大黃素、丹皮酚等。

2.2.4 差異代謝物通路分析

球毛殼菌發酵濾液差異代謝產物共富集得到59條差異代謝通路，篩選到的15種含抑菌作用的化合物可檢測到5條代謝通路，這些代謝通路主要涉及不同環境下的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）、次生代謝產物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、雙組分系統（Two-component system）（表2）。

將q值≤0.05的差異代謝通路繪制成氣泡圖（圖5）可知，共8條差異代謝通路，分別是ABC轉運蛋白（ABC transporters）、檸檬酸循環（TCA循環） Citrate cycle（TCA cycle）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成（Valine，leucine and isoleucine biosynthesis）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、氨基苯甲酸鹽降解（Aminobenzoate degradation）、丁酸代謝（Butanoate metabolism）和C₅支鏈二元酸代謝（C₅-Branched dibasic acid metabolism）。

差異代謝物聚類分析可知（圖6），球毛殼菌與大伏革菌發酵產物的不同生物重復之間聚類效果顯著，明顯劃分成4個區域冷暖色差，聚集的主要幾類代謝物上調和下調變化規律與菌種緊密相關。這說明相比于大伏革菌代謝產物，球毛殼菌代謝產物的變化明顯。2種內生真菌樣本組內差異不顯著這與差異倍數值篩選出的結果一致（表1）。

3 討" 論

松樹蜂作為一種典型的蟲菌共生類蛀干害蟲，其共生真菌A.areolatum的生長會受到包括寄主內生真菌在內的諸多外界微生物干擾。以往對于蟲菌共生類害蟲的防治主要集中于害蟲本身^[15]，若通過抑制共生菌生長從而影響害蟲的正常生長發育，則可同樣達到防治害蟲的目的。

前人研究認為C.globosum是一種高效的生防真菌，其產生的差異代謝物質和一些酶類能夠抑制病原菌菌絲生長^[16]。此外，C.globosum產生的真菌毒素和一些揮發性有機物也能抑制真菌孢子萌發^[17]。本研究發現，C.globosum作為松樹蜂寄主樟子松的優勢內生真菌，其發酵濾液可完全抑制A.areolatum的菌絲生長，且抑菌活性不受儲存時間、紫外線和高溫的影響。秦建春等^[18]研究發現銀杏的內生真菌C.globosum發酵濾液可完全抑制小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）的菌絲生長和孢子萌發。趙連仲^[19]研究認為，從土壤中分離的球毛殼菌對小麥赤霉病菌（F.graminearum）、黃瓜褐斑病菌（Corynespora cassiicola）和蘋果斑點落葉病菌（Alternaria mali）等植物病原真菌均有較好的抗菌活性。這與本研究結果相似，說明球毛殼菌具有一定生防潛力，是挖掘抗菌活性物質的重要資源。

球毛殼菌能產生多種活性代謝產物，如具有細胞毒活性的Globosumones和Chaetopyranins類化合物 ^[20-22]，以及具有抑菌活性的Chaetoglobosins和Chaetomugilins類化合物等^[12，23]。本試驗采用LC-MS分析平臺對球毛殼菌代謝產物進行篩選發現，共有抗真菌作用的差異代謝產物15種，主要包括在有機酸、黃酮類、酚類、有機雜環化合物和生物堿5類化合物中。有機酸能夠抑制多種霉菌、細菌和酵母，具有廣譜性^[24]。本試驗篩選到的有機酸類代謝產物包括異阿魏酸、香草酸、甘氨酸、4-胍基丁酸等，前人研究表明，這些物質均具有抑菌作用^[25-33]。黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產物，其抑菌范圍較廣^[34]。本試驗中篩選得到的大黃素對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白喉桿菌（Corynebacterium diphtheriae）、炭疽桿菌（Bacillus anthracis）等均具有較強的抑制效果^[35]。球毛殼菌差異代謝產物中的酚類化合物有丹皮酚和大麻二酚。研究表明丹皮酚是常見的植物次生代謝產物，表現出廣譜的抗菌活性^[36]。大麻二酚具有廣泛的生物活性，如抗氧化^[37]、抑菌等^[38]。有機雜環化合物苯并呋喃具有良好的生理活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗自由基、抗氧化作用等^[39]。此外，生物堿類化合物龍葵素和二甲喹唑啉C均有抗菌作用^[40]。例如：龍葵素對真菌、細菌等病原微生物有一定的抑制和毒害作用，尤其是對馬鈴薯抗早疫病、晚疫病病菌的抑制效果明顯^[41]。本試驗主要是通過代謝組學技術檢測到了球毛殼菌中潛在的抑菌物質，初步揭示了球毛殼菌發酵濾液對松樹蜂共生真菌的抑制作用。然而，目前筆者僅通過LC-MS篩選出了球毛殼菌的抑菌差異代謝產物，對于各種差異代謝物的具體功能及其參與的代謝途徑尚未明確，需更進一步分析和探討。后續試驗通過選取差異倍數較大的組分進行分析，并檢測其活性，以期精準防控松樹蜂的危害。

4 結" 論

綜上所述，樟子松內生真菌球毛殼菌的發酵濾液可以完全抑制松樹蜂共生真菌A.areolatum的生長，且該菌發酵濾液的抑菌活性穩定。通過研究內生真菌發酵濾液差異代謝產物發現，共篩選到213種差異代謝產物，59條差異代謝通路，其中潛在的抑菌物質有5類15種，對應5條代謝通路，抑菌活性物質包括異阿魏酸、香草酸、大麻二酚、甘氨酸、大黃素、丹皮酚、4-胍基丁酸、隱綠原酸、苯并呋喃、4-羥基苯甲酸、綠原酸、琥珀酸、4-甲氧基肉桂酸、龍葵素、二甲喹唑啉C。本研究結果表明球毛殼菌發酵濾液代謝產物含有較多具抑菌作用的化學物質，這可能是球毛殼菌發酵濾液可以完全抑制松樹蜂共生真菌菌絲生長的原因，有望成為松樹蜂共生真菌的高效抑制劑。

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Antibacterial Activity of Fermentation Filtrate from Chaetomium"globosum" against Symbiotic Fungi of Sirex" noctilio

WANG Xuan¹，CUI Shupeng¹，WANG Gaijin¹，YANG Zongji¹，SHANG Suqin¹，LUO Youqing²，FAN Longfei¹ and WANG Lixiang¹

（1.College of Plant Protection，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China; 2.Beijing Key Laboratory for Forest Pest Control，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Abstract To" investigate the inhibitory effect of the fermentation filtrate of the endophytic fungus Chaetomium globosum isolated from Pinus sylvestris var.mongolica on symbiotic fungus Amylostereum areolatum of the significant invasive pest Sirex noctilio， and to screen differential metabolites with high inhibitory capacity，aiming at effectively controlling S.noctilio. The antibacterial activity of C.globosum fermentation filtrate was determined first，and then，potentially antibacterial substances were screened using a metabolomics approach.The results showed that the fermentation filtrate of" C.globosum completely inhibited the mycelial growth of A.areolatum，the symbiotic fungus of" S.noctilio，with stable antibacterial activity unaffected by storage time，ultraviolet rays and temperature.A total of 213 metabolites were screened out in C.globosum fermentation filtrate，including 15 potentially antibacterial substances namely isoferulic acid，vanillic acid，cannabipiperidiethanone，glycitein，emodin，paeonol，4-guanidinobutanoic acid，cryptochlorogenic acid，benzofuran，3-caffeoylquinic acid，4-hydroxybenzoic acid，chlorogenic acid，succinic acid，4-methoxycinnamic acid，solasodine and dictyoquinazol C.KEGG enrichment analysis of differential metabolites showed significant enrichment in pathways including" ABC" transporters，citrate cycle （TCA cycle），valine，leucine and isoleucine biosynthesis，tyrosine metabolism，phenylalanine metabolism，aminobenzoate degradation，butanoate metabolism and C₅-branched dibasic acid metabolism.

Studies have shown that the fermentation solution of C.globosum inhibits the mycelial growth of the symbiotic fungus A.areolatum of S.noctilios，with stable inhibition activity，and the potential inhibition substances can be screened.

Key words Sirex noctilio; Chaetomium globosum;Symbiotic fungi; Metabolomics; Differential metabolites

Received" 2023-04-19""" Returned 2023-08-21

Foundation item The National Natural Science Foundation of China （No.32160379）; The Natural Science Foundation of Gansu Province （No.20JR10R526）; The Fuxi Young Talents Training Program Gansu Agricultural University （No.Gaufx-04Y08）.

First author WANG Xuan，female，master" student.Research area：integrated control of wood-boring pests in forest trees .E-mail：wangxuan3639@163.com

Corresponding"" author WANG" Lixiang，male，associate professor.Research area：monitoring and control of wood-boring pests and invasive forestry organisms.E-mail：wanglx@gsau.edu.cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

基金項目：國家自然科學基金（32160379）；甘肅省自然基金（20JR10R526）；甘肅農業大學伏羲人才專項（Gaufx-04Y08）。

第一作者：王 萱，女，碩士研究生，研究方向為林木蛀干害蟲綜合防控。Email：wangxuan3639@163.com

通信作者：王立祥，男，副教授，研究方向為林木蛀干害蟲和林業入侵生物的監測與防控。E-mail：wanglx@gsau.edu.cn